Annales de Toxicologie Analytique, vol.

xvn, n 3, supplment 1, 2005

Aide la validation des mthodes en Toxicologie
et Suivi Thrapeutique Pharmacologique
Help for validation of analytical procedures in
Toxicology and Therapeutic Drug Monitoring
Groupe de travail "Accrditation" de la Socit Franaise de Toxicologie Analytique
Coordonnateur: Anne GRUSON, Laboratoire de Biochimie-Toxicologie, Centre Hospitalier,
57, avenue Winston Churchill- 62022 ARRAS Cedex - Tl: 03 21 211085 - E-mail: anne.gruson@ch-arras.fr
Membres du groupe de travail: Bernard DINGEON, Marie-Franoise DREYFUSS, Yvan GAILLARD, Anne LE BOUIL,
Michel LHERMITTE, Stphanie MAZZEGA, Mustapha MOULSMA, Gilbert PPIN, Martine PERRIN, Jocelyne
PLESSE, Olivier ROUSSEL, Marie-Thrse THEVENGr, lisabeth VINNER, Marc DEVEAUX (membre associ)
(Accept pour publication le 31 octobre 2005)
SOMMAIRE
1. Introduction
IT. tat des lieux - Contexte rglementaire et normatif
m. Quelles sont les informations pertinentes connatre ?
IV. Choix pralable la vrification des critres de performance et limites d'acceptabilit de la mthode,
des vrifications exprimentales, des vrifications bibliographiques
V. Vrification d'une mthode d'analyse quantitative - Contenu du dossier
V.1 Vrification initiale d'une mthode quantitative
V.2 Confirmation des performances en routine
VI: Vrification d'une mthode d'analyse qualitative - Contenu du dossier
VI. 1 Vrification initiale d'une mthode qualitative
VI. 2 Confirmation des performances en routine
VIT. Vrification d'une mthode d'analyse assimilable au quantitatif rsultat qualitatif - contenu du dossier
VII. 1 Vrification initiale d'une mthode assimilable au quantitatif
VII. 2 Confirmation des performances en routine
vm. Matrise de la documentation - Mthodologie
IX. Exemples mthodologiques
IX.1 Fidlit
IX.2 Justesse (biais)
IX.3 Contamination
IX.4 Limite de dtection et limite de quantification
IX.5 Linarit
IX.6 Stabilit
IX.7 Corrlation de mthodes
X. Terminologie - Autres dfinitions
XI. Bibliographie
1
Annales de Toxicologie Analytique, vol. xvn, n 3, supplment 1, 2005
1. Introduction
Ce document a pour but d'expliciter ce qui est entendu par les aspects de "validation de mthode" dans le cadre pr-
cis des laboratoires engags ou souhaitant s'engager dans une dmarche de qualit dans le domaine des analyses en
Toxicologie et Suivi Thrapeutique Pharmacologique, et notamment dans une dmarche d'accrditation COFRAC
selon le programme 168. Dans ce domaine, la problmatique de la "validation" repose sur le fait que les mthodes
d'analyses ne sont pas issues de normes publies. Cette "validation" s'inscrit alors dans une vrification des perfor-
mances annonces par le fabricant ou souhaites par le laboratoire, lors de la mise en application des mthodes
d'analyses dans son laboratoire. Ceci afin de lui apporter confirmation et preuve de la validit des rsultats rendus
(phase de "qualification"), par rapport ses propres besoins. Cette validation est prendre en terme de matrise du
processus analytique, au niveau initial.
La validation d'une mthode devra s'envisager en fonction des diffrents contextes auxquels sera confront le bio-
logiste ou le responsable technique. "La validation est toujours un quilibre entre les cots, les risques et les possi-
bilits techniques" (extrait de l'ISO/CEl 17025, 5.4.5.3 note 3, et NF EN ISO 15189), et le temps. On entend par
validation, ''[ ... ] la confirmation par examen et apport de preuves objectives du fait-que les prescriptions particulires
en vue d'une utilisation dtermine sont remplies." (extrait de l'ISO/CEl 17025, 5.4.5.1).
Au pralable, le biologiste ou le responsable technique devra lire attentivement le dossier des fournisseurs (notices,
fiches techniques, rfrences bibliographiques, ... ). Il devra valuer et apprcier ces informations la lueur de
recommandations ou de textes rglementaires, des critres de performance proposs par des socits savantes, des
attentes du prescripteur ou du requrant.
Dans un deuxime temps la validation sera effectue. Le champ et la profondeur de cette valuation dpendront des
circonstances et de chaque cas particulier. Cette validation devra tre initiale, puis se continuer dans le temps (chan-
gement de lots de ractifs [si effet de lot connu], extensions analytiques, maintenance lourde, ... ). Dans certains cas
cette validation sera une confirmation des performances d'une mthode dj en cours d'utilisation.
Les critres fondamentaux de l'valuation de la mthode (exemple dossier de marquage CE) sont en principe dter-
mins par le fabricant. Si les coffrets ractifs et systmes sont utiliss strictement dans les conditions prconises
par le fabricant, les mthodes qui y font appel sont prises en compte comme des mthodes normalises. Dans ce cas,
le laboratoire doit uniquement valider (vrifier) la mise en application dans son environnement propre par rapport
des critres et des limites acceptables (spcifications) qu'il s'est fix, pour correspondre aux besoins de ses clients.
Il n'est en effet pas demand aux laboratoires d'effectuer de nouveau l'valuation des mthodes ou des automates,
tudes qui ont dj t ralises par le fournisseur ou le fabricant, qui eux ne connaissent pas ces besoins.
Notel: De la dfinition de la validation dcoule la mthodologie de la conduite d'un processus de validation. "Les
prescriptions particulires" identifient les caractristiques, par exemple les spcifications pralablement dfinies sur
certains critres galement choisis, conditions qui doivent tre remplies pour dclarer la mthode valide.
Note 2 : Ce document a t labor partir du guide de validation des mthodes en biologie mdicale: document
LAB GTA 04 (juin 2(04).
"
II. Etat des lieux - Contexte rglementaire et normatif
Ce guide sert tablir un protocole d'valuation des mthodes utilises dans un laboratoire. Cette valuation per-
met de constituer le dossier de validation des mthodes utilises dans le laboratoire.
Cette validation est une exigence de la norme NF EN ISO/CEl 17025 dans son paragraphe 5.4 traitant des
"Mthodes d'essai et d'talonnage et validation des mthodes", et plus prcisment au 5.4.5 Validation des
mthodes, qui est dfinie au 5.4.5.1 : "La validation est la confirmation par examen et l'apport de preuves objec-
tives du fait que les prescriptions particulires en vue d'une utilisation prvue dtermine sont remplies."
Le paragraphe 5.4.2 indique que: "Lorsque le client ne spcifie pas la mthode utiliser, le laboratoire doit slec-
tionner des mthodes appropries qui ont t publies dans des normes internationales, rgionales ou nationales,
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Annales de Toxicologie Analytique, vol. XVII, nO 3, supplment 1, 2005
par des organisations techniques de renom ou dans des textes ou revues scientifiques spcialiss, ou spcifies par
le fabricant de l'quipement. Des mthodes dveloppes par le laboratoire ou des mthodes adoptes par le labo-
ratoire peuvent galement tre employes si elles conviennent l'usage prvu et qu'elles ont t valides. Le client
doit tre inform de la mthode choisie. Le laboratoire doit confirmer qu'il peut correctement appliquer des
mthodes normalises avant de les mettre en uvre pour des essais ou des talonnages. En cas de changement de
la mthode normalise, la confirmation doit tre rpte."
Cette exigence figure dans le Guide de Bonnes Excutions des Analyses de Biologie Mdicale (Arrt du 26
novembre1999 relatif la bonne excution des analyses de biologie mdicales) : Dfinition des termes Evaluation
( 2.6), Qualification ( 2.11), Transfrabilit ( 2.13), Valeurs de rfrence (2.14), Validation ( 2.15) ; dans le
l.lc concernant les installations, l'quipement, l'instrumentation, les produits fongibles et les ractifs " ... s'assurer
que les installations, l'quipement et l'instrumentation du laboratoire sont fonctionnels. "
Dans la nouvelle norme ISO 15189, la validation est retrouve au niveau du 5.3.2, 5.3.4 et son point. h) mais
surtout dans le paragraphe 5.5.1 : "Le laboratoire doit utiliser des procdures analytiques, incluant celle de slec-
tion et d'aliquotage d'chantillons, qui correspondent aux besoins des utilisateurs des prestations de laboratoire et
qui conviennent chaque type d'analyse. Les procdures analytiques conseilles sont celles qui ont t publies
dans des manuels bien tablis et faisant autorit, dans des textes et des journaux revus par des experts ou des recom-
mandations rgionales, nationales ou internationales. Si des procdures internes sont utilises, elles doivent tre
valides de manire approprie pour l'utilisation prvue et parfaitement documentes.", et le paragraphe 5.5.2 :
"Le laboratoire doit utiliser uniquement des procdures valides pour s'assurer qu'elles conviennent l'utilisation
prvue. Les validations doivent tre aussi approfondies que ncessaires pour rpondre aux besoins de l'application
ou du domaine d'application concern(e). Le laboratoire doit enregistrer les rsultats obtenus et la procdure uti-
lise pour la validation.
