METABOLISMO MICROBIANO

(Pruebas Bioqumicas) INTRODUCCIN

Los estudios sobre las actividades bioqumicas de los microorganismos, en las que se basan todas sus dems actividades, hubieron de esperar el nacimiento de la bioqumica, en la ltima mitad del siglo XIX. No obstante, a partir de entonces, el inters sobre las actividades bioqumicas de los microorganismos ha crecido a un ritmo impresionante y hoy se reconoce a la bioqumica microbiana como un sujeto de amplio estudio. Lo que el bioqumico a la larga se propone cuando estudia las actividades de los microorganismos es la explicacin en trminos moleculares de los procesos vitales de estos organismos. Paulatinamente se han acumulado datos sobre el comportamiento bioqumico de los microorganismos. Los primeros

microbilogos no podan hacer otra cosa que estudiar estas poblaciones mixtas de microorganismos. Despus de los trabajos de LORD JOSEPH LISTER Y ROBERT KOCH, se hizo posible el estudio de los grmenes en cultivo puro, pero aunque esto simplific notablemente la tarea de observarlos y clasificarlos, tambin tuvo como consecuencia el estudiarlos en condiciones muy diferentes de las que reinan en los ambientes naturales. Los primeros experimentos sobre las actividades bioqumicas de los microorganismos estaban relacionados principalmente con la capacidad de los grmenes en crecimiento, de cambiar la composicin qumica de su medio ambiente realizando la separacin de algunos de los componentes y la excrecin de otros. Desde la dcada pasad, los microbilogos se han interesado cada vez ms por los aspectos fisiolgicos de la actividad microbiana, se obtuvieron xitos espectaculares por los zimlogos al disear los sistemas metablicos para la obtencin de fermentos tiles industrialmente; en la actualidad con la manipulacin gentica se estn obteniendo productos de origen animal y vegetal en grandes cantidades mediante fermentacin bacteriana a escala industrial.

OBJETIVOS Mediante esta prctica el alumno lograra: Relacionar la actividad metablica de los M.O con los sustratos, los cambios producidos en los medios de cultivo y la aparicin de diferentes metablicos en los mismos. Interpretar adecuadamente pruebas especficas y relacionarlas con las caractersticas metablicas de diversos M.O Aplicar los conocimientos adquiridos para la caracterizacin de M.O problemas

HIDRLISIS DEL ALMIDN: FUNDAMENTO: La hidrlisis implica la ruptura de un enlace mediante la adicin en medio del mismo de los elementos del agua. Los polisacridos de la dieta se metabolizan mediante hidrlisis a monosacridos. La mayora de los pasos de la degradacin de almidn a glucosa pueden ser catalizados por tres enzimas distintas, si bien hay otras ms que se necesitan para completar el proceso. Las tres primeras enzimas son una -amilasa, -amilasa y almidn fosforilasa. Al parecer solo la -amilasa puede atacar grnulos de almidn intactos, por lo que cuando participan la -amilasa y la almidn fosforilasa, es probable que acten sobre los primeros productos liberados por la -amilasa. La -amilasa ataca de manera aleatoria enlaces 1,4 en las molculas de amilosa y amilopectina, al principio creando huecos al azar en los granos de almidn y liberando productos que aun son grandes. En cadenas de amilosa no ramificadas, el ataque repetido por la -amilasa produce maltosa, un disacrido que contiene dos unidades de glucosa. Sin embargo, la -amilasa no puede atacar los enlaces 1,6 localizados en los puntos de ramificacin de la amilopectina, por lo que la digestin de amilopectina cesa cuando aun quedan dextrinas ramificadas con cadenas de longitud corta. Muchas -amilasas son activadas por Ca+, lo cual es una de las razones por las que el calcio es un elemento esencial. OBJETIVO: Buscar La Presencia De La Enzima Amilasa. MATERIAL: Lpiz graso mechero Asa y porta asa Gradilla Una caja petri con agar almidn Cultivos puros de 24 horas de desarrollo.

