ANALISIS DE FLUJOS METABOLICOS EN BACILLUS SUBTILIS

I. INTRODUCCION.Bacillus subtilis es el microorganismo Gram + mas ampliamente estudiado. Sin embargo, por mucho tiempo se postul que era un microorganismo estrictamente aerobio y por tanto existen relativamente pocos estudios en condiciones anaerbicas e inexistentes en condiciones controladas en fermentadores. Desde el punto de vista cintico, estequiomtrico y energtico no se conoce a detalle como crece y que vas de fermentacin son activas en presencia de nitrato como aceptor de electrones, as mismo no se sabe si esporula o s inicia este proceso en estas condiciones, Durante el crecimiento de B. subtilis en glucosa, sin limitacin de oxgeno, se produce cido actico como subproducto. Esto sucede como respuesta a un exceso en el flujo de entrada de glucosa y por tanto a un incremento en el flujo glicoltico a cido pirvico, el cual la clula es incapaz de utilizar en su totalidad para biosntesis en el ciclo de Krebs (Phalakornkule, et al., 2000; Blencke, et al., 2003). Este fenmeno ocurre cuando existe glucosa en el medio en concentraciones suficientes para controlar, por medio de la protena CcpA (protena de control catablica), regiones reguladoras CRE (elementos de respuesta catablicos) en los promotores de algunos genes entre los cuales estn ackA y pta (acetato cinasa y fosfotransacetilasa) de la va de produccin de cido actico e incluyendo tambin algunos genes de las rutas del catabolismo de la glucosa (Prescan-Siedel et al., 1999). En estudios empleando modelos de flujos metablicos desarrollados para la cepa 168 de B. subtilis, se encontr que en cultivo continuo limitado por glucosa, el flujo de carbono (milimoles de carbono/gClula-h) al travs de la ruta de los cidos tricarboxilicos (TCA) y la sntesis de las enzimas que componen el ciclo, se incrementa conforme aumenta la velocidad de crecimiento, siendo drsticamente reprimidas solamente a velocidades de crecimiento muy altas como las que se observan en el crecimiento por lote (0.6 h-1) y conforme la concentracin de glucosa se incrementa (Goel et al., 1993). La protena CcpA tambin esta involucrada en la fuerte represin que

ocurre en casi todos los genes necesarios para el ciclo de Krebs (Tobisch, et al., 1999). Por medio de la velocidad de crecimiento, de balances estequiomtricos, de consumo de glucosa y la acumulacin de los metabolitos formados en condiciones anaerobias, es posible calcular las velocidades especficas (flujo metablico) y el porcentaje de la fuente de carbono que es catabolizada por la gliclisis y el ciclo de las pentosas, este procedimiento fue inicialmente propuesto por Papoutsakis y Meyer (1985). Haciendo uso de esta metodologa, Bulthuis et al. (1991) cultivando a Bacillus licheniformis en condiciones anaerbicas, por lotes o en continuo, encontraron que hasta un 52 % de la glucosa es metabolizada por la va de pentosas. Figure 1: Metabolic Network of B. subtilis

II.

PROCEDIMIENTOS Y RESULTADOS

1.- Se introdujeron los datos obtenidos de la ruta metabolica de bacillus subtilis en el programa excell.
1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 G6P R5P GAP 3PG PEP Pyr OAA AKG NADH FADH r1 -1 0 2 0 0 0 0 0 0 0 2 r2 0 0 -1 1 0 0 0 0 0 1 0 3 r3 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 0 0 4 r4 0 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 0 5 r5 0 0 0 0 0 -1 1 0 0 1 0 6 r6 0 0 0 0 0 0 -1 -1 0 0 0 7 r7 0 0 0 0 0 0 0 1 0 2 1 8 r8 0 0 0 0 -1 0 0 1 0 0 0 9 r9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 10 r10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 11 r11 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

AcCoA 0

MATRIZ ESTEQUIOMETRIA DE LAS11 REACCIONES

12 G6P R5P GAP 3PG PEP Pyr OAA AKG NADH FADH 1 0 0 0 -1 1 0 0 0 0

13 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

14 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

15 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0

16 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0

17 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0

18 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 -1 0

19 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0

20 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0

21 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0

22 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0

23 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0

AcCoA 0

MATRIZ ESTEQUIOMETRIA DE LAS12 REACCIONES (12 AL 23)

2.-Siguiendo los datos extrados del paso anterior, se dispuso a utilizar el programa Matlab, con el cual se aadieron los siguientes:

3.- Al correr el programa, en comando se obtuvo lo siguiente:

III.