Les mthodes et les procdures slectionnes doivent tre values et donner des rsultats satisfaisants avant d'tre
utilises pour les analyses mdicales. Une revue des procdures par le directeur du laboratoire ou une personne
dsigne doit tre ralise l'origine intervalles dfinis. Ces revues sont gnralement effectues une fois par an.
Ces revues doivent tre documentes." Le paragraphe suivant ( 5.5.3) dveloppe cet aspect de validation en prci-
sant "[ ... ] Les performances et l'aptitude l'emploi prvu de chaque nouvelle version des trousses de ractifs prts
l'emploi prsentant des modifications importantes en termes de ractifs ou de procdure doivent tre vrifies.
Tout changement de la procdure doit tre dat et faire l'objet d'une autorisation comme pour les autres proc-
dures."
Le paragraphe 5.3.2 quant lui indique que "Il doit tre dmontr (lors de l'installation et au cours de l'utilisation
courante) que le matriel est capable d'atteindre les performances requises et qu'il est conforme aux spcifications
se rapportant aux analyses.
La direction du laboratoire doit laborer un programme de surveillance rgulire permettant de dmontrer l'ad-
quation de l'talonnage et du fonctionnement des instruments, des ractifs, et des systmes analytiques. Elle doit
galement instaurer un programme de maintenance prventive document et enregistr [ ... ] respectant, au mini-
mum, les recommandations dufabricant."
Note: Cette nouvelle norme ISO 15189 se situe dans le prolongement des travaux mens par EC4 (European
, Communities Confederation of Clinical Chemistry) publis dans l'article : Essential Criteria for Quality Systems of
Medical Laboratories (Eur J Clin Chem Clin Biochem 1997 ; 35(2) : 123-132 1997 by Walter de Gruyter Berlin
New York). Cet article est consultable partir du site: http://www.uni-oldenburg.de/ec4/ec4qua1.htm#ECText.
Outre la comptence du biologiste ou du responsable technique, l'utilisation et la gestion correcte des Contrles de
Qualit (CQI, CQE), la validation permet d'assurer la qualit de la prestation d'analyse et du rsultat. Cette valida-
tion sera mise profit pour estimer les incertitudes des mesures du laboratoire, notion prsente dans le GBEA : "
4. Expression des rsultats et comptes rendus d'analyses, 4.1. Expression des rsultats: L'expression des rsultats
doit tre prcise et sans quivoque. Les valeurs de rfrence doivent tre indiques. La mthode d'analyse et/ou les
ractifs utilis( e)( s) doivent tre mentionn( e)( s) chaque fois qu'ils peuvent influer sur l'expression du rsultat ainsi
que lorsque la rglementation l'exige. Pour les rsultats quantitatifs, le cas chant, les performances analytiques
de la mthode peuvent tre indiques. Les units du systme international (SI) doivent tre utilises quand elles
existent."
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Cette estimation de l'incertitude de mesure se retrouve dans la norme ISO/CEl 17025 au 5.4.6 "Estimation de l'in-
certitude de mesure", avec au 5.4.6.2 "Les laboratoires d'essais doivent aussi possder et appliquer des proc-
dures pour estimer l'incertitude de mesure. Dans certains cas, la nature de la mthode d'essai exclut un calcul
rigoureux, mtrologiquement et statistiquement valable, de l'incertitude de mesure. Dans de tels cas, le laboratoire
doit au moins tenter d'identifier toutes les composantes de l'incertitude etfaire une estimation raisonnable, tout en
assurant que la manire d'en rendre compte ne donne pas une impression errone de l'incertitude. Une estimation
raisonnable doit se baser sur une connaissance de la performance de la mthode et sur le domaine de la mesure et
faire appel, par exemple, l'exprience acquise et aux donnes de validation antrieures."
Cette approche des incertitudes est aussi une exigence de la nouvelle norme ISO 15189. Dans le paragraphe traitant
de la validation, 5.5.3, son point h) indique "les sources potentielles de variation des rsultats." En outre, dans le
5.6.2, il est indiqu: "Le laboratoire doit dterminer l'incertitude des rsultats, dans le cas o cela est pertinent
et possible. Toutes les composantes importantes de l'incertitude doivent tre prises en compte. Les sources contri-
buant l'incertitude peuvent inclure l'chantillonnage, la prparation des chantillons, la slection des aliquotes
d'chantillon, les calibrateurs, les matriaux de rfrence, les grandeurs d'entre, l'quipement utilis, les condi-
tions exprimentales, l'tat de l'chantillon et les changements de manipulateurs."
Le biologiste, ou le responsable technique, doit pouvoir mettre disposition du demandeur d'analyses, en cas de
besoin, une approche de l'valuation des incertitudes de mesure.
III. Quelles sont les informations pertinentes connatre ?
D'une manire gnrale, une mthode d'analyse prsente plusieurs caractristiques essentielles que le laboratoire se
doit de connatre. La connaissance de ces paramtres peut tre acquise par la bibliographie et/ou par l'exprimenta-
tion sur site.
Schmatiquement, on distinguera trois types de mthodes d'analyse que l'on sera amen traiter diffremment:
1. Les analyses de type quantitatif vrai:
Elles fournissent un rsultat chiffr, sur une chelle continue dont les limites basses et hautes sont connues, en rela-
tion directe avec une quantit ou une activit donne de l'analyte mesurer.
Ex : Dosage de mdicaments dans le cadre du Suivi Thrapeutique Pharmacologique et dosage d'autres xnobio-
tiques en Toxicologie. Analyses ralises par mthodes immunologiques et/ou chromatographiques.
2. Les analyses de type qualitatif:
Le rsultat de ce type d'analyse n'apporte pas d'information sur la quantit de l'analyte, mais seulement sur sa pr-
sence ou sa non dtection (positif ou non dtect).
Ex : Dpistage de xnobiotiques par mthodes chromatographiques. Les pics des chromatogrammes obtenus sont
identifis par les temps de rtention et par les spectres UV et/ou de masse. Ils peuvent tre compars une biblio-
thque prdfinie de spectres.
3. Les analyses assimilables des analyses quantitatives :
Dans ce cadre seront regroupes des analyses fournissant un rsultat de type qualitatif, extrapol partir de la mesu-
re d'une donne quantifiable (Absorbance par exemple) avec un effet de seuil.
Ex : En Toxicologie, dtermination d'une classe de molcules mdicamenteuses (benzodiazpines, antidpresseurs
tricycliques ... ), ou de substances illicites (amphtamines, opiacs, cannabinodes, cocaniques ... ) avec des seuils pr-
dfinis. En Suivi Thrapeutique Pharmacologique (observance du traitement), mesure d'une molcule cible (mtha-
done, buprnorphine ... ). Les analyses sont ralises selon le principe d'immunocomptition (EMIT, ELISA,
CEDIA. .. ).
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Selon l'appartenance de la mthode un de ces trois types d'analyse ainsi dfinis, les informations pertinentes
connatre sont exposes dans le tableau ci-dessous:
Mthode quantitative MthQde qualitative" Mthode 3.'ilSimilable au quantitatif
Spcificit Spcificit Spcificit
Fidlit NA Fidlit
Justesse (approche de la) NA NA
Domaine d'analyse NA NA
Limite de dtection
Limite de dtection Limite de dtection
Limite de quantification
Linarit NA NA
Contamination entre chantillons Contamination entre chantillons Contamination entre chantillons
(s'il y a lieu) (s'il y a lieu) (s'il y a lieu)
Stabilit Stabilit Stabilit
Robustesse Robustesse Robustesse
Valeurs de rfrence NA NA
"ex-valeurs normales"
Interfrences Interfrences Interfrences
Corrlation avec mthode de rfrence ** Corrlation avec mthode de rfrence ** Corrlation avec mthode de rfrence **
Corrlation avec mthode dj Coorrlation avec mthode dj Coorrlation avec mthode dj
utilise au laboratoire ** utilise au laboratoire ** utilise au laboratoire **
(* NA : Non applicable) ** Chaque fois que cela est ncessaire
Note: Les paramtres de fidlit (rptabilit, fidlit intermdiaire et/ou de reproductibilit) d'une part, et de jus-
tesse d'autre part, constituent les composantes de l'incertitude de mesure, dans le calcul d'incertitude globale selon
l'approche ISO 5725, en tant que composantes de type A. Associe aux composantes d'talonnage le cas chant et
aux composantes de type B, J'incertitude globale peut alors tre dtermine (voir chapitre IX. Exemples mthodo-
logiques).