PREPARACIN DEL AGAR ALMIDON. AL 1% Ingredientes por litro. Extracto de carne...........................3 g Almidn Soluble, Difco.................10 g Agar..............................................12 g pH final: 7.5 0.2 a 25 C. 1. Suspender 25 g en 1 litro de agua destilada o desmineralizada. 2. Calentar a ebullicin para disolver completamente. 3. Esterilizar en autoclave por 15

minutos a 15 libras de presin (121 C). 4. Distribuir en la forma deseada.

METODOLOGIA DE SIEMBRA: 1. Con un lpiz graso o con un marcador, dividir la parte externa de la caja en cuatro sectores. 2. Identificar los sectores 1 y 2 con el nombre de los microorganismos, el sector 3 con el problema y el 4 con el control. 3. En condiciones de asepsia, tomar una asada del cultivo e inocular el sector 1 sembrado por estra recta empezando por el borde de la caja. 4. Repetir el procedimiento, inoculando los sectores 2 y 3 con los microorganismos adecuados. 5. El sector 4 se deja sin sembrar y se utiliza como control de esterilidad del medio, as como testigo. 6. Invertir las cajas e incubar a 37 C durante 48 horas.

7. Despus de la incubacin, cubrir la superficie de la caja con la solucin de lugol. 8. Consultar la gua de observacin y anotar los resultados obtenidos en la tabla correspondiente.

RESULTADOS:

LECTURA En la metodologa dice que Una prueba positiva se revela aadiendo solucin de lugol, por la aparicin de zonas incoloras alrededor de las colonias; si la prueba es negativa el medio se tie totalmente de azul-prpura.. Esto fueron los resultados de las sepas a estudiar.

CEPAS 5.- Staphylococcus aereus 6.-Enterobacteria sp 3.-Proteus sp 8.-problema

RESULTADOS NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO

NO FUE CONSUMIDO EL ALMIDN.

HIDRLISIS DE LA CASENA FUNDAMENTO: El hidrolizado cido de casena es una base nutritiva obtenida mediante una hidrlisis no especfica con cido clorhdrico, la cual transcurre hasta convertir la casena en componentes de una simplicidad qumica relativa. El cido clorhdrico acta sobre las uniones peptdicas y degrada la protena y polipptidos a cadenas cortas y aminocidos. Este hidrolizado se caracteriza por presentar un elevado contenido de nitrgeno amnico y un bajo contenido de aminocidos sulfurados.1-3 OBJETIVO: buscar la presencia de la enzima caseinasa. MATERIAL: Lpiz graso mechero Asa y porta asa Gradilla Una caja petri con agar casena. Cultivos puros de 24 horas de desarrollo.

PREPARACIN DEL AGAR CASENA: FRMULA (EN GRAMOS POR LITRO) Agar nutritivo a doble concentracin Leche descremada y deslactosada Agua destilada 125ml 125ml Tomar 125ml de agar nutritivo a doble concentracin y mezclarlos con a125 ml de agua destilada por 13 minutos Tomar 125ml de leche y mezclarla con la solucin anterior por 10 minutos Esterilizar autoclave. Vaciar en los tubos preparado en la INSTRUCCIONES

correspondientes .

TECNICA DE SIMBRA METODOLOGIA DE SIEMBRA: 1. Repetir el procedimiento

adecuado en los incisos 1 al 6 del ejercicio anterior. 2. Despus de la incubacin

consultar la gua de observacin y registrar los resultados en la tabla correspondiente.

RESULTADOS LECTURA CEPAS 5.- Staphylococcus aereus 6.-Enterobacteria sp 3.-Proteus sp 8.-problema RESULTADOS POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO

EN LAS CEPAS 5 Y 6 EL RESLUTADO FUE POSITIVO, SI SE ENCONTRO LA ENZIMA CASEINASA

HIDRLISIS DE LA GELATINA La gelatina es una protena que se mantiene en un estado de gel mientras la temperatura sea menor de 25C, cuando la temperatura aumenta la gelatina se inocula; es decir que pasa de estado liquido permaneciendo en este mientras la temperatura se mantenga alrededor de los 25C.

La mayora de los polmeros son demasiados grandes para ser transportados dentro de la clula. Las bacterias excretan enzimas extrace1u1ares que se hidro1izan unos polmeros transportando al interior de la clula en monmeros que les servir para crecer.