CONCLUSIONES

El calculo de flujos desconocidos se da por la siguiente formula :

En matlab se aplico: % flux calculation qc=-inv_S_C * S_M * qm donde S_c : MATRIZ ESTEQUIOMETRIA DE LAS11 REACCIONES S_M : MATRIZ ESTEQUIOMETRIA DE LAS REACCIONES(12 al 23) Q_M : QUE CONTIENE LOS FLUJOS MEDIDOS El clculo de flujos metablicos es una herramienta de la ingeniera metablica y una determinacin fundamental en estudios cuantitativos de fisiologa celular, ya que permite organizar el conocimiento metablico de un microorganismo en una red de reacciones bioqumicas y provee una medida del grado de ajuste entre varias vas metablicas (Varma y Palsson, 1994; Stephanopoulos y col., 1998; Nielsen, 2001). El grado de ajuste entre vas metablicas se entiende como la produccin de intermediarios en unas y el consumo de los mismos en otras, por ejemplo, cuando las condiciones ambientales cambian los flujos

metablicos son redistribuidos de manera que se mantenga el balance de xido-reduccin en la clula (Varma y Palsson, 1994; Torres y Voit, 2002). Una poderosa herramienta para la determinacin de los flujos en la red de reacciones bioqumicas es el anlisis de flujos metablicos (AFM), en el cual los flujos intracelulares son calculados usando un modelo

estequiomtrico que describe la bioqumica del microorganismo (Jrgensen y col., 1995; Nissen y col., 1997; Stephanopoulos y col., 1998). Sin embargo, ya que el anlisis cuantitativo del metabolismo requiere datos experimentales, es importante que la consistencia de los datos sea

confirmada, antes de utilizarlos en la determinacin de flujos metablicos (Stephanopoulos y col., 1998). En algunos casos, el modelo estequiomtrico y los flujos extracelulares medidos permiten calcular, adems de los flujos intracelulares, flujos extracelulares no medidos o incluso algunos que s fueron medidos pero fueron intencionalmente omitidos en los clculos. En ste ltimo caso, el grado de concordancia entre los flujos medidos y las predicciones del modelo, pueden servir para validarlo.

Se utilizo el comando length que devuelve el nmero de componentes de un vector. Para usar esta funcin debe definir el vector antes de llamar a la funcin, que define la cantidad de elementos mximos que tiene un vector.

Lista de reacciones : Glucose + ATP = glucose-6-P + ADP Glucose-6-P + 2NADP = ribulose-5-P + C02 + 2NADPH Ribulose-5-P = ribose for nucleic acid Ribulose-5-P = 3 fructose-6-P + 5 TP 2 1 Glucose-6-P = fructose-6-P Fructose-6-P + ATP = 2 TP + ADP TP = triglycerides PEP = pyruvate + ATP Pyruvate = AA (from pyruvate pool) Pyruvate = organics (other than acetate) Pyruvate + NAD = ACoA + C02 + NADH ACoA = AA (from ACoA pool) ACoA = membrane ACoA + ADP = acetate + ATP ACoA + OM = isocitrate Isocitrate + NADP = a-KetoG + C02 + NADPH a-KetoG = AA (from a-KetoG pool) a-KetoG + FAD + GDP + 2NAD = OAA + C02 + FADH + GTP + 2NADH

OAA = NA (from OAA pool) OAA = AA (from OAA pool) Pyruvate + C02 = OAA NADH + 1.3 ADP + iy = 1.3 ATP + NAD FADH + ;(1.3 ADP) + 502 = ;(1.3 ATP) + FAD Las especies consideradas son las siguientes: Glucose Glucose 6-P Ribulose 5-P NA (from ribose) Fructose 6-P Cell wall AA (from Glucose pool) TP Triglycerides PG AA (from PG pool) NA (from PG pool) PEP AA (from PEP) Pyruvate AA (from pyruvate) IV. Organics (other than acetate) ACoA AA (from ACoA pool) Membrane Acetate Isocitrate a-KetoG AA (from a-KetoG pool) OAA Nucleic acid (from OAA pool) NADPH NADH FADH C02 02

REFERENCIAS

- Aiba, S., Matsuoka, M. 1979. Identification of metabolic model: Citrate production from glucose by Candidu lipolytica. Biotechnol. Bioeng. 21: 1373-1386. - Bailey, JE 1991. Towards a science of metabolic engineering. Science 252: 1668- 1675