IV. Choix pralable la vrification des critres de
mthode,
vrifications
performance et limites d'acceptabilit de la
des vrifications exprimentales, des
bibliographiques
A ce stade, il est fondamental de souligner que :
Le choix des critres de performance (paramtres) et limites d'acceptabilit (spcifications, seuils) associs d'une
, mthode doit se faire pralablement l'tude de validation.
Ce choix est du ressort du biologiste ou du responsable technique.
Ce choix doit reflter l'tat de l'art et la pertinence toxicologique et clinique. Il pourra s'appuyer sur des recom-
mandations de socits savantes ou de groupes de travail, ou issues de confrences de consensus, sur des publica-
tions scientifiques, sur des rsultats de campagne de comparaisons interlaboratoires, etc ...
Les limites d'acceptabilit ainsi choisies doivent tre adaptes et notifies pour chacun des niveaux, pour chacun
des analytes et pour chacune des matrices qui seront contrls dans l'tude.
Ces limites d'acceptabilit peuvent reposer sur diffrentes approches: l'intervalle des valeurs de rfrence (prise en
compte de la variation biologique inter individuelle et de la variation analytique), les variations inter-individuelles
et l'opinion des cliniciens et/ou des mdecins lgistes et l'tat de l'art.
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Annales de Toxicologie Analytique, vol. xvn, n 3, supplment 1, 2005
V. Vrification d'une mthode d'analyse quantitative -
Contenu du dossier
La vrification d'une mthode comprend une phase initiale, avant sa mise en uvre effective en routine, et une phase
de vrification continue et de confirmation des performances dans le cadre du fonctionnement normal et quotidien
du laboratoire.
V.l Vrification initiale d'une mthode quantitative
Dans ce cadre, le dossier devra apporter les lments de vrification suivants, par recherche bibliographique et/ou
par vrification sur site :
A VRIFIER ET/OU NNNtrnm
_ ... ' . ' ,'
sur

Spcificit Oui Non
Fidlit Oui Oui
Justesse (approche de la) Oui Si possible
Domaine d'analyse Oui Si besoin
Limite de dtection
Oui Si besoin
Limite de quantification
Linarit Oui Si besoin
Contamination entre chantillons (s'il y a lieu) Oui Oui pour les paramtres
sensibles
Stabilit Oui Si besoin
Robustesse Oui Non
Interfrences Oui Si besoin
Valeurs de rfrence "ex-valeurs normales" Oui Non
Corrlation avec mthode de rfrence Oui Non
Corrlation avec mthode dj utilise au laboratoire Si existe Si besoin
Le dossier doit conclure sur l'avis d'aptitude ou d'inaptitude de la mthode ou du systme analytique.
Certains de ces lments peuvent ventuellement tre vrifis au dbut de la mise en uvre en routine de la mtho-
de (la fidlit intermdiaire notamment).
Le dossier de vrification peut renvoyer d'autres documents (bibliographie, notices fournisseurs, documents
internes au laboratoire, etc.), correctement identifis et accessibles.
V.2 Confirmation des performances en routine
Pour matriser pleinement une mthode, l'utilisation, la gestion et le suivi de contrles de qualit internes (CQI) et
externes (CQE) si disponibles, sont indispensables.
Leur exploitation statistique permet de vrifier et de confirmer les lments suivants :
Fidlit,
Justesse, ou du moins en faire une approche en l'absence de matriau de rfrence,
Vrification (et adaptation ventuelle) des valeurs de rfrences de la mthode pour la population du laboratoire.
VI. Vrification d'une mthode d'analyse qualitative -
Contenu du dossier
VI.I Vrification initiale d'une mthode qualitative
Il sera souvent trs difficile pour les laboratoires d'obtenir des chantillons positifs (ou dpourvus d'analyte) en
nombre suffisant pour vrifier la spcificit et la limite de dtection d'une mthode. En raison d'un recrutement for-
cment insuffisant, cela ne sera possible que dans les laboratoires importants.
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Annales de Toxicologie Analytique, vol. XVII, n 3, supplment 1, 2005
La vrification bibliographique critique prendra donc ici toute son importance. Inversement, la vrification expri-
mentale sur site sera plus rduite, et s'appuiera fortement sur l'tude des performances des Contrles de Qualit
Externes (CQE) si disponibles.
Dans ce cadre, le dossier pourra apporter les lments de vrifications suivants :
PARAMTRES A VRIFIER ET/OU CONNAmE Billiographie Vriftcat;iOltSilr site
-
Spcificit Oui Non
Limite de dtection Oui Non
Contamination entre chantillons (s'il y a lieu) Oui Oui
Stabilit Oui Si besoin
Robustesse Oui Non
Corrlation avec mthode de rfrence Oui Non
Corrlation avec mthode dj utilise au laboratoire Si existe Si besoin
Le dossier doit conclure sur l'avis d'aptitude ou d'inaptitude de la mthode ou du systme analytique.
Le dossier de vrification peut renvoyer d'autres documents (bibliographie, notices fournisseurs, documents
internes au laboratoire, etc.), correctement identifis et accessibles.
Note propos de l'tude de contamination:
* Cette tude de contamination inter-chantillons est mener pour tous les systmes analytiques.
* Cette tude sera rpter au moindre doute quant au fonctionnement correct du systme analytique, et en parti-
culier du systme de lavage et/ou de dcontamination.
VI.2 Confirmation des performances en routine
Pour matriser pleinement une mthode, l aussi, l'utilisation, la gestion et le suivi de contrles de qualit internes
(CQI) et externes (CQE) si disponibles sont indispensables.
La surveillance de la spcificit et de la limite de dtection passe par l'tude des CQI et CQE, si disponibles (per-
formances du laboratoire, comparaison avec les autres mthodes).
VII. Vrification d'une mthode d'analyse assimilable au
quantitatif resultat qualitatif - Contenu du dossier
Ce cas de figure est trs proche de celui des mthodes purement qualitatives, mais certaines caractristiques sup-
plmentaires peuvent tre vrifies sur site.
VU.1 Vrification initiale d'une mthode assimilable au quantitatif
S'agissant de mthodes fournissant un rsultat final de type qualitatif, les laboratoires se heurteront la mme dif-
.. ficult pour obtenir des chantillons positifs (ou dpourvus d'analyte) en nombre suffisant pour vrifier la spcifici-
t et la limite de dtection.
La vrification bibliographique critique prendra donc ici toute son importance. Le fabricant devra fournir ces l-
ments en s'appuyant sur des tudes menes par des experts indpendants. Inversement, la vrification exprimenta-
le sur site sera plus rduite que pour une mthode quantitative, mais elle permettra nanmoins de vrifier certains
lments.
7
,
i
Il
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Dans ce cadre, le dossier pourra apporter les lments de vrifications suivants :
PARAMTREs A VRIFIER ET/OU CONNMTRE Bibliographie Vrification Sl!l" site
Spcificit Oui Non
Fidlit Oui Oui
Limite de dtection Oui NA
Contamination entre chantillons (s'il y a lieu) Oui Oui
Stabilit Oui Si besoin
Robustesse Oui Non
Interfrences Oui NA
Corrlation avec mthode de rfrence Oui Non
Corrlation avec mthode dj utilise au laboratoire Si existe Si besoin
Le dossier doit conclure sur l'avis d'aptitude ou d'inaptitude de la mthode ou du systme analytique.
(*NA : Non Applicable)
Le dossier de vrification peut renvoyer d'autres documents (bibliographie, notices fournisseurs, documents
internes au laboratoire, etc.), correctement identifis et accessibles.
Note propos de l'tude de contamination:
* Cette tude de contamination inter-chantillons est mener pour tous les systmes analytiques.
* Cette tude sera rpter au moindre doute quant au fonctionnement correct du systme analytique, et en parti-
culier du systme de lavage et/ou de dcontamination.
VII.2 Confirmation des performances en routine
La surveillance de la spcificit et de la limite de dtection passe :
* Par la comparaison avec les rsultats obtenus par d'autres mthodes complmentaires ou par des mthodes de rf-
rence mises en uvre pour vrifier un premier rsultat,
* Par l'tude des CQE, si disponibles (performances du laboratoire, comparaison avec les autres mthodes).
La fidlit devra tre galement rgulirement vrifie, surtout pour les valeurs proches du seuil dcisionnel
("eut-off').