La produccin de proteasa es elevada por incorporacin de una protena

(gelatina) en un medio slido en placa. La placa se inunda en un medio cido que precipita la protena no hidroliza. OBJETIVO: Buscar La Presencia De La Enzima Gelatinasa MATERIAL: Lpiz graso Mechero Asa y porta asa Gradilla 4 tubos de ensayo de 5ml de gelatina. Cultivos puros de enterobacterias aerogenes Staphilococcus aureus y una cepa problema. PREPARACIN DEL MEDIO GELATINA NUTRITIVA. FRMULA (EN GRAMOS POR LITRO) Extracto de carne Gelatina Peptona de Gelatina pH final: 6 + 0.2 3 120 5 Rehidratar 128 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos. Calentar agitando frecuentemente INSTRUCCIONES

hasta el punto de ebullicin durante 1 minuto para disolverlo por completo. Distribuir en tubos de ensayo. Esterilizar en autoclave a 121C (15 lbs de presin) durante 15 minutos. Enfriar en posicin vertical.

Conservar en refrigeracin de 2 a 8C.

TCNICA DE SIEMBRA I. 1.- colocar los tubos con gelatina nutritiva en el hielo para mantenerlo a una temperatura baja y evitar la licuefaccin del medio. II. 2.- identificar cada

tubo con el nombre de cada uno de los microorganismos, el 4 tubo sirve para control. III. 3.- en condiciones de

asepsia. Incubar cada uno de los tres tubos con el microorganismo correspondiente, sembrando por picadura con el asa recta. IV. temperatura ambiente de 2 a 7 das. 4.-Incubara

V.

5.- despus de la

incubacin, colocar los tubos en hielo, teniendo cuidado de no agitarlos; esperar a que el contenido del tubo control se solidifique. Sacar los otros tres tubos y observar los resultados.

RESULTADO Lectura: Una prueba es positiva si se identifican las caractersticas del cono de licuefaccin producido por las diferentes bacterias, y al comparar la hidrlisis, algunas bacterias hacen que el medios solidifique y otras hacen que se hidrolicen (presencia de gelatinaza).
CEPAS RESULTADOS NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO

5.- Staphylococcus aereus 6.-Enterobacteria sp 3.-Proteus sp 8.-problema

FERMENTACIN DE AZUCARES FUNDAMENTO: Se entiende por fermentacin a reacciones de mantenimiento que no requieren la participacin de una cadena de transporte de electrones, aunque en ciertos casos stas pueden jugar papeles auxiliares. En el caso de azcares se trata de procesos de xido-reduccin capaces de regenerar NAD y que comnmente tienen como productos finales alcoholes (etanol, isopropanol, n-butanol, etc.), cidos (actico, frmico, lctico, etc.)

acompaados o no por la formacin de gases.

Adems de su inters bioqumico, la capacidad para fermentar diferentes azcares es una propiedad utilizada muy frecuentemente en taxonoma. En nuestro caso utilizaremos un procedimiento clsico para ensayar la capacidad de fermentacin de tres azcares: Glucosa, Sacarosa y Lactosa. La produccin de cidos se observar por el viraje a amarillo del Prpura de Bromocresol. La produccin de gas por su acumulacin en las Campanas Durham, de donde habr desplazado parte del lquido inicialmente includo. Ambas determinaciones se efectuarn a las 24 y 48 horas de incubacin para as tener una idea de la rapidez de su produccin. Asmismo, se har una cuantificacin en funcin de la extensin del viraje del indicador y de la cantidad de gas producida. OBJETIVO: Observacin De La Descarboxilacion De Los Azucares MATERIAL Lpiz graso Mechero, asa y porta asa y gradilla 16 tubos de 13X100 con tubos Durham conteniendo caldo rojo de fenol mas un carbohidrato (4 con lactosa, 4 con maltosa, 4 con glucosa y 4 con sacarosa). Cultivos puros.

PREPARACIN DE MEDIOS PARA LA PRUEBA DE CARBOHIDRATOS CALDO ROJO DE FENOL 1. Prehidratar 15 g del medio de cultivo en un litro de agua destilada. 2. Agregar carbohidratos si se desea.