VIII. Matrise de la documentation - Mthodologie
Cette partie du guide est importante car si beaucoup d'informations et rsultats sont collects, ceux-ci doivent faire
l'objet d'un document cohrent et clair, avec une acceptation formelle par le laboratoire de la validit oprationnel-
le de ses techniques, c'est--dire une dcision ou dclaration quant la validation de la mthode. Le laboratoire
pourra prsenter ses dossiers suivant le schma suivant, qui pourra tre celui de sa procdure (cf. document
COFRAC N 1133) ou de sa mthodologie:
* Prsentation de la mthode, de l'appareillage et du mode opratoire. But de la vrification/validation. Domaine
d'application,
* Dtermination des critres de performances (paramtres) vrifier (cf. chapitres IV, V, VI et VI!),
* Dtermination des spcifications ou limites acceptables (objectifs atteindre) de ces critres remplir (cf. cha-
pitre IV),
* Vrification bibliographique,
* Mise en uvre - Exprimentations (cf. chapitre Vill),
* Compilation et traitement statistique des donnes obtenues,
* Conclusion et dcision quant la validation oprationnelle de la mthode, au regard des spcifications (limites
acceptables) initialement fixes.
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IX. Exemples mthodologiques
Ce paragraphe dcrit des principes mthodologiques ou des recommandations permettant de vrifier les paramtres
essentiels d'une mthode:
* Fidlit,
* Justesse,
* Contamination inter-chantillons,
* Limite de dtection, limite de quantification,
* Linarit,
* Stabilit,
* Corrlation de mthodes,
* Vrification des valeurs de rfrence, ...
Les laboratoires pourront s'en inspirer. D'autres dmarches pourront tre possibles, elles devront tre justifies.
Remarque : Ce dossier peut dans certains cas tre constitu au fil du travail du laboratoire. Dans ce cas la priode
doit tre la plus courte possible, le rappel ventuel de rsultats de patient devra tre document. Il est souhaitable de
prvoir une srothque particulire ces essais afin de pouvoir assurer un raccordement entre deux mthodes suc-
cessives. En cas de modification de mthode ou d'un couple analyseur/mthode il est souhaitable, dans la mesure
du possible, de pouvoir disposer simultanment de la nouvelle et de l'ancienne mthode pour pouvoir mener des
essais en parallle.
Note: Dans le cadre de l'accrditation, le laboratoire doit prsenter au COFRAC, deux lments diffrents:
1. la procdure qui dcrit les lignes directrices et les modalits du processus qu'il suit pour la validation des
mthodes en gnral (cf. ce guide),
2. le dossier de validation de la mthode proprement dit, qui est un enregistrement (lment de preuve; bibliogra-
phie, donnes brutes, calculs, conclusions du biologiste ou responsable technique).
IX.1- Fidlit
Les essais de rptabilit et de fidlit intermdiaire sont obligatoires.
IX.I.I - Rptabilit
L'essai de rptabilit consiste effectuer l'analyse d'un mme chantillon pour le mme analyte dans des condi-
tions identiques : mme oprateur, mme lots de ractifs, mme instrument, mme calibrateur.
En pratique, cet essai sera ralis au cours d'une mme srie. Il est recommand d'utiliser au moins deux niveaux
de concentration. Les niveaux seront choisis en fonction des valeurs physiopathologiques et/ou de la rglementation.
Le nombre de dterminations dpendra du systme analytique, du cot des ractifs, ... Cet effectif devra tre 6. La
valeur statistique des rsultats obtenus dpend de ces effectifs.
L'exploitation des rsultats consiste calculer la moyenne (m), l'cart-type (s) et le coefficient de variation (CV)
des valeurs exprimentales de chaque srie.
Le CV reprsentera la rptabilit de la mthode en %. Il sera compar au CV limite d'acceptabilit.
Le calcul sera rpt pour chacune des matrices (srum, urine, et sang total en mdicolgal, ... ) soumises analyse.
Pour un mme analyseur, ce calcul devra tre effectu pour chaque analyte mesurer.
IX.I.2 - Fidlit intermdiaire
L'essai de fidlit intermdiaire consiste effectuer l'analyse d'un mme chantillon pour le mme analyte dans des
conditions diffrentes: l'oprateur, les ractifs, l'appareillage, les calibrages et les gammes d'talonnage, les jours
peuvent tre des donnes variables.
Il est recommand d'utiliser au moins deux niveaux de concentration. Les niveaux seront choisis en fonction des
valeurs et/ou de la rglementation. 6 dterminations minimum sont ncessaires pour chacun
des chantillons de validation.
Les modalits de calcul sont identiques celles de la rptabilit, avec calcul de la moyenne (m), de l'cart-type (s)
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et du coefficient de variation (CV) sur les valeurs exprimentales de chaque srie; le CV ainsi calcul sera compa-
r au CV limite d'acceptabilit.
Le CV reprsentera la fidlit intermdiaire de la mthode, exprim en %.
Ce calcul sera rpt pour chacune des matrices (srum, urine, et sang total en mdicolgal, ... ) soumises analyse.
Pour un mme analyseur, ce calcul devra tre effectu pour chaque analyte mesurer.
Note; Pour des raisons pratiques, cet essai pourra ventuellement tre men aprs l'installation du systme analy-
tique et la mise en uvre de la mthode, si et seulement si, les autres spcifications sont bien atteintes.
IX.1.3- Reproductibilit
L'essai de reproductibilit consiste effectuer l'analyse d'un mme chantillon dans diffrents laboratoires.
IX. 2 - Justesse (biais)
En Toxicologie et Suivi Thrapeutique Pharmacologique, il n'existe pas, de rares exceptions prs, d'chantillons
de contrles raccords sur le plan mtrologique des talons internationaux ; il est donc impossible de parler stric-
to sensu de "valeur vraie" et par l-mme de justesse.
En l'absence de matriau de rfrence certifi, on pourra utiliser des chantillons utiliss pour des CQE rguliers et
dont la commutabilit aura t vrifie ou prouve. li est souhaitable (mais pas obligatoire) d'utiliser des chan-
tillons de diffrentes origines commerciales.
Lajustesse (biais) sera estime en comparant la moyenne obtenue (m) lors de l'tude de rptabilit et/ou de fidli-
t intermdiaire la valeur cible attendue assimile la valeur "vraie" (v) de l'chantillon test.
Elle sera exprime en pourcentage de la valeur cible, selon le calcul suivant ;
Justesse en % = x 100
v
Cette justesse pourra aussi tre contrle l'aide des valeurs de rfrence qui pourront tre compares celles de
la littrature.
Exemples d'application - Approche de l'inexactitude et calcul d'incertitude.
Exemple 1 - Les paramtres de fidlit d'une part, et de justesse d'autre part, constituent les composantes de
l'incertitude de mesure, dans le calcul d'incertitude globale selon l'approche ISO 5725, en tant que composantes de
type A. Pour ce calcul, on prendra le cas de composantes indpendantes.
Ainsi, si u} est l'incertitude de fidlit, celle-ci est gale l'cart-type de fidlit intermdiaire;
Pour ce qui est de l'incertitude de justesse, U2' elle est donne par la relation;
justesse
u2 =
(Loi rectangle)
En l'absence de matriau de rfrence, c'est--dire "d'talon", de valeur "vraie" connue (avec une incertitude asso-
cie, Uret), le laboratoire peut utiliser pour calculer l'incertitude de justesse, les donnes de Contrle de Qualit
Externe (CQE), c'est--dire le biais moyen, l'cart-type de cette moyenne et toujours l'incertitude de la valeur cible,
la valeur "vraie". U2 peut alors s'exprimer diffremment en fonction de ces diffrentes composantes.
Ces ccmposantes d'incertitude, combines celle de matriau de rfrence (uret), celles d'talonnage (ueJ, et enfin
aux composantes de type B (UB), le cas chant, permettent de dterminer l'incertitude globale, c'est--dire l'incer-
titude combine (u
c
), puis l'incertitude largie U, selon la relation issue de la somme quadratique des composantes
d'incertitude,
,---------------------
U
c
= -VU}2 + U2
2
+ urel + u
et
2
+
10
Annales de Toxicologie Analytique, vol. xvn, n 3, supplment 1, 2005
Enfin, l'incertitude largie U est alors,
U = 2.U
c
(avec 2 = intervalle de confiance de 95 %, dans le cas d'une distribution gaussienne).