CLCULOS CALDO ROJO DE FENOL 15 g-------------------1000ml X---------------------300ml X=4.5 g AZCAR 100%-----------------300g 1%----------------------X x=3g

METODO I. 1.- colocar los tubos con gelatina nutritiva en el hielo para mantenerlo a una temperatura baja y evitar la licuefaccin del medio. II. 2.- identificar cada tubo

con el nombre de cada uno de los microorganismos, el 4 tubo sirve para control.

III.

3.- en condiciones de asepsia.

Incubar cada uno de los tres tubos con el microorganismo correspondiente, sembrando por picadura con el asa recta. IV. ambi ente de 2 a 7 das. V. 5.- despus de la incubacin, colocar los tubos en hielo, teniendo cuidado de no agitarlos; esperar a que el contenido del tubo control se solidifique. Sacar los otros tres tubos y observar los resultados. 4.-Incubara temperatura

LACTOSA 1% 1. Pesar 4.5 g de caldo rojo de fenol 2. En un matraz de 500 ml agregar 300 ml de agua destilada para disolver el medio de cultivo. Pesar 3g del azcar y adicionrselos al matraz. 3. Colocar dentro de tubos con rosca 1 campana Durham invertida y vaciar 10 ml del medio de cultivo fijndose que tambin la campana debe de llenarse de medio. GLUCOSA 1% 1. Pesar 4.5 g de caldo rojo de fenol 2. En un matraz de 500 ml agregar 300 ml de agua destilada para disolver el medio de cultivo. Pesar 3g del azcar y adicionrselos al matraz.

3. Colocar dentro de tubos con rosca 1 campana Durham invertida y vaciar 10 ml del medio de cultivo fijndose que tambin la campana debe de llenarse de medio. SACAROSA 1% 1. Pesar 4.5 g de caldo rojo de fenol 2. En un matraz de 500 ml agregar 300 ml de agua destilada para disolver el medio de cultivo. Pesar 3g del azcar y adicionrselos al matraz. 3. Colocar dentro de tubos con rosca 1 campana Durham invertida y vaciar 10 ml del medio de cultivo fijndose que tambin la campana debe de llenarse de medio. MANITOL 1% 1. Pesar 4.5 g de caldo rojo de fenol 2. En un matraz de 500 ml agregar 300 ml de agua destilada para disolver el medio de cultivo. Pesar 3g del azcar y adicionrselos al matraz. 3. Colocar dentro de tubos con rosca 1 campana Durham invertida y vaciar 10 ml del medio de cultivo fijndose que tambin la campana debe de llenarse de medio. RESULTADOS CEPAS: 5.- Staphylococcus aereus 6.-Enterobacteria sp 3.-Proteus sp 8.-problema

La metodologa indica que la prueba positiva da un cambio de coloracin De rojo amarillo. Azucares Glucosa Sacarosa Manitol Lactosa Cepa 8 Positivo Positiva Positivo positivo Cepa 3 negativo negativa negativo negativo Cepa 6 positivo positiva positivo positivo Cepa 5 Dudosa Negativa Negativo Negativo

PRUEBA DE CATALASA FUNDAMENTO: Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra en la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. El Objetivo es buscar la presencia de la enzima catalasa El perxido de hidrgeno se produce al utilizar la bacteria el azcar por va oxidativa. Al ser ste un compuesto muy oxidante las bacterias la eliminan mediante la produccin de la enzima catalasa (H2O2 -> H2O + O2). OBJETIVO: buscar la presencia de la enzima catalasa.

MATERIAL 1 caja de petri con agar nutritivo Agua oxigenada al 3.0% 1 Mechero Asa de siembra Cultivos de 24 horas de los microorganismos indicados por el profesor. PREPARACIN DE LAS PLACAS DEL MEDIO AGAR NUTRITIVO

Peptona de Gelatina 5.0 Extracto de Carne 3.0

Mtodo: Suspender 23 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitacin suave hasta su completa Disolucin y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121C (15 libras de presin) durante 15 Minutos. Dejar enfriar a una temperatura entre 45-50C y vaciar en placas de Petri estriles.