Le rsultat de la mesure analytique, R, s'exprimera alors :
R = valeur mesure U (unit)
Exemple 2 - Une autre approche de l'incertitude peut tre propose (session d'tude SFSTP du 23/10/2002 ;
Mthodes chromatographiques de dosage dans les milieux biologiques : stratgie de validation. STP Pharma
pratiques 1997). Les tudes de rptabilit et de fidlit intermdiaire donnent accs S2n variance de rptabilit
et S 2g variance de fidlit intergroupes et S2
R
variance de fidlit intermdiaire, telles que:
S2
R
= S2r + S 2g
L'incertitude de mesure peut tre alors exprime ainsi :
S2 S2
lC R = rsultat t(a.v) e .......!... + _7_
k ken
Avec CI risque choisi, v degrs de libert de S2
R
,k nombre de sries ncessaires la dtermination du rsultat
(condition de fidlit intermdiaire) et n nombre de rptitions ncessaires la dtermination du rsultat (conditions
de rptabilit).
Si k = n = 1, l'incertitude peut s'exprimer comme:
lC R = rsultat t(a,v) e.JSf
Ainsi exprime, l'incertitude devient un vritable outil pour l'analyste. En effet, lors de l'application en routine de
la mthode valide, le nombre de srie k et le nombre de rptition n peuvent tre adapts une prcision requise.
Ex:
~ C 'l + 2 10 4,56 11,27
.L' R = resu tat _, e --+--
k ken
avec k = n = 1, IC R = rsultat 8.35%
avec k = 1 et n = 2, IC R = rsultat 6.70 %
avec k = 2 et n = 1, IC R = rsultat 5.90%
avec k = 2 et n = 2, IC R = rsultat 4.74%, etc ...
.. IX. 3 - Contamination
Une tude des contaminations inter-chantillons sera effectue de la faon suivante:
Aprs rinage de l'appareil, un chantillon lev (ou positif fort) sera analys 3 fois conscutivement (Hl, H2, H3
de moyenne H) suivi d'un chantillon bas galement pass 3 fois (BI, B2, B3)
Le pourcentage de contamination entre les chantillons peut tre calcul selon la formule suivante :
Contamination en % = (81 - 83) x 1 00
H
Note: Compte tenh de l'importance clinique de certains paramtres, le niveau de la contamination doit tre main-
tenue zro ou entraner des rgles de ranalyse argumentes.
11
Annales de Toxicologie Analytique, vol. xvn, n 3, supplment 1, 2005
IX. 4 - Limite de dtection et limite de quantification
IX.4.1- Limite de dtection
La limite de dtection est le plus petit signal exprim en quantit ou en concentration qui peut tre distingu avec
une probabilit donne d'un blanc ralis dans les meilleures conditions. C'est la quantit minimale dtectable pour
laquelle la rponse (en signal mesur) peut tre distingue avec une probabilit donne d'un blanc.
L'tude de la limite de dtection est base sur l'analyse statistique de la diffrence de signaux observs pour les
blancs et les chantillons.
Mthode 1 : Pour l'estimer, on pourra effectuer 30 mesures rptes des blancs (matrice dpourvue de la substan-
ce doser), dans une mme srie, et on calculera l'cart-type (s), exprim en concentration, de ces 30 mesures.
La limite de dtection peut tre calcule selon la formule suivante :
Limite de dtection = moyenne + 3 carts-type
Mthode 2 : Une limite de dtection peut tre dtermine par excs et correspondre la limite de quantification.
IX.4.2- Limite de quantification
La limite de quantification correspond la plus petite valer exprime en concentration, rendue avec une confiance
acceptable. C'est la valeur pour laquelle le CV et l'cart la valeur thorique sont infrieurs la limite d'accepta-
bilit.
Mthode 1 : la limite de quantification peut tre calcule partir des mesures de blanc
Limite de quantification = moyenne + 10 carts-type
Mthode 2 : Il est possible de raliser des dilutions du calibrateur ou de l'chantillon de Contrle de Qualit Interne
le plus bas (diffrent de 0) avec le blanc chantillon, jusqu' satisfaire la limite d'acceptabilit dans les mmes
conditions que les tudes de fidlit (n ~ 6)
Pour dterminer la limite de quantification, on calculera, pour chaque srie de mesures des diffrentes dilutions,
l'cart-type (s), le Coefficient de Variation (CV) et l'cart de la moyenne (m) la valeur thorique:
Limite de quantification = valeur pour laquelle le CV et l'cart la valeur thorique sont infrieurs la
limite d'acceptabilit
IX. 5 - Linarit
A partir d'une solution mre d'analytes, des solutions de concentrations diffrentes seront prpares. Ces solutions
permettront de vrifier la linarit.
IX. 5.1 Dfinitions
Une ligne est un trait continu.
Une relation linaire en statistique se dfinit comme une relation o les valeurs varient en restant proportionnelles.
La linarit d'un test est sa capacit (pour une gamme donne) produire des rsultats proportionnels la concen-
tration de l'analyte et tre modlise par une transformation mathmatique.
Le modle mathmatique peut ventuellement tre une droite mais s'il est le plus facile calculer, il s'agit rarement
d'un modle correctement descriptif.
IX. 5.2 Types de modlisation
Si l'on souhaite utiliser une droite comme modle mathmatique, il est indispensable de montrer au moyen d'une
analyse de variance type ANOVA que ce modle est acceptable, c'est dire que la variation rsiduelle n'a pas de
contribution significative et que la variation explique par la droite dcrit bien la variation totale. Une deuxime ana-
lyse de variance ANOVA doit s'attacher montrer que les variations du manquement l'ajustement n'ont pas de
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Annales de Toxicologie Analytique, vol. xvn, n 3, supplment 1, 2005
contribution significative et que l'erreur analytique pure explique bien la variation rsiduelle.
Si l'on ne souhaite pas raliser de test ANOVA et chaque fois que cela est possible, nous recommandons et encou-
rageons l'emploi de la rgression quadratique.
IX. 5.3 Gamme de linarit
La gamme de linarit doit tre adapte en fonction des exigences analytiques. En Toxicologie la gamme dynamique
est souvent trs tendue puisque l'analyse cherche couvrir gnralement aussi bien les concentrations thrapeu-
tiques que toxiques. L'utilisation de la rgression non pondre (chaque point de la gamme a une importance iden-
tique), qui considre que les erreurs en "y" sont identiques pour toutes les valeurs de "x", ne pourra tre valide que
si les variances sont homognes. Nous prconisons l'emploi du test de Hartley ou de Cochran afin de tester les
variances (le nombre de mesures pour chaque variance doit tre identique pour tous les points de la gamme).
Si les variances ne sont pas homognes, la rgression doit tre pondre par l'affectation d'un poids statistique inver-
sement proportionnel la variance du point.
Si l'on ne souhaite pas tester l'homognit des variances et calculer un modle pondr, et chaque fois que cela
est possible, nous recommandons et encourageons l'emploi du calcul mathmatique en l/x ou lIx
2
, qui reprsente
une approximation trs valide de la pondration statistique d'un point de gamme.
Le nombre de points de gamme ne peut tre infrieur 5 et le nombre de mesures par point ne peut tre infrieur
3. Dans certains cas particuliers (si l'interprtation ne dpend pas strictement de la concentration), il peut tre jus-
tifiable de restreindre encore le nombre de mesures.
IX. 6 - Stabilit
Il est ncessaire de dfinir pour chaque type d'analyte, en fonction des spcifications techniques du fabricant ou de
la connaissance de la molcule de rfrence, un dlai de premption a priori (1,3 ou 6 mois ... ).
A chance du dlai fix, prparer une nouvelle solution dont les caractristiques analytiques sont compares la
solution arrive premption, afin de confirmer ou de modifier le dlai de premption pralablement fix.
Les critres d'acceptabilit de la validit des solutions de rfrence sont fixs par le laboratoire pour chaque type
d'analyte.
IX. 7 - Corrlation de mthodes
Les concentrations des chantillons de validation doivent tre choisies de faon couvrir l'tendue du domaine
d'analyse.
Chacun des n chantillons de validation (n ~ 5), est analys p fois (p 3) par la mthode A et par la mthode B.
1. A partir des valeurs observes, tester, pour chaque mthode, l'homognit des variances de chaque chantillon
(soit n variances pour A et pour B) selon par exemple un test de Cochran, de Levene ou de Hartley, etc ... (Test d'ho-
,. moscdasticit)
2. Tester l'galit des variances entre les deux mthodes selon un test F (p(n-l ddl et (p(n-l ddl (Comparaison
de deux variances par un test de Fisher).
3. Calculer les diffrences des rsultats obtenus pour chacun des chantillons:
Calculer la moyenne de ces diffrences ainsi que sa variance et tester l'galit de cette diffrence moyenne zro
selon un test t de Student, avec t (p-l) ddl (Comparaison de moyenne d'chantillons apparis).
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Annales de Toxicologie Analytique, vol. XVII, n 3, supplment 1, 2005
x. Terminologie - Autres dfinitions
La liste des dfinitions n'est pas exhaustive.