Agar Bacteriolgico 15.0 pH 6.8 0.2

METODOLOGA DE SIEMBRA: 1. Con un lpiz graso o con un

marcador, dividir la parte externa de la caja en cuatro sectores 2. Identificar los sectores 1 y 2 con el nombre de los microorganismos, el sector 3 con el problema y el 4 es el control. 3. Sembrar con estra recta inoculado un microorganismo en cada sector 4. Invertir las cajas he incubar a 37 C durante 24 horas 5. Agregar unas gotas de perxido de hidrogeno sobre el desarrollo microbiano.

6. Consultar la gua de observacin y tratar de interpretar la reaccin que se produce 7. Registrar los datos en la tabla correspondiente. RESULTADOS:
La metodologa es buscar la presencia de la enzima catalasa el perxido de

hidrgeno se produce al utilizar la bacteria el azcar por va oxidativa. Al ser ste un compuesto muy oxidante las bacterias la eliminan mediante la produccin de la enzima catalasa (h2o2 -> h2o + o2).

LECTURA CEPAS 5.- Staphylococcus aereus 6.-Enterobacteria sp 3.-Proteus sp 8.-problema RESULTADOS POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

PRUEBA UREASA FUNDAMENTO: Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos molculas de amoniaco por accin del enzima ureasa. Esta actividad enzimtica es caracterstica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para diferenciar este gnero de otras enterobacterias que dan negativo o positivo retardado. Se cultiva el microorganismo en slant en agar urea de Christensen. Este medio se complementa despus del autoclavado con 50ml/l de urea. sta ser degradada por aquellos microorganismos capaces de producir el enzima ureasa. Esta degradacin produce amoniaco que har variar el color del indicador de amarillo a rosa mexicano, ponindose as de manifiesto la actividad ureasa. Para revelar el resultado de esta prueba es importante tener en cuenta el tiempo de incubacin ya que especies de Proteus vuelven alcalino el medio poco despus de la inoculacin y sus resultados deben ser ledos en las primeras 2-6 horas, mientras que Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae tienen actividad ureasa dentro de las 24-48 horas de incubacin.

OBJETIVO: Determinacin de la enzima ureasa MATERIAL: 4 tubos de 12 x 75 con 3 ml de agar urea Cultivos puros de 24 horas.

PREPARACIN DE AGAR UREA. Medio utilizado para diferenciar microorganismos en base a la actividad uresica. Se utiliza para identificar bacterias que hidrolizan urea, tales como Proteus spp., otras enterobacterias y estafilococos. En el medio de cultivo, la triptena y la glucosa, aportan los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el rojo de fenol es el indicador de pH. Algunas bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima ureasa liberando amonaco y dixido de carbono. Estos productos alcalinizan el medio haciendo virar el rojo de fenol del amarillo al rojo. En este medio, la fermentacin de la glucosa activa la enzima ureasa, acelerando la velocidad del metabolismo en aquellos organismos que hidrolizan lentamente la urea, como especies de Enterobacterias o Klebsiella.

FRMULA (EN GRAMOS POR LITRO) Triptena Glucosa Cloruro de sodio Fosfato monopotsico Rojo de fenol Agar 1.0 1.0 5.0 2.0 0.012 15.0

INSTRUCCIONES

Suspender 24 g de polvo en 950 ml de agua destilada. Dejar reposar 2 minutos.

Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Enfriar a 50C y agregar 50 ml de una solucin de urea al 40% previamente esterilizada por

filtracin o cloroformo. Fraccionar en tubos de hemlisis y solidificar en pico de flauta con fondo profundo. pH final: 6.8 0.2

METODOLOGA DE LA SIEMBRA: 1. Indicar los tubos con el nombre de los microorganismos 2. Con una asada de 2mm de dimetro inocular cada tubo mediante la introduccin de tres asadas del cultivo microbiano 3. Agitar suavemente el cultivo hasta homogneas. 4. Incubar los tubos a 35 C durante 24 horas. 5. Registrar los resultados en la tabla correspondiente. RESULTADOS: LECTURA obtener suspensiones

La metodologa indica que la prueba da positiva al cambiar de naranja a rosa.