Note: dans la mesure du possible ces dfinitions ont t reprises partir des documents qui font rfrences. Dans
ce cas l'origine de la dfinition est indique en exposant.
1 = Vocabulaire international des termes fondamentaux et gnraux de mtrologie (VIM)
2 = Guide pour l'expression de l'incertitude de mesure (GUM)
3 = Statistique : Vocabulaire et symboles NF ISO 3534-1
4 = Dcision de la commission du 7 mai 2002 portant spcifications techniques communes des dispositifs mdicaux
de diagnostic in vitro [notifie sous le numro C(2oo2) 1344] (Texte prsentant de l'intrt pour l'EEE)
(2002/364/CE)
5 = Norme XPT 90-210 (Protocole d'valuation d'une mthode alternative d'analyse physico-chimique quantitative
par rapport une mthode de rfrence) dcembre 1999
6 = Guide STP Pharma Pratiques volume 13 - n03 - mai juin 2003 (Validation des procdures analytiques quantita-
tives - Harmonisation des dmarches)
7 = Guide de validation des mthodes en biologie mdicale doc LAB GTA 04 rvision oo-juin 2004
8 = Techniques de l'Ingnieur, trait Analyse et Caractrisation (Validation interne des mthodes d'analyses)
Acceptabilit, critres d' (Performance standard)': critres selon lesquels les performances d'une technique sont
juges satisfaisantes dans les conditions d'emploi dfinies par l'utilisateur (ces critres s'appuient en particulier sur
les concepts d'imprcision, d'inexactitude et d'erreur totale acceptable).
Aliquote (Aliquot)' : terme gnrique se rfrant n'importe quelle solution, spcimen etc., dont on utilise uni-
quement un fragment. C'est une portion mesure, d'un tout, de composition uniforme.
Analyse, domaine d" : intervalle de concentrations (ou autres quantits) d'un analyte pour lequel la technique est
applicable sans modification. Son valuation ncessite l'tablissement des limites de linarit et (ventuellement) de
la limite de dtection de la technique. Synonyme: "domaine de mesurage, gamme de mesure, domaine d'applica-
tion".
Analyte' : composant, substance, matriau mesurer dans un milieu.
Appareil de mesure! : dispositif destin tre utilis pour faire des mesurages, seul ou associ un ou plusieurs
dispositifs annexes.
Biais : voir justesse.
Blanc
6
: essai ralis en l'absence de matrice (blanc ractif) ou sur une matrice qui ne contient pas l'analyte (blanc
matrice). Par extension, la rponse instrumentale en l'absence d'analyte est utilise (blanc instrumental).
Bruit de fond' : correspond aux variations alatoires du signal de mesure pour un niveau donn. li est mesur par
l'cart-type d'une suite d'au moins 30 mesures du signal, au niveau considr.
Calibrage! : positionnement matriel de chaque repre (ventuellement de certains repres principaux seulement)
d'un instrument de mesure en fonction de la valeur du mesurande.
Note: ne pas confondre calibrage et talonnage .
Calibrateur' : matriau de concentration dtermine en analyte soit par pese, soit par titrage dont le milieu et les
proprits sont imparfaitement connus. li peut prsenter des proprits physicochimiques ncessites par une tech-
nique.
Coefficient de corrlation
3
: quotient de la covariance de deux caractres par le produit de leurs carts-types.
Note: il exprime la relation ventuelle entre deux variables rputes indpendantes. Sa valeur doit tre uniquement
teste par rapport zro en fonction d'un risque (l choisi. li est habituellement sans intrt dans les comparaisons
de techniques.
Coefficient de variation
3
: pour un caractre non ngatif, rapport de l'cart-type la moyenne.
Note: ce rapport peut tre exprim en pourcentage.
Le terme cart-type relatif est parfois utilis la place de coefficient de variation , mais cet usage n'est pas
recommand.
14
Annales de Toxicologie Analytique, vol. xvn, n 3, supplment 1, 2005
Composant de type A, (valuation de l'incertitude)l : mthode d'valuation de l'incertitude par l'analyse statis-
tique de sries d'observations.
Composant de type B, (valuation de l'incertitude)l : mthode d'valuation par des moyens autres que l'analyse
statistique de sries d'observations.
Consensus, confrence de' : accord exprs ou tacite tabli entre les membres d'un groupe institutionnel de concer-
tation, permanent ou temporaire.
Contamination' : phnomne physique li un transfert de volume et ayant pour consquence d'introduire une
erreur sur le rsultat final.
Contrle qualit interne (CQI) : il sert l'valuation interne des performances du laboratoire en vue de vrifier
l'absence de drive des rsultats par mesurage rgulier des paramtres contenus dans ces contrles.
Contrle qualit externe (CQE) : il sert l'valuation des performances du laboratoire par comparaison avec les
rsultats obtenus par d'autres laboratoires sur le mme chantillon.
Corrlation
3
: liaison entre deux ou plusieurs variables alatoires l'intrieur d'une loi.
Note: la plupart des mesures statistiques de corrlation ne mesure que le degr de liaison linaire.
Cut-otT : ce que l'on appelle communment le "eut-off' est la valeur au-del de laquelle les rsultats sont suscep-
tibles de prsenter un intrt biologique ou toxicologique, ou dfinie par le fabricant.
Degr de libert
3
, (ddl) : en gnral, le nombre de termes de la somme moins le nombre de contraintes sur les
termes de la somme.
Ecart
'
: valeur moins sa valeur de rfrence.
Ecart-type de la moyenne, s.e.m.("Standard deviation of the mean")' : paramtre statistique indiquant la dis-
persion des valeurs au niveau de la moyenne d'une srie de mesures.
Ecart-type exprimentaP : racine carre positive de la variance.
Ecart-type rsiduel, Syx' : paramtre permettant de chiffrer la dispersion des points autour de la droite de rgression.
Echantillon: on appelle souvent "chantillon" la quantit de liquide biologique (ou autre matrice) soumis l'analyse.
Echantillon de validation : voir standard de validation.
Erreur alatoire
'
: rsultat d'un mesurage moins la moyenne d'un nombre infini de mesurages du mme mesuran-
de, effectus dans des conditions de rptabilit.
Notes:
1. L'erreur alatoire est gale l'erreur moins l'erreur systmatique.
2. Comme on ne peut faire qu'un nombre fini de mesurages, il est seulement possible de dterminer une estimation
de l'erreur alatoire.
Erreur de justesse (d'un instrument de mesure)l : erreur systmatique d'indication d'un instrument de mesure.
Note: l'erreur de justesse est normalement estime en prenant la moyenne de l'erreur d'indication sur un nombre
appropri d'observations rptes.
Erreur relative
l
: rapport de l'erreur de mesure une valeur vraie du mesurande
Note: tant donn qu'une valeur vraie ne peut pas tre dtermine, dans la pratique on utilise une valeur conven-
tionnellement vraie.
Erreur systmatique
'
: moyenne qui rsulterait d'un nombre infini de mesurages du mme mesurande, effectus
dans les conditions de rptabilit, moins une valeur vraie du mesurande.
Notes:
1. L'erreur systmatique est gale l'erreur moins l'erreur alatoire.
2. Comme la valeur vraie, l'erreur systmatique et ses causes ne peuvent tre connues compltement.
3. Pour un instrument de mesure, voir "erreur de justesse".
Erreur totale' : somme algbrique de l'erreur due l'inexactitude et de l'erreur due l'imprcision. Ces deux
erreurs se compensent ou s'additionnent, dfinissant ainsi deux bornes de variation de l'erreur totale.
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Annales de Toxicologie Analytique, vol. XVII, n 3, supplment 1,2005
Etalonnage! : ensemble des oprations tablissant, dans des conditions spcifies, la relation entre les valeurs de la
grandeur indique par un appareil de mesure ou un systme de mesure, ou les valeurs reprsentes par une mesure
matrialise ou par un matriau de rfrence, et les valeurs correspondantes de la grandeur ralise par des talons.
Notes:
1. Le rsultat d'un talonnage permet soit d'attribuer aux indications les valeurs correspondantes du mesurande, soit
de dterminer les corrections appliquer aux indications.
2. Un talonnage peut aussi servir dterminer d'autres proprits mtrologiques telles que les effets de grandeur
d'influence.
3. Le rsultat d'un talonnage peut tre consign dans un document appel certificat d'talonnage ou rapport d'ta-
lonnage.
Etat de l'art: dsigne l'ensemble des mthodes analytiques actuellement disponibles et .utiliser. li est habituelle-
ment estim partir d'enqutes inter laboratoires.
Exactitude
6
: l'exactitude exprime l'troitesse de l'accord entre le rsultat d'essai et la valeur de rfrence accep-
te, aussi appel "valeur conventionnellement vraie".