CEPAS 5.- Staphylococcus aereus 6.-Enterobacteria sp 3.-Proteus sp 8.-problema

RESULTADOS NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO

UTILIZACIN DEL CITRATO FUNDAMENTO: Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como nica fuente de carbono y compuestos amoniacales como nica fuente de nitrgeno en su metabolismo, provocando una alcalinizacin del medio. Entre las enterobacterias estas caractersticas se dan en los siguientes gneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes. Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrgeno respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH. Slo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrn multiplicarse en este medio y liberarn iones amonio lo que, junto con la eliminacin del citrato (cido), generar una fuerte basificacin del medio que ser aparente por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul.

OBJETIVO: Determinacin De La Utilizacin De Citrato Como nica Fuente De Carbono

MATERIAL: Mechero, asa y porta asa Gradilla 4 tubos de 16 x 150 conteniendo el medio citrato de Simmons (inclinado). Cultivos puros de 24 horas de desarrollo de los microorganismos indicados en ejercicios anteriores.

PREPARACIN DEL MEDIO CITRATO DE SIMMONS Medio utilizado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la capacidad de usar citrato como nica fuente de carbono y energa. En el

medio de cultivo, el fosfato monoamnico es la nica fuente de nitrgeno y el citrato de sodio es la nica fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimtico. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como nica fuente de carbono, usan sales de amonio como nica fuente de nitrgeno, con la consiguiente produccin de alcalinidad. El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a travs del ciclo del cido tricarboxlico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este ltimo, en presencia de un medio alcalino, da origen a cidos orgnicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la produccin de citrato permeasa.

FRMULA (EN GRAMOS POR LITRO) Citrato de sodio Cloruro de sodio Fosfato dipotsico Fosfato monoamnico Sulfato de magnesio Azul de bromotimol Agar 2.0 5.0 1.0 1.0 0.2 0.08 15.0

INSTRUCCIONES Suspender 24,2 g del medio deshidratado por litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos y

mezclar calentando a ebullicin durante 1 o 2 minutos. Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. inclinada. Enfriar en posicin

pH final: 6.9 0.2

METODOLOGA DE SIEMBRA: 1. Identificar los tubos con el nombre de los microorganismos a inocular. 2. Inocular por picadura y estra el medio 3. Incubar a 35 C de 24 a 48 horas. 4. Despus de la incubacin, observar si hubo desarrollo, consultar la gua de observacin y anotar sus datos en la tabla correspondiente.

RESULTADOS: En la metodologa dice que una coloracin de color verde cambia a azul en el medio nos indica una prueba positiva. Esto fueron los resultados

CEPAS 5.- Staphylococcus aereus 6.-Enterobacteria sp 3.-Proteus sp 8.-problema

RESULTADOS NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO

NEGATIVO

OBSERVACIN DE CIDO SULFRICO

FUNDAMENTO La protelisis de la protena produce a.a. individuales; ciertas bacterias heterotrficas pueden liberar enzimticamente el azufre de los diversos a.a. azufrados, produciendo H2S gaseoso peptona, cistena, cistina, metionina y tiosulfato son fuentes de azufre, pero las especies utilizan diferentes compuestos o a.a. azufrados para producir H2S. Las enzimas responsables de esta actividad son la cistena, desulfhidrasa y la tiosulfato reductasa. OBJETIVO: identificacin de cistena, desulfhidrasa y la tiosulfato reductasa.

MATERIAL: 4 tubos de 12 x 75 con agar hierro de Kligler. Cultivos puros de 24 horas de desarrollo

PREPARACION DEL MEDIO KLIGLER: Medio de cultivo frecuentemente usado en microbiologa de alimentos para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la fermentacin de glucosa y lactosa, y a la produccin de cido sulfhdrico. En el medio de cultivo, la peptona de carne y la triptena, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa y la glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de cido sulfhdrico, el citrato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe
3+

, los cuales se combinan con el cido

sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico. El agar es el agente solidificante.

Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio cido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro.

FRMULA (EN GRAMOS POR LITRO) Peptona de carne Cloruro de sodio Lactosa Tripteina Glucosa 13.0 5.0 10.0 10.0 1.0

INSTRUCCIONES Suspender 54.8 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar bien y calentar con

agitacin frecuente, hervir 1 o 2

Citrato de hierro y amonio Tiosulfato de sodio Rojo de fenol Agar

0.5 0.3 0.025 15.0

minutos hasta disolucin total. Llenar hasta la tercera parte de los tubos de ensayo. Esterilizar a 121C por 15

minutos. Enfriar en pico de flauta profundo.

pH final: 7.3 0.2

METODOLOGA DE SIEMBRA (PICADURA Y ESTRIA): 1. Identificar los tubos con la cepa correspondiente 2. Inocular tres tubos, cada uno con el microorganismo marcado 3. Incubar los tubos 35 C durante 24 horas 4. Despus de la incubacin, efectuar las observaciones correspondientes y consultar la gua de observacin.