L'troitesse de l'accord ainsi observe est la rsultante de la somme des erreurs systmatiques et alatoires, en
d'autres termes l'erreur totale lie au rsultat. Par consquent, l'exactitude est l'expression de la somme de la jus-
tesse et de la fidlit.
Evaluation
6
: tude visant prouver le protocole d'analyse (procdure analytique) afin de connatre les valeurs des
critres de performance, retenus au pralable. Cette tude peut tre mene en intralaboratoire (par le fournisseur ou
le fabricant) ou en interlaboratoires.
Fidlit: la fidlit exprime l'troitesse de l'accord (degr de dispersion, coefficient de variation) entre une srie de
mesures provenant de multiples prises d'un mme chantillon homogne (rsultats d'essais indpendants) dans des
conditions prescrites.
La fidlit fournit une indication sur les erreurs lies au hasard. La fidlit traduit uniquement la distribution des
erreurs alatoires et n'a aucune relation avec la valeur vraie ou spcifie.
La fidlit peut tre value trois niveaux :
- la rptabilit: conditions o les rsultats d'essais indpendants sont obtenus par la mme mthode sur des chan-
tillons d'essais identiques dans le mme laboratoire, par le mme oprateur, utilisant le mme quipement et pen-
dant un court intervalle de temps.
- La fidlit intermdiaire Cintralaboratoire) : conditions o les rsultats d'essais indpendants sont obtenus par la
mme mthode sur des chantillons d'essais identiques dans le mme laboratoire, avec diffrents oprateurs en uti-
lisant si possible des quipements diffrents et pendant un intervalle de temps donn.
- La r<alroductibilit Cinterlaboratoires) : conditions o les rsultats d'essais indpendants sont obtenus par la mme
mthode sur des chantillons d'essais identiques dans diffrents laboratoires, avec diffrents oprateurs et utilisant
des quipements diffrents.
Grandeur (mesurable)! : attribut d'un phnomne, d'un corps ou d'une substance qui est susceptible d'tre distin-
gue qualitativement et dtermine quantitativement.
Incertitude de mesure' : paramtre, associ au rsultat d'un mesurage, qui caractrise la dispersion des valeurs qui
pourraient raisonnablement tre attribues au mesurande.
Notes:
1. Le paramtre peut-tre, par exemple, un cart-type (ou un multiple de celui-ci) ou la demi-largeur d'un interval-
le de niveau de confiance dtermin.
2. L'incertitude de mesure comprend, en gnral, plusieurs composantes. Certaines peuvent tre values partir de
la distribution statistique des rsultats de sries de mesurages et peuvent tre caractrises par des cart-types exp-
rimentaux. Les autres composantes, qui peuvent aussi tre caractrises par des cart-types, sont values en admet-
tant des distributions de probabilit, d'aprs l'exprience acquise ou d'aprs d'autres informations.
3. li est entendu que le rsultat du mesurage est la meilleure estimation de la valeur du mesurande, et que toutes les
composantes de l'incertitude, y compris celles qui proviennent d'effets systmatiques, telles que les composantes
associes aux corrections et aux talons de rfrence, contribuent la dispersion.
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Annales de Toxicologie Analytique, vol. xvn, n 3, supplment 1, 2005
Justesse (biais) : la justesse exprime l'troitesse de l'accord entre la valeur moyenne obtenue partir d'une srie de
rsultats d'essais et une valeur qui est accepte soit comme une valeur conventionnellement vraie, soit comme une
valeur de rfrence accepte. La mesure de la justesse est gnralement exprime en terme de biais (erreur syst-
matique). Signalons encore que la justesse tait galement appel "exactitude" ou "exactitude de la moyenne".
Limite de dtectionS : plus petite quantit d'un analyte examiner dans un chantillon, pouvant tre dtecte et
considre comme diffrente de la valeur du blanc (avec une probabilit donne), mais non ncessairement quanti-
fie. En fait, il faut prendre en compte deux risques :
le risque a de considrer la substance prsente dans l'chantillon alors que sa grandeur est nulle ;
le risque B de considrer absente une substance alors que sa grandeur n'est pas nulle.
Limite de quantifications: plus petite grandeur d'un analyte examiner dans un chantillon pouvant tre dtermi-
n quantitativement dans des conditions exprimentales dcrites dans la mthode avec une variabilit dfinie (coef-
ficient de variation dtermin).
Linarits: capacit d'une mthode d'analyse, l'intrieur d'un certain intervalle, fournir une valeur d'informa-
tion ou des rsultats proportionnels la quantit en analyte doser dans l'chantillon pour un laboratoire.
Cette proportionnalit s'exprime au travers d'une expression mathmatique dfinie a priori.
Les limites de linarit sont les limites exprimentales de grandeurs entre lesquelles un modle d'talonnage linai-
re peut tre appliqu avec un niveau de confiance connu (gnralement pris gal 1 %).
Matriau de rfrence
1
: matriau ou substance dont une (ou plusieurs) valeur(s) de la (des) proprit(s) est (sont)
suffisamment homogne(s) et bien dfinie(s) pour permettre de l'utiliser pour l'talonnage d'un appareil, l'valua-
tion d'une mthode de mesurage ou l'attribution de valeurs aux matriaux.
Matriau de rfrence certifi
1
: matriau de rfrence, accompagn d'un certificat, dont une (ou plusieurs)
valeur(s) de la (des) proprit(s) est (sont) certifie(s) par une procdure qui tablit son raccordement une ralisa-
tion exacte de l'unit dans laquelle les valeurs de proprit sont exprimes et pour laquelle chaque valeur certifie
est accompagne d'une incertitude un niveau de confiance indiqu.
Matrice' : milieu dans lequel se trouve l'analyte.
Mesurage
1
: ensemble d'oprations ayant pour but de dterminer une valeur d'une grandeur.
Mesurande
1
: grandeur particulire soumise mesurage.
Mthode: ce terme recouvre l'ensemble des moyens mis en uvre dans le processus analytique (ractif(s), appa-
reil, mode opratoire, mode de calibrage, mode de contrle). Le terme de technique n'est pas utilis en mtrologie.
Moyenne, m' : quotient de la somme des observations par leur nombre. Sauf indication contraire, le terme "moyen-
ne" dsigne la valeur arithmtique.
Mode opratoire (de mesure)l : ensemble des oprations, dcrites d'une manire spcifique, mises en uvre lors
de }' excution de mesurages particuliers selon une mthode donne.
Ordonne l'origine (Intercept)': endroit o la droite d'un graphique coupe l'axe des ordonnes. Dsign conven-
tionnellement par la lettre "a".
Pente (Slope)' : angle que fait une droite sur un graphe par rapport l'horizontale. Il est exprim sous forme d'un
rapport entre les valeurs de Y et les valeurs de X. Dsign conventionnellement par la lettre "b".
Performance, critres de' : paramtres caractrisant la procdure analytique (linarit, fidlit, justesse, ... ).
Population' : ensemble (fini ou infini) d'lments ou d'individus, dfini de faons trs prcises.
Processus de validation d'une mthode d'analyse
8
: action de confirmer par examen et apport de preuves tangibles
obtenues par des tudes statistiques intralaboratoires et/ou interlaboratoires que les exigences particulires pour un
usage spcifique prvu de la mthode d'analyse sont satisfaites. En gnral, les exigences particulires portent sur
le domaine d'application, la linarit, la spcificit, la fidlit et la justesse.
,
Rptabilit : voir fidlit.
Reproductibilit : voir fidlit.
17
Annales de Toxicologie Analytique, vol. xvn, n 3, supplment 1, 2005
Rsultat d'un mesurage
1
: valeur attribue un mesurande, obtenue par mesurage.
Risque a ou risque de premire espce' : probabilit de rejeter une hypothse vraie l'issue d'un test statistique.
Ce risque est fix avant de raliser un test (habituellement 5 ou 1 %). On l'appelle aussi seuil ou niveau d'un test.
Risque fi ou risque de deuxime espce' : probabilit de considrer l'hypothse nulle Ho comme vraie quand elle
est fausse. Le risque ~ dpend du test effectu, du risque a. choisi et du nombre de degrs de libert.
Robustesse : par "robustesse" d'une technique d'analyse, on entend une mesure de sa capacit ne pas tre affec-
te par des variations faibles mais dlibres des paramtres de la mthode, et qui fournit une indication sur sa fia-
bilit dans les conditions normales d'utilisation.
Sensibilit' : une mthode est dite "sensible" si une faible variation de la concentration ou de la quantit d'analyte
entrane une variation significative de la rponse.
Il convient d'viter de dfinir, par extension, la sensibilit de la mthode comme sa capacit dtecter de faibles
concentrations.