RESULTADOS:
KLIGLER

Lecturas pH H2S Lactosa Glucosa Gas

Cepa 5 negativo Negativo positivo positivo positivo

Cepa 3 negativo positivo positivo positivo negativo

Cepa 6 positivo negativo positivo positivo negativo

Cepa 8 Positivo Negativo positivo Positivo positivo

PRUEBA DEL INDOL: FUNDAMENTO La prueba del indol es una prueba bioqumica realizada en especies bacterianas para determinar la habilidad del organismo de romper el indol del aminocido triptfano. Esta divisin molecular es lograda por una serie de enzimas intracelulares diferentes, un sistema que en conjunto se le llama con frecuencia triptofanasa.

Se genera el indol por una desaminacin reductiva del triptfano via la molcula intermediaria cido indolpirvico. Las triptofanasas catalizan la reaccin de desaminacin, durante el cual se remueve el grupo amino (NH2) de la molcula de triptfano. Los productos finales de la reaccin son el indol, cido pirvico, amonaco (NH3) y energa. Como coenzima de la reaccin se requiere al fosfato de piridoxal.

MATERIAL: 4 tubos por alumno de 12 x 75 con medio MIO o SIM. Cultivo puros de 24 horas de desarrollo

PREPARACION DE MEDIOS MIO Y SIM:

MEDIO MIO: El Medio MIO es utilizado para la diferenciacin de enterobacterias en base a su movilidad, capacidad para descarboxilar la lisina y la produccin de indol. Este medio tambin es conocido como Medio para Movilidad, Indol y Ornitina.

Edered y Clark as como Oberhofer y Hajkowsky desarrollaron el Medio MIO para poder observar las reacciones de movilidad, produccin de indol y descarboxilacin de la lisina simultneamente. Estas reacciones son

determinantes para la identificacin de enterobacterias. En este medio las peptonas proporcionan la fuente de carbono y nitrgeno. El extracto de levadura provee las vitaminas y cofactores requeridos para el desarrollo. La dextrosa proporciona la fuente de energa. El agar es adicionado para demostrar la movilidad. El prpura de bromocresol acta como indicador de cambios de pH facilitando la deteccin de la descarboxilacin de la lisina.

Peptona de Gelatina 10.0 L-Ornitina 5.0 Peptona de Casena 10.0 Dextrosa 1.0 Extracto de Levadura 3.0 Prpura Bromocresol 2.0 Agar Bacteriolgico 2.0 pH 6.5 0.2

de

PREPARACION DEL MEDIO MIO: Suspender 31 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitacin suave hasta su completa disolucin y hervir durante un minuto. Dispensar en tubos de vidrio, tapar y esterilizar en autoclave a 121C (15 libras de presin) durante 15 minutos. Dejar enfriar en posicin vertical.

MEDIO SIM: Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de indol Es til y de para sulfuro diferenciar de hidrgeno de la en familia un mismo tubo.

miembros

Enterobacteriaceae.

El

triptfano de

es muchas

un

aminocido peptonas, y

constituyente

particularmente de la triptena, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina con el aldehdo del reactivo de Kovacs o de Erlich, para originar un compuesto de color rojo. Las cepas mviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen alrededor de la puncin de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de sulfhdrico se distinguen por la formacin de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.

PREPARACION DEL MEDIO SIM FRMULA (EN GRAMOS POR LITRO) INSTRUCCIONES

Triptena Peptona Sulfato de hierro y amonio

20.0 6.1 0.2

Suspender 30 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar hasta disolver; calentar agitando y hervir durante un minuto.

Tiosulfato de sodio 0.2 Agar pH final: 7.3 0.2 3.5

Distribuir unos 4 ml en tubos de hemlisis y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Solidificar en posicin vertical.