Srie' : ensemble de mesures conscutives effectues sans interruption et dont les rsultats sont obtenus partir
d'une phase unique de calibrage.
Signal de mesure
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: grandeur qui reprsente le mesurande et qui lui est fonctionnellement lie.
Spcificit' : la spcificit d'une procdure analytique est sa capacit tablir de manire univoque l'existence d'une
substance analyser en prsence d'autres composants potentiellement prsents.
Standard d'talonnage : voir matriau de rfrence.
Standard de validation' : les standards de validation sont des chantillons, reconstitus dans la matrice ou tout autre
matriau de rfrence, dont la valeur vraie a pu tre tablie par consensus et qui sont utiliss pour la validation de
la procdure d'analyse.
Valeur (d'une grandeur)l : expression quantitative d'une grandeur particulire, gnralement sous la forme d'une
unit de mesure multiplie par un nombre.
Valeur conventionnellement vraie (d'une grandeur)l : valeur attribue une grandeur particulire et reconnue,
parfois par convention, comme la reprsentant pour une incertitude approprie pour un usage donn.
Validation (validation des mthodes) : cf. dfinition de l'ISO/CEl 17025, au chapitre 1 Introduction.
Variance' : paramtre statistique chiffrant la dispersion des individus autour de la moyenne. C'est la somme des car-
rs des carts la moyenne de n observations divise par le nombre de degrs de libert. L'cart-type est la racine
carre de la variance.
Vrification: confirmation par examen et tablissement des preuves que les exigences spcifies ont t satisfaites.
XI. Bibliographie
- Analyse des produits agricoles et alimentaires - Procdure de validation intralaboratoire d'une mthode alternati-
ve par rapport une mthode de rfrence - Cas de mthodes d'analyses quantitatives. Norme NF V03-110,
dcembre 1998.
- Vassault A., Grafmeyer D., de Graeve J., Cohen R., Beaudonnet A., Bienvenu J. Analyses de biologie mdicale: sp-
cification et normes d'acceptabilit l'usage de la validation des techniques. Ann. Biol. Clin. 1999; 57(6) : 685-95.
- Application de la statistique - Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats et mthodes de mesure, parties 1 6.
Norme NF ISO 5725, dcembre1994 et octobre 1998.
- Journal officiel de la Rpublique franaise. Arrt du 26 novembre 1999 relatif la bonne excution des analyses
de biologie mdicale. (GBEA). Il dcembre 1999 ; 287 : 18441.
- Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA). http://www.cms.hhs.gov/clia (site consult en mai 2(05).
18
Annales de Toxicologie Analytique, vol. xvn, n 3, supplment 1, 2005
- Dsenfant M., Priel M., Rivier C. De la validation des mthodes d'analyse l'valuation de l'incertitude des rsul-
tants de mesure. Actes du l1
me
congrs international de mtrologie. Toulon, 20-23 octobre 2003. Document tl-
chargeable sur le site : http://www.lne.fr/publications/actes_l1e30ngres_metrologie/81.pdf
- Comit Franais d'Accrditation (COFRAC). Document 1133. Procdure de validation interne des mthodes d'essais.
Octobre 1995 ; document tlchargeable sur le site : http://www.cofrac.fr/doc/docs/1_laboratoires/essais/1133vOO.doc
- Jansen R.T.P. Essential criteria for quality systems of medicallaboratories. Eur.J. Clin. Chem. Clin. Biochem.
1997 ; 35(2) : 123-32.
- Perruchet C., Priel M. Estimer l'incertitude, in: Mesures - Essais., Paris, Edition AFNOR, 2000.
- Duval C. Evaluation de l'automate Axsym. Ann. Biol. Clin. 2001 ; 59 (5) : 48-51.
- valuation des performances des dispositifs mdicaux de diagnostic in vitro. Norme NF EN 13612,
septembre 2002.
- Wamet J.M. Evaluation d'une technique de dtermination de l'thanolmie par chromatographie en phase gazeu-
se. Ann. Biol. Clin. 1990; 48(8) : 587-95.
- Guide de validation analytique. SFSTP. STP Pharma. Prat. 1992; 2 : 205-26.
- Guide de validation des mthodes de dosage biologique. SFSTP. STP Pharma. Prat. 2002 ; 12 (6) : 317-36.
- Quantifier l'incertitude dans les mesures analytiques. Guide EURACHEMICITAC, 2
me
d., 2000 ; document tl-
chargeable sur le site: http://www.lne.fr/fr/services_ligne/guides_documents techniques.shtml
- Rivier C., Lalere B. Guide mthodologique pour l'estimation des incertitudes en analyse chimique. Actes du Il me
congrs international de mtrologie. Toulon, 20-23 octobre 2003. Document tlchargeable sur le site:
http://www.lne.fr/fr/service_ligne/publications.shtml
- Guide pour l'expression de l'incertitude de mesure. Paris, ISO, 1995.
- Feinberg M., La validation des mthodes d'analyse. Paris, Masson, 1996.
- Laboratoires d'analyses de biologie mdicale - Exigences particulires concernant la qualit et la comptence.
Norme NF EN ISO 15189, octobre 2003.
- Groupe de travail SFBC. Le protocole Valtec : volution du concept et du contenu. Ann. Biol. Clin 1997 ; 55(2) :
167-73.
- Groupe de travail SFBC. Le protocole Valtec : protocole de validation de techniques (document B). Ann. Biol. Clin
1986; 44 686-745.
- Guide EA-4/16. Lignes directrices d' EA pour l'expression de l'incertitude des rsultats d'essais quantitatifs. 2004.
Document tlchargeable sur le site : http://www.lne.fr/publications/guides-documents techniques .shtml
- Lignes directrices relatives l'utilisation d'estimations de la rptabilit, de la reproductibilit et de la justesse dans
l'valuation de l'incertitude de mesure. Norme ISOITS 21748, 2004.
- Widmer-Girod C., Staub C. L'incertitude de mesure: une notion dfinir en toxicologie mdico-lgale. Ann.
Toxicol. Anal. 2004 ; 16(3) : 215-9.
- Manuel suisse des denres alimentaires. Analyse des produits agricoles et alimentaires. Guide pour la validation
des mthodes d'essai physico-chimiques et valuation de l'incertitude de mesure. Chapitre 6OC, 1998.
- Mthodes chromatographiques de dosage dans les milieux biologiques : stratgie de validation : SFSTP. STP
Ph arma. Prat. 1997 ; 7 : 169-94.
- Normes fondamentales - Vocabulaire international des termes fondamentaux et gnraux de mtrologie. Norme NF
X 07-001, dcembre 1994.
- Prescriptions gprales concernant la comptence des laboratoires d'talonnages et d'essais. Norme NF EN
ISO/CEl 17025, mai 2000.
- Procdure de validation d'une technique. Spectra Biol. 1997 ; 16(90) : 43-50.
19
Annales de Toxicologie Analytique, vol. XVII, n 3, supplment 1,2005
- Programmes d'accrditation COFRAC de Biologie Mdicale: Programme n 143 Analyses en Biochimie. Rvision
03, mai 2003. Document tlchargeable sur le site: http://www.cofrac.fr/doc/docs/l_laboratoires/essais/pI43.doc ;
Programme 168 Analyses en Toxicologie et Suivi Thrapeutique Pharmacologique. Version 00, mai 2002.
Document tlchargeable sur le site http://www.cofrac.fr/doc/docs/Claboratoires/essais/pI68vO.doc.
- Qualit de l'eau - Protocole d'valuation d'une mthode alternative d'analyse physico-chimique quantitative par
rapport une mthode de rfrence. XP T 90-210, dcembre 1999.
- Nicolas O., Farenc C., Bressolle F. Stratgie de validation de mthodes de dosage en bioanalyse en vue d'tudes
pharmacocintiques et toxicologiques. Ann. Toxicol. Anal. 2004 ; 16(2) : 118-27.
- Feinberg M. Validation interne des mthodes d'analyse. Techniques de l'Ingnieur, pp 224-1 - 224-23.
- Validation des procdures analytiques quantitatives - Harmonisation des dmarches. SFSTP. STP Pharma. Prat.
2003 ; 13(3) : 101-38.
- Clerc Y., Huart B., Charotte lM, Pailler F.M., Validation d'une mthode de dosage de l'thanol sanguin par chro-
matographie en phase gazeuse. Ann. Biol. Clin. 1995 ; 53(4) : 233-8.
- ICH harmonised tripartite guideline. Validation of analytical procedures Q2A., International conference on har-
monisation of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use ; 27 octobre 1994.
- ICH harmonised tripartite guideline. Validation of analytical procedures: methodology Q2B. International confe-
rence on harmonisation of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use; 6 novembre
1996.
20