METODOLOGIA DE SIEMBRA (AMBOS MEDIOS POR PICADURA):

1. Identificar los tubos con la cepa correspondiente 2. Inocular tres tubos, cada uno con el microorganismo marcado 3. Incubar los tubos 35 C durante 24 horas. 4. Despus de incubacin, efectuar las observaciones correspondientes y consultar gua de observacin.

RESULTADOS: MEDIO SIM LECTURA MOVILIDAD INDOL H2S CEPA 5 Negativo negativo negativo CEPA 6 negativo negativo negativo CEPA 3 positivo negativo positivo CEPA 8 Negativo Negativo negativo

MEDIO MIO SE LE AGREGA REACTIVO DE ERLICH PARA PRUEBA DE INDOL. LECTURA MOVILIDAD INDOL ORNITINA CEPA 5VO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO CEPA 6 NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO CEPA 3 POSITIVO NEGATIVO POSITIVO CEPA 8 POSITIVO NEGATIVO POSITIVO

PRUEBA LCD (MEDIO LIA):

FUNDAMENTO:
Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella spp., basado en la decarboxilacin / desaminacin de la lisina y en la produccin de cido sulfhdrico. En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la produccin de cido sulfhdrico. El purpura de

bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8. Por decarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilacin de la lisina, tiene lugar en medio cido, por lo que es necesaria que la glucosa sea previamente fermentada. Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubacin se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo. La produccin de sulfuro de hidrgeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formacin de sulfuro de hierro. Las cepas de los gneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan la lisina, esto produce un cido alfa-ceto-carbnico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxgeno forma un color rojizo en la superficie del medio.

MATERIAL:

4 tubos con agar LIA Cultivos puros de 24 horas de desarrollo.

PREPARACIN DEL AGAR LIA

FRMULA (EN GRAMOS POR LITRO) Peptona de gelatina 5.0

INSTRUCCIONES Suspender 35 g del medio

deshidratado en un litro de agua Extracto de levadura 3.0 Glucosa Lisina Citrato de hierro y amonio 1.0 10.0 0.5 destilada. Dejar embeber unos 15 minutos. Calentar cuidadosamente,

agitando con frecuencia y hervir durante un minuto hasta la

disolucin completa. Distribuir y esterilizar a 121C durante 15 minutos. Enfriar en Tiosulfato de sodio 0.04 pico de flauta dejando un fondo vertical apto para la puncin. Prpura de bromocresol 0.02

Agar pH final: 6.7 0.2

15.0

METODOLOGIA DE LA SIEMBRA (PICADURA Y ESTRIA): 1. Identificar los tubos con la cepa correspondiente. 2. Inocular tres tubos, cada uno con el microorganismo marcado.

3. Incubar los tubos a 35 C durante 24 horas. 4. Despus de la incubacin, efectuar las observaciones correspondientes y consultar la gua de observacin.

RESULTADOS:

LECTURA LDA LDL

CEPA 5 NEGATIVO DUDOSA

CEPA 6 NEGATIVO NEGATIVO

CEPA 3 NEGATIVO NEGATIVO

CEPA 8 NEGATIVO POSITIVO

PRUEBA ODC: FUNDAMENTO: El Medio MIO es utilizado para la diferenciacin de enterobacterias en base a su movilidad, capacidad para descarboxilar la lisina y la produccin de indol. Este medio tambin es conocido como Medio para Movilidad, Indol y Ornitina.

MATERIAL: 4 tubos de 12 x 75 con medio MIO. Cultivos puros de 24 horas de desarrollo

NOTA: La preparacin del medio MIO se vio previamente.

METODOLOGIA DE LA SIEMBRA (PICADURA):

1. Identificar los tubos con la sepa correspondiente. 2. Inocular tres tubos, cada uno con el microorganismo

marcado. 3. Incubar los tubos a 35 C durante 24 horas. 4. Despus de la incubacin, efectuar las observaciones correspondientes y consultar la gua de observacin.

RESULTADOS: LECTURA MOVILIDAD CEPA 5VO NEGATIVO CEPA 6 NEGATIVO CEPA 3 POSITIVO CEPA 8 POSITIVO

CUADRO REFERENCIAL: