Temas Acidos Nucleicos

Tema 4
Estructura primaria de cidos nucleicos

4.1 4.2 4.3 Aspectos generales .......................................................................................................................................................... 31 4.1.1 Niveles estructurales ........................................................................................................................................... 32 Estructura primaria .......................................................................................................................................................... 32 Formas de representacin lineal ..................................................................................................................................... 32 4.3.1 Frmula completa ................................................................................................................................................ 32 4.3.2 Representaciones esquemticas ......................................................................................................................... 33 4.3.3 Representaciones abreviadas ............................................................................................................................. 33 Dos tipos de cidos nucleicos segn su composicin.................................................................................................. 33 Propiedades fisicoqumicas de los cidos nucleicos .................................................................................................... 34 4.5.1 Propiedades en disolucin ................................................................................................................................... 34 4.5.2 Reactividad.......................................................................................................................................................... 34 4.5.3 Hidrlisis qumica de cidos nucleicos ................................................................................................................. 35 4.5.3.1 Hidrlisis cida ................................................................................................................................... 35 4.5.3.2 Hidrlisis alcalina ................................................................................................................................ 35 4.5.4 Absorcin en el ultravioleta .................................................................................................................................. 36
4.4 4.5
4.1
ASPECTOS GENERALES
Tradicionalmente se considera que los cidos nucleicos forman parte de los nucleoproteidos, el grupo ms importante de heteroproteidos o protenas conjugadas, entre los que tambin se incluyen glicoproteidos y lipoproteidos y, en ocasiones, tambin fosfoproteidos y cromo- o metaloproteidos. Efectivamente, los nucleoproteidos resultan de la interaccin, mediante enlaces electrostticos fuertes, de los residuos bsicos (catinicos) de ciertas protenas (histonas, protaminas) y los grupos fosfato (aninicos) del cido nucleico. El estudio detenido de estas asociaciones nucleoproteicas se har una vez conocida la estructura de los cidos nucleicos a todos sus niveles. Por su composicin qumica elemental (C, H, O, N y P), derivada de la presencia exclusiva de nucletidos en su estructura, los cidos nucleicos se diferencian de las protenas, esencialmente, en su mayor contenido de fsforo (10%) y en la ausencia total de azufre.
Localizacin Eucariotas DNA Procariotas Virus
Funcin
en ncleo celular (varios en la zona nucleoide del dentro de la Depositario y transmisor de la cromosomas), en matriz citosol (un cromosoma y cpsida (slo en informacin gentica, organizada en mitocondral y en estroma de varios plsmidos) algunos tipos de genes que codifican productos cloroplastos virus) gnicos (protenas o RNAs) en ncleo celular (temporalmente), en citosol, en matriz mitocondrial y en estroma de cloroplastos en citosol dentro de la Interviene en la transmisin de la cpsida (en otros informacin desde el DNA hasta los tipos de virus) productos gnicos
RNA
Existen dos tipos de cidos nucleicos, denominados ribonucleico o RNA y desoxirribonucleico o DNA, que difieren en los nucletidos componentes. Antes de describir su estructura, recordemos brevemente que ambos cidos nucleicos se encuentran en todo tipo de clulas, tanto procariotas como eucariotas; como excepcin, los virus contienen slo DNA o slo RNA. En todos los casos, sus diversas funciones en la transmisin y expresin de la informacin gentica vienen determinadas por su localizacin subcelular y su estructura de orden superior (conformacin tridimensional).
4.1.1
Niveles estructurales
Desde un punto de vista estructural, en los cidos nucleicos se pueden considerar varios niveles, similares en cierto modo a los descritos tradicionalmente para protenas: Estructura primaria, descrita por la unin de numerosos nuclesidos mediante enlaces fosfodister, dando lugar a un polmero lineal. El orden de los nuclesidos (o sus bases) en la cadena define la secuencia del cido nucleico. Estructura secundaria, con la que se inicia el anlisis espacial de la molcula, correspondiente a la conformacin local, es decir, la
32
ESTRUCTURA PRIMARIA DE CIDOS NUCLEICOS
disposicin relativa de nucletidos que estn prximos en la secuencia. Para el DNA este nivel estructural viene definido por la asociacin de dos cadenas polinucleotdicas a travs de las bases nitrogenadas que sobresalen del esqueleto azcar-fosfato. En el RNA slo se presenta en determinadas regiones de la molcula. Estructuras de orden superior: Se engloban bajo este trmino genrico todas aquellas estructuras tridimensionales que surgen a partir de los niveles primario y secundario. En eucariotas son complejas, variables y en ocasiones escasamente conocidas. En el caso del DNA pueden incluirse aqu las estructuras resultantes del superenrollamiento y de la asociacin con protenas bsicas para formar la cromatina. Sin embargo, y a diferencia de lo que ocurre en protenas, en general la estructura adoptada a este nivel no viene determinada por las de los niveles inferiores. En el caso de algunos RNAs (especialmente los tRNAs) se observa un plegamiento tridimensional bien definido, equiparable a la estructura terciaria de las protenas. Aun en este caso, no se observa una estructura cuaternaria, ya que dicho plegamiento slo afecta a una molcula y no a varias asociadas entre s, como en las protenas.
4.2 ESTRUCTURA PRIMARIA

La estructura primaria, comn para DNAs y RNAs, consiste en la presencia de cadenas, generalmente largas, de carcter macromolecular, formadas por la unin de nuclesidos mediante enlaces covalentes 3-5-fosfodister. Por tanto, la unidad monomrica es el nucletido, o nuclesido-monofosfato (generalmente contemplado como 5-NMP). Los cidos nucleicos son, por tanto, polmeros de nucletidos o polinucletidos, con un esqueleto lineal formado por unidades alternas de fosfato y pentosa (parte constante de la secuencia), del cual sobresalen lateralmente las bases (parte variable, que define la secuencia), unidas al azcar respectivo por enlaces N-glicosdicos. Por convenio, la secuencia siempre se indica en direccin 5 - 3, es decir, con el extremo 5' terminal (5-P) a la izquierda y el extremo 3 terminal (3-OH) a la derecha. CU CU co en c3 d <U c/2 a 3 CU t/3 c3 JD
5\..-P-osa-P-osa-P-osa-P-osa-... 3
Dentro de este nivel estructural se estudiarn a continuacin las distintas formas de representacin, las diferencias en composicin qumica de los dos tipos de cidos nucleicos y sus propiedades fisicoqumicas ms representativas.
JO
4.3 FORMAS DE REPRESENTACIN LINEAL

Pueden emplearse hasta 6 niveles, de simplificacin creciente. En general, se hace uso de la letra inicial de las bases, en maysculas, para representar a stas o a sus nuclesidos. El cido nucleico propuesto como ejemplo es un RNA (azcar: ribosa y bases: A, G, U y C), pero las representaciones son igualmente vlidas para un DNA (azcar: desoxirribosa y bases: A, G, T y C).
4.3.1
Frmula completa
Por razones de espacio y fundamentalmente didcticas, es aconsejable comenzar con una representacin vertical del esqueleto del cido nucleico (notacin 1 en la figura), que permite apreciar con detalle los enlaces fosfodister entre nuclesidos consecutivos (uniones azcar-fosfato) y la situacin perpendicular al esqueleto de los enlaces N-glicosdcos (uniones azcar-base). Para mantener la orientacin 5 -* 3, se sita el extremo 5-P en la parte superior y el extremo 3-OH en la inferior.
DOS TIPOS DE CIDOS NUCLEICOS SEGN SU COMPOSICIN
33
Ejemplo: un tetranucletido
constante)
y variable)
4.3.2
Representaciones esquemticas
Como peculiaridad de esta representacin, el anillo furansico del azcar se simplifica mediante un solo trazo vertical, cuyo extremo superior corresponde al C-1 y el inferior al C-5 (notacin 2 en la figura). En una forma an ms simple se omiten los fosfatos intermedios y la numeracin de los azcares (notacin 3).
4.3.3
Representaciones abreviadas
La simplificacin se puede aumentar indicando cada nuclesido mediante la letra inicial de su base nitrogenada (lo nico variable en la secuencia). El polinucletido queda as reducido a una sucesin de letras maysculas intercaladas con letras p minsculas (notacin 4). El extremo 5-P (a la izquierda) viene representado por una letra p seguida por la letra del primer nuclesido. El extremo 3-OH, a la derecha, viene dado por la letra del ltimo nuclesido. Los nuclesidos intermedios llevan la p a izquierda y derecha, correspondientes a las posiciones 5 y 3, respectivamente. En la descripcin cotidiana de secuencias de cidos nucleicos se suprimen las letras p intermedias, con lo que la representacin se reduce a una secuencia de letras precedida por una letra p para el fosfato en el extremo 5 (notacin 5), o se asume la presencia del fosfato en 5 y se omite incluso esa primera p (notacin 6).
4.4
DOS TIPOS DE CIDOS NUCLEICOS SEGN SU COMPOSICIN

Tipo de cido nucleico: /lonmeros: O (U * C
cido ribonucleico (RNA) Ribonucletidos
cido desoxirribonucleico (DNA) Desoxirribonuclctidos
Fosfato Azcar Purinas
enlazando los monmer os (enlace fosfodister)
Ribosa
2-Desoxirribosa
Adenina, A (6-aminopurina) Guanina, G (2-amino-6-oxopurina) Citosina, C (2-oxo-4-aminopirimidina) Uracilo, U (2,4-dioxopirimidina) Timina, T (5-metiluracilo)
o " O O Pirimidinas G O C/J Cu Q O O
34
Segn la notacin de frmula completa, la representacin de ambos cidos nucleicos es la siguiente:
RNA
DNA
4.5
PROPIEDADES FISICOQUMICAS DE LOS CIDOS NUCLEICOS
Los cidos nucleicos presentan propiedades importantes en relacin con sus funciones de almacenamiento, transmisin (replicacin) y expresin (transcripcin y traduccin) de la informacin gentica. Se comentan aqu brevemente algunas de ellas, relacionadas con la estructura, y el resto se irn estudiando a medida que surja su aplicacin al propio estudio de estas molculas (por ejemplo, la renaturalizacin de un DNA desnaturalizado se analizar como fundamento de la hibridacin).
4.5.1
Propiedades en disolucin
Las cadenas polinucleotdicas de DNA y RNA son hidroflicas, debido a la posibilidad de formacin de enlaces de hidrgeno con el agua por parte de los numerosos grupos fosfato y -OH libres del azcar a lo largo del esqueleto. Por otro lado, a pH fisiolgico los grupos fosfato (pK a prximo a 6) se ionizan casi por completo, haciendo que las molculas de DNA y RNA se comporten como cidos y tengan numerosas cargas negativas. Debido a este carcter polianinico, los cidos nucleicos se encuentran casi siempre neutralizados por interaccin inica con las cargas positivas de otras molculas. Concretamente, el DNA del genoma nuclear eucaritico se encuentra unido a histonas, protenas ricas en Arg y Lys, cargadas positivamente a pH fisiolgico, dando lugar a nucleoproteidos; la importancia de esta asociacin se considerar posteriormente (pg. 84). En los espermatozoides, el papel de las histonas es desempeado por pequeas protenas ricas en Arg, llamadas protaminas y tambin con fuerte carga positiva. En otras ocasiones, el DNA se une a poliaminas (principalmente espermina y espermidina, as llamadas por haber sido detectadas originalmente en el semen), distribuidas ampliamente pero de forma especial en algunos virus y bacterias en estado de rpida proliferacin. As, por ejemplo, en el fago T 4 las poliaminas neutralizan un 40% de la carga negativa total del DNA, estabilizando su conformacin. Por ltimo, como resultado experimental de esta propiedad, la cristalizacin de cidos nucleicos se facilita si su carga negativa se compensa por la unin de iones metlicos. Debido a la relativa rigidez de la molcula (en doble hlice) y a su inmensa longitud en relacin al dimetro, las soluciones de DNA son muy viscosas. Esta propiedad tiene inters en relacin con el estudio del proceso de desnaturalizacin (pg. 165).
4.5.2
Reactividad
En general, los cidos nucleicos son qumicamente muy estables, especialmente en el caso del DNA. Ello se debe a que la desoxirribosa carece de grupos reactivos: el 4-OH est comprometido en el cierre del anillo, y los 3-OH y 5- OH estn formando enlaces fosfodister. El RNA es algo ms reactivo, gracias a los grupos 2 -OH, lo que se refleja en sus propiedades, por ejemplo, su hidrlisis en medio alcalino, como se ver a continuacin.
PROPIEDADES FISICOQUMICAS DE LOS CIDOS NUCLEICOS
35
4.5.3 4.5.3.1
Hidrlisis qumica de cidos nucleicos Hidrlisis cida
Los cidos fuertes escinden tanto los enlaces fosfodister entre nuclesidos como los enlaces N-glicosdicos de cada nucletido. Por tanto, sirven para analizar la composicin de bases de un cido nucleico, pero no para determinar su secuencia. DNA se hidrolizan? RNA Enlaces N-glicosdicos (en cada nuclesido) s s (todos o purinas)
Enlaces fosfodister (entre nuclesidos) s no
Enlaces fosfodister (entre nuclesidos) s no
Enlaces N-glicosdicos (en cada nuclesido) s s (todos o purinas)
Medio cido fuerte (p.ej., HCI 1M) Medio cido dbil
Los cidos dbiles respetan los enlaces fosfodister, pero tienden a romper la unin N-glicosdica. Este enlace es ms lbil con purinas que con pirimidinas, por lo que se puede conseguir (por ejemplo, a pH=3) escindir selectivamente las bases purinicas, dando lugar a los denominados cidos apurnicos. Esta hidrlisis es de cierto inters para estudiar parcialmente la secuencia del DNA. Con el mismo fin, tambin se han preparado cidos nucleicos apirimidnicos, por eliminacin selectiva de las pirimidinas bajo condiciones qumicas diferentes.
CU
P_
OH
-P-dRib-P-dRib-P-dRib-P-dRib-P-dRib-P-dRib-P-dRibcido nucleico
hidrlisis cida
pH=3 otras condiciones
apurnico
OH
CU
OH
CU
CU
CU
CU
-P-dRib-P-dRib-P-dRib-P-dRib-P-dRib-P-dRib-P-dRibcido nucleico normal 3 0p.' 3 Ph 3 P- -.

3
...-P-dRib-P-dRib-P-dRib-P-dRib-P-dRib-P-dRib-P-dRibcido nucleico apirimidinico
4.5.3.2
Hidrlisis alcalina
El medio bsico afecta de distinta manera a los enlaces fosfodister, hidrolizando los del RNA pero no los del DNA; los enlaces N-glicosdicos son resistentes. DNA Enlaces Enlaces se hidrolizan? fosfodister N-glicosdicos ____________________ (entre nuclesidos) (en cada nuclesido) Medio alcalino no no RNA Enlaces Enlaces fosfodister N-glicosdicos (entre nuclesidos) (en cada nuclesido) s no
El RNA se hidroliza rpidamente, liberando sus nucletidos, en disoluciones diluidas de NaOH (pH 11), sin afectar a los enlaces N-glicosdicos. La hidrlisis de los enlaces azcar-fosfato se debe a la implicacin directa de los grupos 2 -OH de la ribosa en la catlisis qumica. Se forman as NMPs 2,3-cclicos como productos intermedios, que son hidrolizados rpidamente en el medio alcalino, al azar a uno u otro lado del enlace 2,3-fosfodister, para dar una mezcla de los 2-NMPs y 3-NMPs.
36
base base base base

Ejemplo de hidrlisis alcalina de un RNA hipottico formado por cuatro nucletidos (un tetrarribonucletido)
^>O
n nucletidos intermedios
extremo 5
base
nuclesido3\5-bsfosfato
HOH baSe HOH
nuclesido
-o-V_
X) OH
HO.
nuclesido-2-monofosfato (2-NMP)
/ \r +
base
n molculas (con distintas bases) de nuclesido-2\3-monofosfato cclico (2,3-cNMP)
nuclesido-3-monofosfato (3-NMP)
HO
El DNA, al contrario que el RNA, es resistente a la hidrlisis en medio alcalino. Ello se debe a la ausencia de grupos 2 -OH en las unidades de desoxirribosa, lo que impide el mecanismo expuesto anteriormente.
4.5.4
Absorcin en el ultravioleta
La similitud en el valor mximo de absorbancia de las distintas bases (pg. 17) puede utilizarse no slo para detectar y cuantficar las bases, los nuclesidos y los nucletidos, sino especialmente para determinar la concentracin de los cidos nucleicos. De hecho, es el procedimiento comnmente utilizado, a pesar de no ser el ms exacto. Basta con medir el valor de A 26o en una disolucin diluida, suficientemente transparente, de DNA o RNA para poder calcular su concentracin. Sin embargo, es conveniente la realizacin de algunos controles, teniendo en cuenta especialmente la posible contaminacin con protenas, cuya presencia contribuye a la absorcin y, por tanto, interfiere en esta determinacin. Efectivamente, aunque los mximos de absorcin son caractersticos de cada uno de estos compuestos (260 nm para cidos nucleicos y 280 nm para protenas), ambos absorben en cierta medida a las dos longitudes de onda. Por ejemplo, la absorbancia de protenas a 260 nm es, para igual concentracin, unas 20 30 veces inferior a la de los cidos nucleicos. En la prctica, teniendo en cuenta esta situacin, se deben emplear ambos valores de absorbancia (A 260 y A28o) para poder corregir la interferencia mutua y as determinar correctamente las concentraciones de cido nucleico y de protena.
Tema 5
Estructura secundara del B-DNA

5.1 Proporcin de bases nitrogenadas: Reglas de Chargaff ............................................................................................... 5.1.1 Algunas relaciones entre bases son iguales en todas las especies ...................................................................... 5.1.1.1 Relacin entre bases.......................................................................................................................... 5.1.1.2 Relacin entre purinas y pirimidinas ................................................................................................... 5.1.1.3 Relacin entre aminobases y oxobases ............................................................................................. 5.1.2 Otras relaciones son diferentes segn la especie................................................................................................. Modelo de Watson y Crick: forma B del DNA ................................................................................................................. 5.2.1 Complementariedad de las bases nitrogenadas ................................................................................................... 5.2.1.1 Consecuencias de la complementariedad .......................................................................................... 5.2.1.2 Efecto del pH sobre el apareamiento de bases .................................................................................. 5.2.2 Geometra de los pares de bases ........................................................................................................................ 5.2.3 Antiparalelismo de las dos hebras ........................................................................................................................ 5.2.4 Diferencias en la secuencia de ambas hebras ..................................................................................................... 5.2.5 Helicidad y carcter dextrgiro ............................................................................................................................ 5.2.6 Parmetros cuantitativos de la doble hlice ........................................................................................................ 5.2.7 Carcter antiptico y estabilidad de la doble hlice ............................................................................................. 5.2.7.1 Situacin de los fosfatos y carcter hidroflico .................................................................................... 5.2.7.2 Coplanariedad, apilamiento de las bases y carcter hidrofbico ......................................................... 5.2.8 Superficie de la molcula: surcos en el DNA ....................................................................................................... 5.2.9 Significado biolgico: idoneidad para la replicacin .............................................................................................. 38 38 38 38 39 39 39 39 41 42 43 44 44 45 46 47 47 48 48 49
5.2
El anlisis por difraccin de rayos X ha influido notablemente sobre el conocimiento de la estructura secundaria del DNA. Desde Estructura helicoidal en sus inicios se observaron, incluso en muestras impuras de DNA disuelto, seales Periodicidad a 0,34 nm X) que correspondan a un espaciado regular de 0,34 nm a lo largo de las fibras de DNA. En los aos 50 se obtuvieron datos ms precisos, con muestras de DNA Periodicidad ms puro y haciendo uso de los mtodos de difraccin de rayos X, que ya se haban desarrollado para el estudio estructural de protenas. A partir de los correspondientes patrones de difraccin, donde las manchas centrales en forma de aspa indican una estructura en hlice y las bandas intensas en la parte superior e inferior indican la repeticin peridica de estructuras, se concluy que la molcula de DNA estaba formada por dos cadenas, con una disposicin helicoidal y con una doble periodicidad a lo largo del eje de la hlice, cada 0,34 nm y cada 3,4 nm. Por otra parte, la qumica de nucletidos permita conocer la existencia de interacciones hidrofbicas por apilamiento, as como la asociacin mediante puentes de hidrgeno (apareamiento). Todos estos datos experimentales, junto con el anlisis de la proporcin de las bases constituyentes de la molcula, cuyas conclusiones se exponen a continuacin, y la construccin de modelos moleculares, sirvieron de base para la propuesta por Watson y Crick de la estructura de doble hlice, cuya descripcin es el objeto principal de este tema.
38
ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL B-DNA
5.1
PROPORCIN DE BASES NITROGENADAS: REGLAS DE CHARGAFF
A pesar de que la composicin de bases puede parecer un aspecto ligado a la estructura primaria, su estudio se hace en este tema por estar directamente relacionada con la estructura secundaria del DNA. En un principio se crey que el DNA estaba formado por cantidades iguales de los cuatro nucletidos A, G, C y T, y que la unidad fundamental era el tetranucletido, hasta que Erwin Chargaff, entre otros, observ distintas proporciones de los 4 nucletidos en diversos organismos. Concretamente, los DNAs aislados a partir de clulas o tejidos diferentes de distintos individuos, dentro de una misma especie, presentan idntica composicin de bases, que adems no cambia con la edad, estado nutricional o variaciones del entorno. La composicin del DNA es, por tanto, caracterstica de cada especie. A partir de esos datos se formularon unas reglas o generalizaciones cuantitativas sobre la composicin de bases del DNA, que fueron la clave para deducir su estructura en doble hebra. Composicin de bases Relacin entre bases Purinas/ Pirimidinas A+G T+C 1,03 1,03 1,02 0,97 1,05 1,02 1,02 1,03 1,07 1,04 1,00 1,02 0,95 1,00 Relacin de asimetra A+T G+C 1,52 1,36 1,36 1,38 1,33 1,43 1,85
(% moles)
A T G C Adenina Timina Guanina Citosina Animales: Hombre Oveja Rata Gallina Tortuga Salmn Erizo de mar Bacterias: Escherichia coli Staphylococcus aureus Chlostridium perfringens Brucella abortus Sarcina ltea Virus: Fago (j)174 (monofilar) Fago (|)174, forma replicativa (bifilar) 30,9 29,3 28,6 28,8 29,7 29,7 32,8 24,7 30.8 36.9 21,0 13,4 24,3 26,3 29,4 28,3 28,4 29,2 27,9 29,1 32,1 23,6 29.2 36.3 21,1 12,4 32,7 26,4 19,9 21,4 21,4 20,5 22,0 20,8 17,7 26,0 21,0 14,0 29,0 37,1 24,1 22,3 19,8 21,0 20,4 21,5 21,3 20,4 17,3 25,6 19,0 12,8 28,9 37,1 18,5 22,3
A_
T 1,05 1,04 1,01 0,99 1,06 1,02 1,02 1,05 1,05 1,02 1,00 1,08 0,74 1,00
G C 1,01 1,02 1,05 0,95 1,03 1,02 1,02 1,02 1,11 1,09 1,00 1,00 1,30 1,00
>1
) J
0,94 \ 1,50 2,73 0,73 0,35 1,34 1,18
5.1.1
Algunas relaciones entre bases son iguales en todas las especies
A pesar de que la composicin vara entre especies, en todas ellas se cumplen ciertas relaciones entre las bases, formuladas como las tres primeras reglas de Chargaff, que se exponen a continuacin.
5.1.1.1
Relacin entre bases Aa ST G* C > Razn A/T T/A 1 Razn G/C* C/G * 1
En prcticamente todas las especies, el contenido de A se aproxima al de T, y el contenido de G al de C:
Esta observacin fue esencial para que Watson y Crick postulasen los pares AT y GC, que definen la complementariedad de bases en el DNA de doble hebra. Hay que destacar que esta regla no se cumple para las pocas especies cuyo material gentico est formado por RNA o DNA de hebra sencilla (comprense en la tabla los ejemplos del virus 4174, en sus formas de hebra sencilla y de doble hebra).
5.1.1.2
Relacin entre purinas y pirimidinas
Como consecuencia de lo anterior, el contenido de bases purnicas (A + G) se aproxima al de bases pirimidnicas (T + C), es decir, hay un 50% de purinas y un 50% de pirimidinas:
A+G 8 a T+C purinas pirimidinas 5.1.1.3
w 50% -> 50% ->
Razn (A+G) / (T+C) a 1 Razn purinas / pirimidinas 1
Relacin entre aminobases y oxobases
Al observarse que A/T = C/G = 1, tambin se ha de cumplir (por razones estrictamente matemticas) que (A+C) / (T+G)= 1. Por tanto, puede concluirse, como relacin adicional (sin un significado especial), que: 6-aminopurinas (A) + 4-aminopirimidinas (C) = 6-oxopurinas (G) + 4-oxopirimidinas (T)
MODELO DE WATSON Y CRICK: FORMA B DEL DNA
39
5.1.2
Otras relaciones son diferentes segn la especie

A+TG+C
Otras relaciones entre bases no se mantienen constantes entre especies; de entre ellas, resulta til la denominada razn de asimetra: que, adems de tener un valor diferente para cada especie, no se aproxima a la unidad como las razones anteriores (ver tabla). Por ejemplo, en animales la razn de asimetra es siempre superior a uno; lo mismo ocurre en plantas superiores y hongos. Por contraste, en bacterias y virus los valores son mucho ms variados, superiores o inferiores a la unidad. La razn de asimetra puede tambin calcularse directamente a partir del contenido en G+C, parmetro habitual en otros tipos de estudio, como la desnaturalizacin del DNA:
, . . _ A + T %(A+T) 100 - %(G+C) razn de as.metna =
= .(oVc)
De acuerdo con ello, los animales, plantas superiores y hongos muestran un exceso de A+T (50-65%) sobre G+C (50-35%), mientras que en bacterias y virus se aprecia la gran variabilidad en G+C (75-25%).
A+T
0.25 0.43 0.66 80 70 60 1 50 1.5 40 2.33 30 4
G+C
20 % G+C
Virus Bacterias
H0n80S
Protozoos
Plantas s|periores y Animales
En resumen, con estos estudios se ha observado que los DNAs de especies evolutivamente relacionadas tienen una razn de asimetra similar, mientras que las especies muy alejadas tienden a tener una razn diferente. A pesar de ser sta la menos conocida de las reglas de Chargaff, el hecho de que permita distinguir entre especies hace que pueda utilizarse como criterio en las relaciones evolutivas y las clasificaciones taxonmicas de los organismos.
5.2
El modelo tridimensional, como estructura de referencia para las propiedades del DNA, fue postulado por James Watson y Francis Crick en 1953. Corresponde a la actualmente denominada forma B del DNA, la ms comn en las clulas y la ms estable de todas las que puede adoptar un DNA bajo condiciones fisiolgicas. Este modelo se bas tanto en las observaciones por rayos X como en las reglas de Chargaff y, por tanto, est de acuerdo con ellos, as como con otros estudios realizados mediante un gran nmero y variedad de tcnicas. Simultneamente se propuso la adecuacin del modelo a la funcionalidad de la molcula de DNA para la conservacin y transmisin de la informacin gentica (pg. 49). Presenta las siguientes caractersticas bsicas:
5.2.1
Complementariedad de las bases nitrogenadas
La estructura qumica de las bases permite la formacin de enlaces por puente de hidrgeno (dos tomos electronegativos, como N y O, comparten un tomo de hidrgeno). En concreto, dos nucletidos pueden interaccionar de forma especfica mediante dichos enlaces y se habla de bases complementarias, pares de bases o apareamiento de bases.
40
Para una mejor comprensin de la complementariedad, es conveniente establecer unos criterios previos en cuanto a la escritura de los nucletidos en cada pareja de bases. Se trata con ello, simplemente, de facilitar la descripcin de unas estructuras relativamente complejas:
Frmulas de partida (las usadas anteriormente):
F Frmulas con la base girada 180 alrededor del enlace N-glicosdico, con el aire fin de destacar el carcter donador o aceptor para la formacin de puentes de hidrgeno:
Frmulas giradas 180 sobre s mismas:
NH2
"O
Donador de SI Aceptor de H (Aceptor de H)
Aceptor de H |-
(HjC)
T/
NO
Donador de H
UN O^
(CH j)
(Aceptor de H)
Aceptor de M Donador
JW <y
NH, O N' O
UX,.
NNI H
de H Donador de
H- .11 N I-L H N Doiiador de H

Aceptor de H i
1
NO
Aceptor de H
Esta disposicin, con la base Esta disposicin, con la base sobre el azcar, se denomina alejada del azcar, se denomina confonnacin sin conformacin anti
Sigue siendo conformacin anti
Al representar un par de bases, se emplea la frmula de tipo 2 para el nucletido situado a la izquierda, y la de tipo 3 para el situado a la derecha (ambas conformacin anti) Adenina y Timina (o Uracilo) pueden formar 2 enlaces por puente de hidrgeno: O del grupo C=0 en C-4 de T con H del grupo NH2 en C-6 de A H en N-3 de T con N-l de A
frmula segn criterio (2)
T/U
Guanina y Citosina pueden formar 3 enlaces por puente de hidrgeno: II del grupo NH2 en C-4 de C con O del grupo C=0 en C-6 de G N-3 de C con HenN-ldeG O del grupo C=0 en C-2 de C con H del grupo amino en C-2 de G
Las interacciones ptimas se forman entre G y C (tres enlaces de hidrgeno) y entre A y T, o bien A y U (dos enlaces de hidrgeno). El par G=C establece as una interaccin ms fuerte que el par A=T (en el DNA) o el par A=U (en el RNA). Obsrvese que siempre se forma un enlace de hidrgeno entre los dos tomos de N nucleares, mientras que los restantes se forman entre un grupo amino exocclico y un grupo carbonilo. Son tambin posibles otros apareamientos entre bases, denominados de tipo Hoogsteen, que aparecen menos frecuentemente y no forman parte del B-DNA. Por ejemplo, en el RNA (pg. 73), en las triples hlices de DNA o RNA (pg. 60) y en la interaccin codn-anticodn (pg. 296).
5.2.1.1
Consecuencias de la complementariedad
Gracias a la complementariedad descrita, dos cadenas polinucleotdicas se pueden asociar siempre y cuando todas sus bases sean complementarias. Este apareamiento completo de las dos cadenas da lugar a un cido nucleico de doble hebra o doble cadena, estructura habitual del DNA. Esto quiere decir que siempre que en un DNA exista A, G, C o T en una cadena, se encontrarn T, C, G y A, respectivamente, en la otra. Es importante destacar que la complementariedad entre las dos hebras del DNA es fundamental para su papel como portador de la informacin gentica. Por un lado, porque se reduce la posibilidad de que las bases se modifiquen qumicamente. Por otro, porque se facilita la correccin de mutaciones y de errores producidos durante la replicacin del DNA. Finalmente, porque la informacin est en cierto modo duplicada, aunque las secuencias de ambas hebras son diferentes entre s (pg. 44). Adems, la existencia de la complementariedad explica las reglas de Chargaff (pg. 38), y justifica dos caractersticas estructurales importantes, la helicdad y el antiparalelismo, que se estudian ms adelante.
42
!0g0sm0mimmm www m

.TWMTjnOTrrffrrffflnrff^n(MaMWMwmgtwOTirMaTffiw^^
Ilustracin, mediante un ejemplo hipottico basado en la composicin del DNA humano, de cmo la doble hebra del DNA permite explicar las reglas de Chargaff: Composicin de bases bases % moles en % moles en % moles en la hebra 1 y sus hebra 2 y sus doble hebra y sus cocientes cocientes cocientes Regla de Chargaff correspondiente:
A T G C A+G =purinas C+T =pirimidinas purinas / pirimidinas A+C = aminobases G+T = oxobases amino / oxobases
32 28 25 15 57 43 1,33 47 53 1,08
28 32 15 25 43 57 0,75 53 47 0,92
30 30 20 20 50 50 1,0 50 50 1,0
Relacin entre bases individuales: A=T, C=G
Relacin entre purinas y pirimidinas: A+G / C+T = 1 Relacin entre aminobases y oxobases =1
El aparcamiento implica que el contenido de una base en una hebra ha de ser igual al de su base complementaria en la otra hebra. Por ello, las reglas de Chargaff se cumplen cuando se considera la composicin total del DNA de doble hebra, pero no para cada hebra por separado, ya que en este caso, A * T y C * G. Tampoco se cumplen las reglas en los cidos nucleicos de cadena sencilla (p.ej., RNA y DNA vrico), donde A * U, A^T y C^G.
5.2.1.2
Efecto del pH sobre el apareamiento de bases
Los cambios de pH, al afectar a la ionizacin de los grupos funcionales de las bases nitrogenadas y al equilibrio de tautmeros, modifican las posibilidades de formacin de enlaces de hidrgeno y, por tanto, el apareamiento de bases.
T-A U-A
<HlC>
W> ........H-/
(H,C
W ............ V Q-H .............. /lN
(HjC) /" N N V-V5 ...... " t^\ ,/ N 'N

0
pH3 C-G H /N~h ..... C) N.

O n ' o ...........h^
pH7 H /N~H ---- O N. <3............ -/~p n ............ _,K \ H H
pH12 yN~H ... -o N

<\ ri ............ '
\ H
\ H
(cada base tiene otras formas resonantes y tautomricas, no indicadas) Como consecuencia, a valores de pH inferiores o superiores al fisiolgico el menor nmero de enlaces de hidrgeno posibles provoca la separacin de las hebras componentes del DNA, fenmeno denominado desnaturalizacin (pg. 164). No debe confundirse este efecto con la hidrlisis cida o alcalina, bajo condiciones ms extremas, de las cadenas de cido nucleico (pg. 35).
43
5.2.2
Geometra de los pares de bases
A pesar de la dificultad de visualizar la geometra de un par de bases en ausencia de un modelo cercano a la realidad (modelo tridimensional, sea material o informtico), se describe a continuacin de la forma ms fiel posible. La formacin de un enlace de hidrgeno requiere que los tres tomos implicados (dos electronegativos y un H) se siten sobre una lnea recta. Esta condicin slo se puede cumplir cuando los dos enlaces N-glicosdicos de los nuclesidos complementarios forman un ngulo, inferior a 90, con la lnea imaginaria que une los C-1 de ambas pentosas. Esta geometra del par de bases determina la disposicin espacial relativa de las dos hebras en el DNA (helicidad) y es la causa a nivel molecular de la presencia de surcos menor y mayor en su estructura tridimensional; ambos aspectos se analizan en detalle ms adelante (pgs. 45 y 48).
representacin bidimensional del par de bases
modelos tridimensionales del par de nucletidos (no se muestran los H)

4. w
K0,28 .
*. ^ #40}
nm mj H, 8- 5+ H 0 ........ -h-n n
^ jt^ ,t p
^
,A:..
........................ ^Ti %r
desoxirribosa casi perpendicular a la base (el O anular queda hacia delante y el P-5 hacia atrs, respecto al plano del papel)
1,11 nm ---------------- \
-----
desoxirribosa casi perpendicular a la base (el O anular queda hacia atrs y el P-5 hacia delante respecto al plano del papel)
i ~ nm 5
: G ^ ^ ............................................................................................. *,
_ _ _ _> -h.......................5 onu^
I*-
H->NV\
52
t mn
nm
U__0,2 9 _.N\
~~f'
H " "
fm . V.
A3
a
M enlace de H
0,3 distancia P-P a 1,8 nm
distancia C1 -CP 1,08 nm --------------- w 1,1 nm
En conclusin: Todos los pares de bases presentan una geometra similar, definida por: longitud de los enlaces de hidrgeno separacin entre las pentosas de ambos nucletidos ngulo entre los enlaces glicosdicos y la lnea Cl-Cl
Una vez establecidos los enlaces de hidrgeno mltiples, las distancias entre los tomos que los forman son prcticamente iguales para todos los casos. Igualmente, al aparearse siempre una purina con una pirimidina, la separacin entre las pentosas de ambas hebras tambin se mantiene constante. Slo de esta manera (distancia constante entre las hebras, independientemente de su secuencia) es posible la asociacin continua de las dos cadenas para formar una molcula de DNA doble.
44
5.2.3
Antiparalelismo de las dos hebras
Ya se ha indicado que el apareamiento completo entre las dos hebras exige que sus secuencias sean complementarias. Debe aadirse ahora que estructuralmente esto slo se puede conseguir si ambas hebras se disponen en sentidos opuestos: si una avanza de 5 a 3, la otra debe hacerlo de 3 a 5. Se dice que las hebras tienen polaridad opuesta, o que son antiparalelas. El concepto de antiparalelismo va, pues, estrechamente ligado al de complementariedad.
Obsrvese que la secuencia de las dos hebras es siempre distinta, tanto ledas en el mismo sentido como en sentidos opuestos: (5)
TCGGTCAGTA (3) (5) TACTGACCGA (3) y slo son
complementarias si se leen en distinto sentido: una de 5 a 3 y la otra de 3 a 5 (en contra del convenio establecido para dar la secuencia de una cadena)
5.2.4
Diferencias en la secuencia de ambas hebras
Debe destacarse que las dos hebras de un DNA, complementarias y antiparalelas, poseen secuencias totalmente diferentes, como se puede ver en el ltimo ejemplo mostrado. Es decir, son hebras no idnticas. Este hecho, aparentemente simple pero que a menudo pasa inadvertido, es de gran trascendencia; en concreto, en el proceso de transcripcin, la molcula de RNA que se sintetiza es completamente diferente segn cul de las dos hebras del DNA se transcriba. En ocasiones se utiliza el trmino hebras equilibradas refirindose a aquellas regiones del DNA en las que una de las hebras contiene igual proporcin de purinas y pirimidinas. Como consecuencia, la hebra complementaria es tambin equilibrada:
punna (base grande) hebra 1
-G-A-T-G-C-T-T-Ghebra 2 -C-T-A-C-G-A-A-C,
%(T+C)hebra2 como consecuencia: %(A+G)hebral > %(A+G)hcbra2 %(T+C)hebral < %(T+C)hebra2
pirimidina ____ A (base pequea) , , ,,
hebras equilibradas : %(A+G)hebral - %(T+C)hebral = 50% %(A+G)hebra2 = %(T+C)hebra2 = 50% como consecuencia; %(A+G)hebral = %(A+G)hebra2 %(T+C)hcbraI = %(T+C)hebra2
-C-A-A-G-G-A-T-G- -G-TT-C-C-TAChebras no equilibradas: %(A+G)hebral > %(T+C)hebra] %(A+G)hebra2 <
45
En principio, la existencia de hebras equilibradas o no se refiere a regiones localizadas de una molcula de DNA. Existe, sin embargo, un ejemplo singular en el DNA mitocondrial humano: considerado en su conjunto (16,5 kb), sus dos hebras son desequilibradas, pues una es ms rica en purinas que la otra (56 y 44%, respectivamente). A la primera se la llama habitualmente hebra pesada (o hebra H, del ingls heavy, recurdese el mayor tamao del anillo purinico) y a la otra, hebra ligera (o L, de light).
5.2.5
Helicidad y carcter dextrgiro
Las restricciones estricas impuestas por la geometra de los pares de bases (que incluye los enlaces entre base, pentosa y fosfato, pg. 43) hacen que el apareamiento completo de las dos hebras slo se pueda establecer si los pares de bases sucesivos van girando unos con respecto a otros (concretamente, 34,6 en el B-DNA). Como consecuencia de la acumulacin de estos giros, las hebras de DNA adoptan una disposicin helicoidal (es decir, cada hebra describe una hlice) y la cadena de doble hebra es una doble hlice. Geomtricamente, una hlice (genrica, no de DNA), sea sencilla o doble, puede ser de dos tipos:
hlices dextrgiras, dextrorsas, a derechas, o en sentido horario:
hlices levgiras, a izquierdas, o en sentido antihorario:
hlice hlice sencilla doble
hlice hlice sencilla doble
En el caso de la forma B del DNA ambas hebras se enrollan alrededor de un eje comn, longitudinal, formando una doble hlice dextrgira. La observacin de modelos moleculares tridimensionales permite una mejor comprensin de este carcter helicoidal.
plano 5 inferior p Modelo tridimensional de la asociacin de dos dinucletidos complementarios, TC y GA (dos pares de bases sucesivos en la secuencia): plano superior 5 P dRib GdRib 3 obsrvese el giro (34,6) de cada par de nucletidos con respecto al anterior
clRib
2
plano 3 superior
-d'P.ib
(par T=A en el plano inferi par CsG en el plano superior)
rO^ .
plano inferior
46
5.2.6
Parmetros cuantitativos de la doble hlice

eje de la hlice (pasa entre los puentes de hidrgeno de los pares de bases)
dimetro de la hlice: 2,37 nm (23,7 A)
Rotacin de cada par de bases con respecto al anterior: 34,6 (34,6 x 10,4 = 360)
Doble periodicidad a lo largo del eje longitudinal:

0,34 nm (3,4 pares de bases consecutivos entre
Ejercicio:
3,54 nm (35,4 A) por cada vuelta completa (paso de hlice) con 10,4 pares de bases ( 0,34 x 10,4 = 3,54 )
A partir del dato de separacin puede calcular el nmero total de

surco mayor 2,2 nm
entre cada dos pares de bases (0,34 nm), se pares de bases de una molcula de B-DNA de
(22 A)
Inclinacin de los pares de bases: 88,8; es decir, casi perpendiculares al eje de la hlice
cualquier longitud (por ejemplo,

1 m / 0,34 nm/pb = 109nm / 0,34
un metro): nm/pb =2,94- 109 pb 3.000 millones de pb (Mb)
Viceversa, a partir del nmero de pares de bases de un DNA (p.ej., 5.880 Mb), frecuentemente llamado su longitud en pares de bases, se puede calcular la longitud (dimensiones) de la molcula: 5.880 Mb = 5.880 106 pb = 5,88 109 pb 5,88 109 pb 0,34 nm/pb = 2 109 nm = 2 106 |im = 2 - 1 0 3 mm = 2 m ( nota: 106 pb = 1 milln de pb = 1 Mpb, pero se suele usar Mb y no Mpb )
47
La escalera Francisco I del castillo de Chambord (valle del Loira, Francia), cuyo diseo se atribuye Leonardo da Vinci, ha sido considerada como modelo de la doble hlice del DNA, con la salvedad de que su giro es levgiro. Se trata de una escalera helicoidal (de tipo caracol), con la caracterstica atpica de poseer dos rampas independientes, cada una con su entrada (en la foto, una al frente y otra detrs). Por tanto, dos personas pueden utilizarla al mismo tiempo sin encontrarse. En el caso del B-DNA, el esqueleto de las dos hebras correspondera a las barandillas externas de las dos rampas.
5.2.7 5.2.7.1
Carcter anfiptico y estabilidad de la doble hlice Situacin de los fosfatos y carcter hidroflico
Debido a la interaccin entre las bases de las dos hebras, los esqueletos azcar-fosfato de ambas deben disponerse hacia el exterior de la doble hlice, por lo que el DNA dplex muestra un marcado carcter hidroflico. La superficie de la molcula establece as interacciones favorables con el medio acuoso circundante. Al mismo tiempo, la distribucin relativa de los fosfatos es tal que minimiza la repulsin electrosttica entre ellos.
en este modelo se aprecia bien la inclinacin de las bases respecto al eje
residuos de pentosa (hidroflicos) en la superficie de la doble hlice y aproximadamente perpendiculares a las bases
grupos fosfato (ionizados), en la superficie de la doble hlice: a pH fisiolgico el DNA es un polianin
iÊsqueleto: una hebra en azul, la otra en gris. Bases: Adenina Timna Guanina Citosina
48
5.2.7.2
Coplanariedad, apilamiento de las bases y carcter hidrofbico

Las bases purnicas y pirimidnicas de ambas cadenas se encuentran dirigidas hacia el interior de la doble hlice, superpuestas, formando un apilamiento similar a un montn de monedas. Como consecuencia de la proximidad y paralelismo de los anillos aromticos, se originan entre ellos fuerzas de atraccin, de tipo Van der Waals, llamadas interacciones de apilamiento (fuerzas hidrofbicas). De esta forma, el interior de la doble hlice, altamente hidrofbico, queda aislado del medio acuoso (hidrofilico), contribuyendo a la estabilizacin de la molcula y a la proteccin de la informacin gentica (pues sta la constituye la secuencia de bases). Estas interacciones son mayoritariamente inespecficas (es decir, son independientes del tipo de base implicada), a diferencia de los enlaces de hidrgeno entre bases complementarias, muy especficos. Aunque la atraccin entre dos pares de bases individualmente no es muy fuerte, al existir 10,4 bases por vuelta de hlice, la contribucin total a la estabilidad de la molcula es muy elevada.
Pares de bases coplanares, paralelos entre s y perpendiculares al eje de la hlice
planos de apareamient o de las bases
Apilamiento de los pares de bases
Resumen de fuerzas que estabilizan la doble hlice del DNA:
fuerza de unin por enlace de H exterior hidrofilico (esqueleto : azcares y fosfatos)
interior hidrofbico (bases)
interacciones con el agua
fuerzas hidrofbicas de apilamiento de bases
5.2.8
Superficie de la molcula: surcos en el DNA
Como se ha observado, la geometra de los pares de bases (pg. 42) y el antiparalelismo de las hebras (pg. 43), necesarios para la formacin de los puentes de hidrgeno, hacen que los C-1 de los azcares de los dos nucletidos complementarios no se dispongan simtricamente con respecto a las bases y, por ello, que los esqueletos desoxirribosa-fosfato de las dos cadenas no se siten en puntos diametralmente opuestos de la doble hlice. Como consecuencia, a todo lo largo de la estructura en doble hlice se forman dos surcos, uno mayor (o hendidura profunda) y otro menor (o hendidura pequea), que van girando de forma helicoidal, al igual que los dos esqueletos. Los surcos, especialmente el mayor, dejan espacio suficiente para que molculas externas puedan contactar con las bases; ste es el fundamento de la interaccin del DNA con numerosas protenas capaces de reconocer secuencias de bases (pg. 60), con funciones tan importantes como la regulacin de la expresin gnica (por ejemplo, factores de transcripcin). En cierto modo, es como si las protenas leyeran la secuencia a travs de los grupos funcionales de las bases que asoman dentro del surco mayor del DNA.
genera el
genera el
surco menor Modelo simplificado para apreciar la formacin de los surcos, como consecuencia de la asimetra de los pares de nucletidos:
surco menor
la presencia de los grupos OI I y fosfodister (no representados) hace esta parte ms voluminosa de lo que se muestra, con lo que la parte superior tambin da lugar a un surco
vista frontal:
vista
posterior:
surco menor
el surco va girando, con lo que describe una hlice dextrgira; al lado opuesto, el surco mayor hace lo mismo V J surco menor
5.2.9
Significado biolgico: idoneidad para la replicacin
El modelo de doble hlice de Watson y Crlck permite explicar que se mantenga una estructura regular a pesar de la variacin de secuencia y que se produzca, mediante un mecanismo muy simple, la duplicacin del material gentico. En resumen, la replicacin procede de una manera lgica, con dos procesos: (a) la separacin de las dos hebras, y (b) la sntesis, a partir de ellas como molde, de otras dos cadenas complementarias (los detalles de este proceso se estudiarn posteriormente, tema 12). Tambin permite la reparacin de mutaciones y daos en una hebra, al disponerse de la otra como referencia de la secuencia correcta.
hebra hija
hebra paterna
Tema 6
Variaciones en la estructura del DNA

6.1 Variantes en doble hebra: formas A y Z ......................................................................................................................... 52 6.1.1 Forma A del DNA, en comparacin con la forma B .............................................................................................. 52 6.1.2 Forma Z del DNA, en comparacin con las formas B y A .................................................................................... 55 Variantes locales de la estructura secundaria del B-DNA ............................................................................................. 56 6.2.1 Curvatura de la doble hlice ................................................................................................................................ 57 6.2.2 Palndromos........................................................................................................................................................ 57 6.2.2.1 Concepto y caractersticas ................................................................................................................. 57 6.2.2.2 Repeticiones de secuencia ................................................................................................................ 58 6.2.2.3 Palndromos en molculas de hebra sencilla ..................................................................................... 59 6.2.2.4 Consecuencias estructurales de los palndromos............................................................................... 59 a) En cidos nucleicos de hebra sencilla ......................................................................................... 59 b) En DNA de doble hebra ............................................................................................................... 59 6.2.2.5 Funcionalidad de los palndromos ...................................................................................................... 59 6.2.3 H-DNA: triple hlice............................................................................................................................................. 60 Motivos estructurales responsables de la unin del DNA con protenas .................................................................... 60
6.2
6.3
Descripcin de los motivos estructurales ms frecuentes

6.3.1.1 6.3.1.2 6.3.1.3 6.3.1.4 6.3.1.5
61
61 62 62 63 64
Motivo hlice-giro-hlice o hlice-vuelta-hlice .................................................................................. Motivo hlice-bucle-hlice .................................................................................................................. Motivo homeodominio ........................................................................................................................ Motivo dedo de zinc ........................................................................................................................... Motivo cremallera de leucna .............................................................................................................
La molcula de DNA no es una estructura esttica, sino flexible y dinmica. Gracias a la capacidad de rotacin alrededor de los enlaces de los nucletidos, el DNA puede adoptar in vivo diversas formas, distintas de la forma B de Watson y Crick. Se estudian en este tema: Aqullas que, manteniendo la estructura helicoidal de doble hebra, presentan una conformacin diferente: formas A yz. Las variaciones conformacionales de carcter local en torno a la estructura B. La interaccin de regiones especificas del DNA con estructuras caractersticas de algunas protenas. En general, estos tres tipos de variaciones estructurales tienen relacin con funciones importantes en el metabolismo del DNA, interviniendo, por ejemplo, en el inicio y la regulacin de los procesos de replicacin, recombinacin, transcripcin, etc. De ah el inters de su estudio conjunto, como tema independiente, para ampliar la estructura secundaria y sentar las bases de dichas funciones, que sern objeto de estudio en temas posteriores.
6.1
VARIANTES EN DOBLE HEBRA: FORMAS A Y Z
El anlisis por difraccin de rayos X a resolucin atmica revel la existencia de dos nuevas formas estructurales o conformaciones, diferentes a la B-DNA tradicional, en las que se mantienen las caractersticas bsicas de ste (complementariedad, antiparalelismo, helicdad, etc.), pero presentan otras diferencias:
Comparacin entre los tres tipos estructurales bsicos del DNA en doble hebra:
TIPO DE HLICE
52
A (deshidratada) B (Watson-Crick) Z (Rich-Dickerson)
Sentido de giro de la hlice Forma y tamao Dimetro de la hlice Distancia entre bases (d ) Pares de bases por vuelta (n )
2
VARIACIONES EN LA ESTRUCTURA DEL DNA
Dextrgiro La ms ancha y corta
Dextrgiro Intermedia
Levgiro La ms estrecha y larga
2,55 nm (25,5 ) 0,23 nm (2,3 A) 11

+ 32,7
2,37 nm (23,7 A) 0,34 nm (3,4 A) 10,4 + 34,6 3,54 nm (35,4 A) 1,2 (casi perpendicular al eje de la hlice)
Ancho, profundidad media Estrecho, profundidad media Anti
1,84 nm (18,4 A) 0,38 nm (3,8 A) 12 -30 4,56 nm (45,6 A) 9o

(ligera inclinacin) Plano, sin profundidad Estrecho, profundo Sin (C,T) y Anti (G)
Rotacin por cada base (360 In )

3
Longitud vuelta de hlice (n / d ) Inclinacin del plano de los pares de bases 4 Surco mayor o grande Surco menor o pequeo Enlace N-glicosdico
2,53 nm (25,3 ) 19
(gran inclinacin) Estrecho, profundo Amplio, no profundo Anti
Notas: 1 Distancia entre pares de bases, medida a lo largo del eje de la hlice. 2 Rotacin por cada par de bases, o giro respecto al par anterior (+ dextrgiro, - levgiro). 3 Longitud de la vuelta de hlice, medida a lo largo del eje; coloquialmente paso de rosca o paso de hlice. 4 Inclinacin respecto al plano perpendicular al eje de la hlice.
6.1.1
Forma A del DNA, en comparacin con la forma B
La reduccin de la humedad relativa por debajo del 75% (por ejemplo, en disoluciones muy concentradas, es decir, deshidratadas) hace que el B-DNA tienda a transformarse, como ejemplo de la flexibilidad de la molcula, a otra conformacin, denominada A-DNA. Aunque esta forma no se ha encontrado bajo condiciones fisiolgicas, su estudio es de inters por ser la que adopta el RNA cuando posee regiones de doble hebra, as como la de los hbridos DNA-RNA. Estructuralmente, el A-DNA es similar a la forma B: es igualmente una doble hlice dextrgira, con hebras complementarias y antiparalelas unidas por enlaces de hidrgeno. Sin embargo, difiere en sus dimensiones: la hlice A es ms ancha (mayor dimetro), ms corta para un mismo nmero de nucletidos (menor distancia entre pares de bases) y tiene mayor nmero de bases por vuelta. Como consecuencia, son menores la rotacin por cada base y el paso de hlice. Adems, las bases no se disponen casi perpendicularmente al eje de la hlice, sino claramente inclinadas, y se sitan ms separadas del eje de la hlice. La superficie de la molcula es tambin diferente: el surco mayor es ms estrecho que en la forma B y muy profundo, mientras que el surco menor casi no se aprecia por ser ancho y poco profundo. Mientras que la forma B puede acomodar en su surco menor una columna de molculas de agua, el surco superficial de la forma A no ofrece espacio suficiente; esta diferencia explica, al menos en parte, por qu la deshidratacin favorece la forma A.
53
Para mostrar las diferencias estructurales se puede emplear un modelo de cintas, donde el esqueleto se representa por una cinta, de la cual se destacan los anillos pentagonales de desoxirribosa, sus tomos de oxgeno (esferas) y los grupos fosfato (varillas que sobresalen). Cada nucletido est representado en un color diferente. La secuencia en ambos casos es la misma: (5) GGGTATACGC (3) (3) CCCATATGCG (5)
A-DNA
B-DNA
mayor inclinacin de las bases
hlice dextrgira
Este mismo modelo (visto desde su parte superior) permite ilustrar que la hlice A es ms abierta, con mayor dimetro y una 2,55 nm
ms ancha
disposicin de las bases ms alejada del eje de la hlice: 2,37 nm
54
Una visin complementaria a la anterior, a la vez que ms cercana a la realidad, es la del modelo Las bases estn coloreadas en rosa y el esqueleto de pentosas y fosfatos en verde.
espacial compacto.
55
A-DNA
B-DNA
2,37 nm
vuelta de hlice o paso de rosca: 2,53 nm = 11 pb x 0,23 nm bases inclinadas:
los surcos son ms parecidos en anchura: surco mayor estrecho y profundo
r
vuelta de hlice o paso de rosca: 3,54 nm = 10,4 pb x 0,34 nm surco mayor
mas corta
surco ^ menor ancho y superficia l bases no inclinadas

1, 2
dextrgira
dextrgira
Las diferencias, recin comentadas, en la estructura de las dobles hlices A y B vienen originadas en ltima instancia por la diferente disposicin de los pares de bases, debida concretamente a una distinta conformacin de la desoxirribosa: En el A-DNA, el C3 sobresale del plano formado por los otros cuatro carbonos de la ribofuranosa (conformacin C3 -endo), mientras que en el B-DNA es el C2 el que no es coplanar (conformacin C2-endo).
(C3 fuera del plano) 3'
(C2 fuera del plano)
2'
4 (Cl\ C2, C4 y O coplanares)
4 (CI C3, C4 yO coplanares)
conformacin C3 -endo (ADNA)
conformacin CT-endo (BDNA)
Esta distinta conformacin del anillo de ribosa hace que en el A-DNA los dos grupos fosfato consecutivos estn ms prximos entre s, lo que explica que los pares de bases sucesivos se acerquen, acortando la cadena. Similarmente, el cambio en la geometra conduce a los diferentes parmetros geomtricos ya comentados.
56
6.1.2
Forma Z del DNA, en comparacin con las formas B y A
La existencia de la forma Z surge por primera vez de la observacin, mediante difraccin de rayos X, de una doble hlice del hexanucletido CGCGCG, con caractersticas distintas a las formas B y A; entre ellas, como muy significativa, su giro a izquierdas o levgiro. Posteriormente, se ha encontrado esta estructura en otros oligonucletidos sintticos con secuencias de purinas y pirimidinas alternas. Aunque n vivo predomina el B-DNA, se ha podido observar la presencia de algunas regiones Z en el genoma de clulas eucariticas, empleando anticuerpos contra esta ltima conformacin. Su funcin, an por confirmar, parece estar relacionada con el control de la expresin gnica y con la recombinacin. En cuanto a sus dimensiones, observadas ahora comparativamente con las otras conformaciones, se observa que la hlice Z es la ms estrecha (1,84 nm de dimetro), la ms larga (mayor distancia entre bases: 0,38 nm) y la que tiene mayor nmero de pares de bases por vuelta (12), lo cual supone una menor rotacin por base (30) y un mayor paso o longitud de una vuelta de hlice (4,56 nm). Es, en resumen, una hlice muy estirada. En su superficie forma un solo surco, profundo (correspondiente a la posicin del surco menor en A- y B-DNA).
Modelos espaciales compactos:

A-DNA B-DNA Z-DNA
vuelta de hlice o paso de rosca: 4,56 nm = 12 pb x 0,38 nm
el surco mayor no existe, es muy poco profundo
bases algo inclinadas:
surco menor, profundo y estrecho
(bases en color rosa y esqueleto pentosa-fosfato en color verde)
levgira
La consideracin de esta estructura a nivel molecular muestra que sus diferencias respecto a las formas A y B se deben tambin a una distinta conformacin, en este caso alrededor del enlace N-glicosdico. En las formas A y B todas las bases nitrogenadas se orientan alejadas del anillo de pentosa, en la llamada conformacin anti, mientras que en el Z-DNA slo lo hacen las pirimidinas; las purinas tienden a situarse sobre la pentosa (conformacin sin). Por ello, en las secuencias de purinas y pirimidinas alternantes (por ejemplo, CGCGCGCG), tpicas del Z-DNA, se favorece la sucesin de ambas conformaciones, sin (G) y anti (C), obligando al esqueleto azcar-fosfato a plegarse en zig-zag para poder establecer los enlaces de hidrgeno.
57
conformacin anti (todas las bases en A- y BDNA, pirimidinas en Z-DNA)

conformacin (purinas en Z-DNA) sin
NH,
modelo tridimensional del par de nucletidos C=G en un Z-DNA
Citidina en conformacin anti: base alejada de la pentosa
Guanosina en conformacin sin: base vuelta sobre la pentosa
La disposicin en zig-zag del esqueleto los fosfatos quedan en posiciones relativas muy de la forma Z del DNA se aprecia de forma ptima diferentes a las del B-DNA en este modelo de varillas, donde los grupos fosfato se han unido con una lnea verde hipottica. Se muestra, a efectos comparativos, cmo el B-DNA no presenta esta ordenacin, sino que su esqueleto describe una hlice continua. Obsrvese que el Z-DNA es el nico con hlice en sentido levgiro. B-DNA
Z-DNA
Los grupos fosfato^ siguen una lnea en zigzag (de ah el nombre ZDNA) , " ------------
<
Los grupos fosfato siguen una hlice dextrgira levgira
Los grupos fosfato se encuentran ms prximos entre s que en A- y B-DNA, por lo cual in vitro se requiere una elevada concentracin salina para reducir las repulsiones electrostticas entre ellos y as poder mantener esta conformacin Z
6.2
VARIANTES LOCALES DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL B-DNA
Los estudios de difraccin de rayos X tambin revelaron la existencia de variaciones en la conformacin en determinadas secuencias del B-DNA. Aunque dentro de este apartado tambin podra incluirse el superenrollamiento del DNA, se ha preferido describir este aspecto como una estructura de orden superior de los cidos nucleicos, dada su implicacin en la organizacin del cromosoma.
6.2.1
Curvatura de la doble hlice
A pesar de la regularidad del modelo de Watson y Crick, existen pequeas diferencias locales en la estructura de los DNAs dependiendo de los nucletidos integrantes. Por ejemplo, en determinadas secuencias los pares de bases no son exactamente coplanares, lo que puede ocasionar una desviacin del eje de la doble hlice. En otros casos, frecuentes, curvatura no se origina 58 VARIACIONES EN LAla ESTRUCTURA DEL DNA por una secuencia particular de nucletidos, sino que es forzada por la unin de una protena a la cadena de DNA (como, por ejemplo, la mostrada en pg. 61)
6.2.2 6.2.2.1
Palndromos Concepto y caractersticas
Se denomina secuencias palindrmcas, o simplemente palndromos, a aquellas regiones de un DNA cuya secuencia es la misma en ambas hebras. Son bastante comunes, y tienen un significado especial por varas razones: (a) ser lugares-diana de las enzimas de restriccin (herramientas experimentales para escindir cidos nucleicos en la tecnologa del DNA recombinante); (b) actuar como centros reguladores de la expresin gnica; (c) dar lugar a estructuras secundaras peculiares en DNA y RNA, etc. Gramaticalmente, un palndromo (del griego palin = de nuevo, dromos = carrera) es toda palabra o frase que se deletrea igual de izquierda a derecha y de derecha a izquierda. Por ejemplo: RADAR, ANILINA, DABALE ARROZ A LA ZORRA EL ABAD. En los palndromos hay un centro de smetra (a la vez eje y plano de simetra), que es la letra central o la posicin entre las dos letras centrales. Sin embargo, la extensin de este trmino al campo de la Biologa Molecular no es directa: se dice que una regin de DNA es palindrmica cuando la secuencia de una hebra, leda de izquierda a derecha, es igual que la de la otra hebra, leda de derecha a izquierda. Por tanto, los palndromos se observan en las dos cadenas conjuntamente, y no en una sola. Por ejemplo, la secuencia TTAGCAC CACGATT sera un palndromo gramatical, pero no es una secuencia palindrmica. Teniendo en cuenta que, segn el convenio de escritura de los DNAs, ambas hebras se deben leer de 5 a 3', se concluye que las dos hebras de un palndromo tienen la misma secuencia; sta puede considerarse una definicin de palndromo.
Hebra I, leda de izquierda a derecha (5->3): TTAGCACGTGCTAA Hebra 2, leda de derecha a izquierda (5-3): TTAGCACGTGCTAA
5 3 T A T A A T G
C
G
A T
re
, G\ cj
T
A
C
G
T A
A T
A T
^"^"Regin palindrmica en un DNA de doble hebra El palndromo se define tambin por la existencia de simetra rotacional binaria (es decir, un giro de 180 alrededor del centro del palndromo reproduce la situacin 5 eje binario de simetra (rotacional) ____ inicial)
Como una extensin del concepto de palndromo, se llaman palndromos interrumpidos aqullos en los cuales una pequea secuencia separa las dos mitades del palndromo y acta, por tanto, como centro de smetra no puntual (en lugar del espacio entre dos nucletidos de un palndromo estricto). En cualquier caso, todo palndromo est formado por dos mitades" de secuencia idntica, separadas por un centro de simetra, puntual o no puntual.
Palndromo interrumpido!
una secuencia (aleatoria) ^como centro de simetra:^ T T A G C ,0 A G A A T C G T C TN VI G C C G T A A T A T
Al cumplirse tanto la simetra propia del palndromo como la complementariedad de las dos hebras resulta que las secuencias de una misma hebra que quedan a ambos lados del centro de simetra son complementaras entre s; se dice por ello que las secuencias palindrmicas son autocomplementarias.
VARIANTES LOCALES DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL B-DNA
las dos hebras son complementarias entre s

f 5| T | T l A l G | C | A | C j G | T | G | C | T | A | A~|3' hebra 1 \-v|~~Ta I t I c 1 g I t I Gjc I A I C 1 G I A I t I T |5 hebra2
la
6.2.2.2
Repeticiones de secuencia
\ la
En ocasiones se utiliza como sinnimo de palndromo el trmino repeticiones invertidas, puesto que si se leen en sentidos opuestos, las dos mitades tienen la misma secuencia (a ambos lados del centro de simetra, puntual o no). .Otro trmino relacionado es el de repeticiones directas, que se emplea cuando en un DNA hay repeticin de una secuencia (unidad de repeticin), leda siempre en el mismo sentido. No son palndromos porque no se cumple el criterio de igualdad de secuencias ledas en sentido opuesto, ni hay centro de simetra, por lo que no se habla de mitades. Estas repeticiones tienen inters porque aparecen con enorme frecuencia en el genoma (pg. 109), tanto en posiciones contiguas o adyacentes (repeticiones en tndem) como separadas por un nmero elevado de pares de bases (repeticiones dispersas). Finalmente, se habla de repeticiones especulares cuando la secuencia se repite, de forma invertida, dentro de la misma hebra. De nuevo, no son palndromos, pues no hay centro de simetra rotacional, sino plano de simetra especular. Estas dos ltimas posibilidades, aunque aparecen con frecuencia en los DNAs, ocupando una parte importante de su secuencia, no tienen consecuencias en cuanto a la estructura secundaria de los cidos nucleicos, por lo que a partir de este momento slo se tratarn los palndromos. (ejemplo: palndromo discontinuo, con un centro de simetra de 4 pb) TGCTAA 3' ACGATT 5' N ---------------centro o eje de simetra (no puntual) Las secuencias son iguales si se leen en sentidos opuestos: Secuencia Ia mitad (): Secuencia 2a mitad (<): 5' TTAGCAC 3' -------------------- 5' TTAGCAC 3' AATCGTG AATCGTG
palndromos = repeticiones invertidas:
la
directas: (ejemplo: separadas por

4 pb) -N 5' TTAGCACCAGTTTAGCAC 3' 3' AATCGTGGTCAAATCGTG 5 ---------------- 1/ 1 ---------------------------- 1/ no hay eje ni plano de simetra Las secuencias son iguales si se leen en el mismo sentido: Secuencia Ia repeticin (): Secuencia 2a repeticin (): 5' TTAGCAC 3' __ 5' TTAGCAC 3' AATCGTG ---AATCGTG
repeticiones especulares:
(ejemplo: separadas por 4 pb) A TTAGCACCAGTCACGATT 3' AATCGTGGTCAGTGCTAA 5 ----------- ^ \| ----------------------------plano de simetra (no puntual) Las secuencias son diferentes: Secuencia Ia repeticin (): 5' Secuencia 2a repeticin (<):
-J- 5' AATCGTG 3' T~ TTAGCAC Slo iguales si la segunda se lee en sentido no convencional, de 3 a 5 : _ 3' TTAGCAC 5' AATCGTG TTAGCAC 3' AATCGTG
5' TTAGCAC 3' AATCGTG
repeticio nes
6.2.2.3 60
Palndromos en molculas de hebra sencilla VARIACIONES EN LA ESTRUCTURA DEL DNA Para el caso de cidos nucleicos de hebra sencilla, la definicin de palndromo no se puede aplicar estrictamente. Sin embargo, dada la relacin de complementariedad entre la secuencia de un RNA y la de una de las hebras del DNA que lo codifica, las secuencias de RNA de hebra sencilla codificado por un DNA palindrmico son tambin autocomplementarias y se consideran como palndromos. Bajo este criterio, cada una de las dos hebras de un DNA palindrmico tambin es una secuencia palindrmica de hebra sencilla. 6.2.2.4 Consecuencias estructurales de los palndromos
Hebra sencilla (DNA o RNA)
palndromo estricto: centro de simetra puntual y'
c,
a) En cidos nucleicos de hebra sencilla

La existencia de palndromos, por ser secuencias autocomplementarias, puede afectar de forma importante a la estructura secundaria. As, las hebras sencillas de DNA o RNA pueden plegarse ocasionalmente sobre s mismas para formar una estructura en horquilla. Si el centro de simetra no es puntual (palndromos interrumpidos), su secuencia forma un bucle en el extremo de la horquilla. La formacin de horquillas posee gran relevancia en la estructura tridimensional de algunos RNAs. El ejemplo ms significativo lo constituyen los brazos de los tRNAs, regiones con estructura de tallo y bucle (pg. 74), formados por secuencias palindrmicas. Por otro lado, este tipo de plegamiento en el RNA contribuye, en algunos casos, a la terminacin de la transcripcin; concretamente, en el mecanismo de terminacin independente de p de procariotas y los mecanismos equivalentes de eucariotas. En el caso de hebras sencillas de DNA tambin pueden encontrarse horquillas, por ejemplo en el DNA desnaturalizado, que carece de una estructura secundaria definida. Tambin se propone su formacin en situaciones particulares, por ejemplo durante la sntesis en el laboratorio del cDNA (DNA complementario) a partir de un mRNA, donde el extremo 3 del DNA de hebra sencilla se repliega sobre s mismo y sirve as de cebador para la polimerasa (pg. 206).
palndromo interrumpido: secuencia como centro de simetra
c,
Ta^GC&CG'r'GC'riViX
WJYGCCAGT
reasociacin de una hebra
r _ r.;
c\ yr
-1C
r1
Bucle
--le:
5P
5- l i l i
lili
Horquilla sin bucle
Horquilla con bucle
Doble hebra (slo DNA)

palndromo estricto: centro de simetra puntual y
y
palndromo interrumpido: secuencia como centro de simetra

5 'I"I_4.GCCAGT GCA14 3 i
>f2AsciicG,iiGc,rjy-i i i i i 1 1 - 1 i ii i i i 1 1 1 1 1 i i ii11 iii11 ii11 iii y- va V r Q'j> r.y >\ r rz&guv
iiiiii iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii ii ,J
3 i\vyr , r> QGTCAC G f i 5
reasociacin de las dos hebras

(
b) En DNA de doble hebra

En el caso de un DNA doble, las hebras del palndromo pueden separarse y reasociarse de otra forma, generando estructuras de doble horquilla o cruciformes (en forma de cruz). Similarmente al caso anterior, los palndromos interrumpidos forman cruciformes con dos bucles.
ir\ A C r .i
VV^
S?
A Th - L 4
^ , 1 i l .iiii
'5
Cruciforme sin bucles
5-i i i r 3 -i i i i.
i i i--
6.2.2.5
Funcionalidad de los palndromos
Los palndromos en DNA dplex actan como seales de reconocimiento a las que se unen numerosas protenas reguladoras, que poseen estructuras dimricas que les permiten unirse de forma simtrica a ambas mitades del palndromo (pg. 61).
61
6.2.3
H-DNA: triple hlice
Se trata de una estructura poco habitual, formada por 3 hebras: una triple hlice, tambin llamada triplex o trplice. Se descubri por primera vez en un RNA, aunque es en el DNA donde se encuentra con ms frecuencia. Se forman en regiones ricas en pirimidinas (secuencia (CT)n ) en una hebra y ricas en purinas (secuencia (AG)n ) en la hebra complementaria. En condiciones normales, dichas secuencias se encuentran totalmente apareadas sin alteracin alguna en la doble hlice. Sin embargo, puede ocurrir que parte de la doble hlice se abra y la hebra rica en C y T se repliegue y se aparee con la otra hebra (AG), mediante una nueva clase de enlaces de hidrgeno (conocidos como enlaces de Hoogsteen), en una zona donde sta an forma doble hlice. Aparece as una triple hlice (CT)n / (AG)n / (CT)n en dicho segmento del DNA. La otra hebra sencilla (rica en A y G), desapareada, forma una especie de bucle. Organizacin de las cadenas en el plano: Esquemticamente: 1) Las dos hebras (1 y 2) forman una doble hlice. doble hlice 2a) Una de las hebras gira volviendo hacia atrs (1 *) y zona en triple hlice 5 se aparea con las dos hebras anteriores, formando el GGACAGGTCTCTCTCTCTCTCTC-Tv segmento de triple hlice. hebra I, rica en CT 3a) La otra hebra (2) queda desapareada, hasta que se 1 1 I 1 1 1 1 1 1 1 I I rene de nuevo con la hebra 1 para formar un 1 1 1 1 1 III1 1 1 1 segundo tramo de doble hlice. hebra 2, rica en GA 3-CCTGTCCAGAGAGAGAGAGAGAG A v
,T -T -TCTCTCTCTCTCTCTC -T' G>
1111111111111111
,*
\^ ^^-^joble
GAGAGAGAGAGAGA
r^tf\\N'd&AAA ,, \ \ xv
monohebra desapareada hlice
^^jemplo de apareamiento de 3 bases que da lugar a la triple hlice en el H-DNA (TAT). El otro apareamiento es entre citosina, guanina y citosina protonada: CGC+. En el caso de RNAs, la interaccin TAT vendra sustituida por UAU.
v. s tamao aproximado ^ de la hlice N
Org aniz
parcialmente ocupado ^ surco mayor .
el surco mayor queda por la hebra 1 *
^^^
acin
hebra 1 *
dRibN T
CH-i
N"'
Y dRib|
hebra ;
( 1 A J /\
(de
'
espacial de las cadenas:
enlaces de H atpicos Hoogsteen) Obsrvese la dRib hebra 2 implicacin de tomos N nucleares distintos ê Watson-Crick) (N-7 y N-l ) "
enlaces de H clsicos
Este tipo de estructura ha despertado gran inters por su aplicacin en terapias de inhibicin de la expresin gnica, mediante la unin de un oligonucletido sinttico a la doble hlice del DNA en la regin promotora de un gen, formando una triple hlice que impide la expresin del gen.
6.3
MOTIVOS ESTRUCTURALES RESPONSABLES DE LA UNIN DEL DNA CON PROTENAS
Son numerosos los procesos biolgicos en los que la funcin del DNA depende de su interaccin especfica con protenas; destaca entre ellos el control de la expresin gnica, ejercido por protenas denominadas genricamente factores de transcripcin (cuyo papel se estudia ms adelante, pg. 264). El estudio de estas protenas tiene inters dentro del contexto de las variantes estructurales del DNA, precisamente por su capacidad de reconocer e interaccionar con secuencias concretas del DNA. Este reconocimiento tiene lugar gracias a la posibilidad de variaciones locales en la estructura tridimensional del DNA, as como a la interaccin directa de la protena con las bases, sin necesidad de que se separen las hebras de la doble hlice. En la mayor parte de los casos, los numerosos contactos establecidos (de tipo inico, hidrofbico y enlaces de hidrgeno), aunque individualmente dbiles, se combinan para dar una interaccin especfica y muy fuerte entre DNA y protena.
62
El reconocimiento se ejerce a travs de regiones o elementos estructurales, que son slo una parte de la estructura terciaria completa de la protena, y que se pueden encontrar, con una estructura espacial muy similar, en protenas distintas, interviniendo en una misma funcin en todas ellas. Si se cumplen estos requisitos, reciben la denominacin genrica de motivos estructurales proteicos (en ingls, motifs), en este caso motivos de unin a DNA. La interaccin tiene lugar con el exterior de la doble hlice, especialmente sobre el surco mayor. Como caracterstica importante, un mismo motivo puede contactar simultneamente con varios puntos diferentes del DNA, forzando as en ste una modificacin conformacional que hace que secuencias lejanas puedan aproximarse. Dicho cambio conformacional puede inducir incluso la separacin parcial de las hebras (desnaturalizacin local), con lo que se vera favorecido el acceso de otras protenas. Tal es el caso, por ejemplo, de la RNA-polimerasa en el proceso de transcripcin.
6.3.1
Descripcin de los motivos estructurales ms frecuentes
hlice-giro-hlice (HTH)
hehce-bucle-hehce (HLH)
homeodominio dedo
de zinc cremallera de leucina
6.3.1.1 Motivo hlice-giro-hlice o hlice-vuelta-hlice

Se abrevia como HTH, del ingls helix-tum-helix. Fue el primer motivo proteico de unin al DNA bien estudiado. Se ha encontrado en protenas reguladoras de la expresin gnica, tanto en virus como en procariotas y eucariotas. Est formado por dos segmentos peptdicos en a-hlice, de estructura rgida, separados por una secuencia de aminocidos, flexible, que permite que las dos hlices se aproximen entre s. Una de las a-hlces (llamada hlice de reconocimiento) se encaja en el surco mayor del DNA, de forma que los residuos aminocidos de un lado de la hlice interaccionan mediante puentes de hidrgeno con las bases nitrogenadas expuestas en ese surco. El dimetro de la a-hlice tiene la dimensin adecuada (1,2 nm) para entrar en el surco. Algunos aminocidos, situados en la cara opuesta de la misma hlice, establecen interacciones con otros de la segunda hlice, fijando la posicin relativa de ambas en un ngulo casi perpendicular (ver esquema inicial). La segunda a-hlice queda as cruzada sobre la de reconocimiento y situada en el exterior del DNA.
Dos modelos moleculares donde se aprecia la interaccin del DNA con un motivo hlice-giro-hlice dimrico. En este caso, la protena completa contiene 2 motivos HTH. Se muestran slo stos y algunas hlices cercanas, ajenas al motivo; el resto de la molcula no se muestra, pues no se relaciona con la unin al DNA.
7
otras hlices contiguas al motivo, pero que no forman parte de l
2- motivo HTH
(2 hlices) hlice de reconocimiento
La unin de los dos motivos HTH puede forzar una modificacin conformacional en el DNA, en este caso una curvatura, responsable de la funcin de la protena (p.ej., detener la transcripcin).
63
Es frecuente que una protena presente dos motivos HTH o bien que se asocien dos molculas de protena iguales (es decir, un dmero), cada una con un motivo HTH. En ambos casos, las dos hlices de reconocimiento (una de cada motivo) se sitan a una distancia mutua de unos 3,4 nm, lo que coincide con el paso de hlice del B-DNA (3,54 nm) y, por tanto, con dos posiciones consecutivas de su surco mayor. Es decir, ambos motivos interaccionan simultneamente con el DNA, contribuyendo a estabilizar la unin de la protena. Los ejemplos mejor conocidos de protenas con motivos HTH actan regulando la transcripcin en bacterias y virus, respectivamente. El primero, la protena receptora de AMP cclico (CRP, tambin llamada CAP) es un dmero, por tanto, con 2 motivos HTH, que cuando une cAMP aumenta su afinidad por secuencias especficas del DNA, desencadenando la expresin de los genes del opern lactosa (este fue el primer ejemplo conocido de control de la transcripcin). El segundo ejemplo (en la figura) es la protena Cro del fago lambda, codificada por un gen del virus y expresada en la bacteria anfitriona, que interacciona por su motivo HTH con el gen de la protena vrica llamada represor del fago A, bloqueando como consecuencia su expresin (transcripcin del gen y sntesis de la protena).
6.3.1.2
Motivo hlice-bucle-hlice
Se abrevia como HLH, del ingls helix-loop-helix. No debe confundirse con el anterior. Consta tambin de dos segmentos en ahlice, pero en este caso el pptido que los une es ms largo, lo que lo dota de mayor flexibilidad y, en consecuencia, hay ms posibilidades de orientacin mutua de las dos hlices. Generalmente, al igual que en HTH, dos motivos HLH se asocian, formndose protenas dimricas, aunque no siempre interaccionan en posiciones consecutivas del s.urco mayor. Un ejemplo de motivo HLH bien conocido es el de la protena Max de ratn (en la figura).
Motivo hlice-buclc-hclice dimrico y su interaccin con el DNA. (El resto de la protena no se muestra)
motivo 1
motivo 2
buele largo entre las 2 hlices de cada motivo
hlices de reconocimien to
Las hlices de reconocimiento del los dos dominios HLH encajan en la misma posicin del surco mayor del DNA, abrazando a la doble hlice
6.3.1.3
Motivo homeodominio
Se puede considerar como una ampliacin del motivo hlice-giro-hlice (HTH), pero adquiere entidad propia por aparecer repetidamente, con idntica estructura, en distintas protenas. Adems de la disposicin de dos hlices cruzadas tpica del HTH, existe un tercer tramo en a-hlice, del que sale una regin sin estructura secundaria definida cuyos aminocidos interaccionan directamente con el DNA. Este motivo (en ingls, homeodomain) es importante por aparecer en las protenas que regulan el desarrollo embrionario, estudiadas especialmente en Drosophila.

Motivo homeodominio dimrico y su interaccin con el DNA 2a hlice pptido lineal que interacciona con las bases del surco menor homeodomin io (3 hlices) motivo homeodominio
64
3a hlice hlice de reconocimi er.. pptid o lineal
motivo homeodominio
motivo homeodominio 2
3a hlice, exclusiva del homeodomi nio 2a hlice Ia hlice, o de reconocimiento Las 2 hlices forman una estructura similar al dominio HTH
Vista axial de la ,, , , p.,,, molcula de DNA
6.3.1.4
Motivo dedo de zinc
Se ha encontrado este tipo de motivo estructural (en ingls, zinc finger) en multitud de protenas eucariticas que se unen al DNA, entre ellas el factor de transcripcin TFIIIA y el receptor de estrgenos. Al igual que en las estructuras anteriores, es frecuente que una misma protena posea ms de un motivo; en este caso, se observan normalmente mltiples dedos de zinc consecutivos. ste es un elemento estructural formado por unos 30 aminocidos, de los cuales 2 cistenas y 2 histidinas aparecen en posiciones constantes, coordinando tetradricamente un ion Zn +2. Esta unin obliga a un plegamiento de la cadena peptdica, de forma que el motivo se caracteriza por una conformacin tridimensional alargada, en forma de dedo, que le da nombre. La variante ms frecuente muestra dos hojas |3 antiparalelas, cada una con un residuo Cys, seguidas de un giro y de una estructura a-helicoidal, con las dos His. Este motivo se denomina C2 H2 (abreviaturas de una letra para los aminocidos que unen el Zn+2) y su secuencia consenso es: -X3-Cys-X2_4-Cys-X3-Phe-X3-Leii-X2-His-X3-His-X4- hoja p
hoja p giro nelice a

donde los subndices representan el nmero de residuos (aminocidos variables, X) que separa los aminocidos consenso (constantes). Estas secuencias adquieren espontneamente gracias al Zn 2+ la conformacin apropiada para que el segmento ahelicoidal interaccione con tres bases expuestas en el surco mayor del DNA. Los restos variables permiten que se reconozcan distintas secuencias del DNA.
Estructura clsica de un dedo de zinc Cys 2His2, con 2 hojas p, l hlice a y 1 ion Znf2 En el factor de transcripcin TFIIIA, al menos 6 dedos de zinc consecutivos (se muestran 3) siguen el surco mayor del DNA
vista lateral interacci n con las bases en el surco mayor a-hlice

hojas P antiparalela s
vista axial
Cistenas
Zn2_r
Histidinas
Las dos hebras del DNA se muestran como cintas azules. Los motivos dedo de zinc de la protena TFIIIA, en rosa las a-hlices, en naranja las hojas p, en negro el resto de la cadena sin estructura secundaria. Los iones Zn2+ en verde. En otros casos se observa una variante de dedo de zinc llamada C4, donde el ion metlico se coordina con cuatro Cys en la secuencia consenso -Cys-X2 -Cys-X1 3 -Cys-X2 -Cys- que no forma hojas p, sino dos segmentos en a-hlice.
Esta estructura aparece, por ejemplo, en los receptores de hormonas esteroides.
6.3.1.5
Motivo cremallera de leucina
Se trata de una regin de la protena cuya secuencia tiene un residuo de ieucina cada 7 aminocidos. Al adoptar la conformacin a-helicoidal se concentran en un lado los aminocidos hidrofbicos, de tal manera que Leu se repite en la misma cara cada dos vueltas de hlice (2 vueltas de 3,4 residuos 7 aminocidos). Dos cadenas peptdicas de este tipo pueden asociarse hidrofbicamente, intercalando sus restos de Leu como si se tratara de los dientes de una cremallera (en ingls, leucine zipper). En el otro extremo del motivo las dos a-hlices encajan en el surco mayor del DNA y presentan en la cara exterior abundantes aminocidos bsicos que interaccionan favorablemente con los fosfatos. De alguna manera, este modelo se asemeja a una Y, en la que el tallo corresp ondera a la cremallera de leucina y los brazos a los tramos de las hlices que contactan con el DNA. Estructuras de este tipo aparecen, por ejemplo, en las protenas reguladoras de la transcripcin llamadas bZIP.
Motivo cremallera de leucina y su interaccin con el DNA
Se representan slo las cadenas laterales de: Leu (amarillo y verde oscuros) Arg (marrn y rojo)
interaccin hidrofbica entre los residuos de Leu (se muestran slo sus cadenas laterales)
; /
Por un extremo, las dos a-hlices peptdicas interaccionan entre s, formando un helicoide, y por el otro encajan en el surco mayor del DNA, abrazando a la doble hlice
66
Tema 7
Estructuras de orden superior de DNA y RNA

7.1 Superenrollamiento del DNA ............................................................................................................................................ 7.1.1 Superenrollamiento del DNA en procariotas (y mitocondrias y cloroplastos de eucariotas) .................................. 7.1.1.1 Conformacin relajada ....................................................................................................................... 7.1.1.2 Conformaciones superenrolladas ....................................................................................................... 7.1.1.3 Demostracin experimental del superenrollamiento ........................................................................... 7.1.2 Aspectos tericos del superenrollamiento ............................................................................................................ Estructura de los RNAs .................................................................................................................................................... 7.2.1 Composicin de bases y estructuras primaria y secundaria del RNA ................................................................... 7.2.2 Estructura tridimensional de los RNAs en general ............................................................................................... 7.2.3 Tipos de RNA: propiedades y estructuras particulares ......................................................................................... 7.2.3.1 RNA mensajero (mRNA) ................................................................................................................... 7.2.3.2 RNA de transferencia (tRNA) ............................................................................................................. a) Especificidad de los tRNAs por los aminocidos .......................................................................... b) Presencia de nuclesidos infrecuentes ........................................................................................ c) Apareamiento de bases intracatenario ......................................................................................... d) Estructura secundaria en trbol.................................................................................................... e) Estructura terciaria en L ............................................................................................................ 7.2.3.3 RNA ribosmico (rRNA) ..................................................................................................................... 7.2.4 Ribozimas: funcin cataltica de algunos RNAs ................................................................................................... 7.2.4.1 Accin cataltica en la maduracin de RNA ........................................................................................ 7.2.4.2 Accin autocataltica en la eliminacin de intrones ............................................................................. 7.2.4.3 Accin cataltica y autocataltica en viroides: ribozimas de posible aplicacin teraputica. 7.2.4.4 Accin cataltica transpeptidasa en la sntesis de protenas ................................................................ Los ribosomas ................................................................................................................................................................. 7.3.1 Localizacin celular ............................................................................................................................................. 7.3.2 Caractersticas diferenciales de los ribosomas procariticos y eucariticos ......................................................... 7.3.2.1 Origen ................................................................................................................................................ 7.3.2.2 Composicin ...................................................................................................................................... 7.3.2.3 Estructura........................................................................................................................................... 7.3.3 Separacin de los ribosomas, subunidades y componentes ................................................................................ 66
66 66
67 67
68
7.2
7.3
69 69 70 70 71 71 71 72 73 74 75 76 76 77 77 78 78 79 79 80 80 80 81 81
Los cidos nucleicos no se encuentran en las clulas en las formas extendidas correspondientes a su estructura primaria y secundaria, sino molecularmente ms compactados, lo que hemos denominado (p. 32) nivel estructural de orden superior. En el caso del DNA, parte de esta compactacin o condensacin viene representada por el denominado superenrollamiento, o retorcimiento de la cadena sobre s misma, mientras que para el RNA se plasma en estructuras tridimensionales variadas. En ambos casos, la condensacin se completa por la asociacin estrecha con protenas que inducen el plegamiento de la doble hlice del DNA o de la cadena lineal de algunos RNAs (p.ej., el RNA ribosmico, pg. 79). La contribucin de esta asociacin con protenas posee una relevancia especial en el caso del DNA nuclear eucaritico (tema 8 ).
67
ESTRUCTURAS DE ORDEN SUPERIOR DE DNA Y RNA
7.1
SUPERENROLLAMIENTO DEL DNA
El superenrollamiento, como parte de la condensacin del DNA en general, posee especial significado para entender la organizacin del cromosoma. En concreto, contribuye a explicar cmo un DNA de tan gran magnitud puede alojarse en el interior de la clula (procariotas) o del ncleo (eucariotas), de dimensiones muy inferiores a la longitud terica del DNA en doble hlice. Por ejemplo: DNA tamao longitud en forma de B-DNA dimensiones en las que se compacta E. coli Cada cromosoma humano Genoma humano diploide 4,7 10B pb 50-250 106 pb 6 , 6 1 0 9 pb
1,6
mm = 1.600 nm 17-85 mm 2,2 m
2 .im (clula) 4-6 jim (ncleo)
Se entiende por superenrollamiento (enrollar algo que ya est enrollado) del DNA al retorcimiento o giro sobre s misma de la doble hlice (que ya lleva implcito el enrollamiento mutuo de dos hebras), de forma que el eje de la doble hlice no sigue una lnea recta, sino otra hlice (una superhlice). Su causa, como se ver a continuacin, es la introduccin de una tensin estructural en la propia molcula. Aparece de algn modo en todos los DNAs celulares (ya enrollados) y se encuentra estrechamente regulado in vivo por la accin de las topoisomerasas (pg. 151). En resumen, las dos hebras del DNA sufren un enrollamiento, mientras que la doble hlice sufre un superenrollamiento. Un ejemplo intuitivo del concepto de superenrollamiento es el cordn del telfono, que de por s presenta un enrollamiento helicoidal y, con el uso cotidiano, termina por adoptar un enrollamiento adicional (cordn retorcido). Este smil se utiliz para explicar muchas propiedades del DNA vrico (circular y pequeo). Un modelo ms prximo a la estructura del DNA es una cuerda formada por dos cabos arrollados entre s. Aunque la cuerda tiende a mantener ese arrollamiento, puede ser forzada manualmente a un mayor o menor nmero de vueltas entre sus cabos (torsin), con lo que se genera una tensin que se libera mediante la formacin de superenrollamientos.
7.1.1
Superenrollamiento del DNA en procariotas (y mitocondrias y cloroplastos de eucariotas)
Aunque afecta tanto a procariotas como a eucariotas, el superenrollamiento es ms conocido y de comprensin ms sencilla en los primeros, por lo que as se abordar a continuacin. Estas consideraciones son igualmente vlidas para el DNA de plsmidos procariticos y el de cromosomas mitocondriales y cloroplsticos de eucariotas. En todos estos casos, la molcula de DNA muestra una estructura circular o cerrada (una doble hlice con sus extremos unidos entre s), en la que es fcil apreciar los fenmenos de superenrollamiento.
7.1.1.1
Conformacin relajada
La conformacin adoptada por el DNA en su forma B (aprox. 10,5 pb/vuelta) corresponde a un estado estable, de mnima energa, que se considera no superenrollado o relajado, cuando el eje de la doble hlice se puede disponer completamente sobre un plano.
ESTADO RELAJADO o NO SUPERENROLLADO (conformacin de mnima energa, mxima estabilidad)
68
SUPERENROLLAMIENTO DEL DNA
69
7.1.1.2 Conformaciones superenrolladas

En las clulas, el DNA generalmente no se encuentra en la conformacin relajada, sino en un estado no relajado, superenrollado y ms compacto. ste es producido por topoisomerasas que, mediante el corte transitorio de una o ambas hebras, introducen un aumento o una disminucin en el nmero de vueltas de hlice (pg. 151). En ambos casos se produce una tensin estructural, debida a un plegamiento local de las hebras y a una posicin relativa de los nucletidos diferentes de su geometra energticamente ms estable, la del B-DNA. Esta tensin se contrarresta en la molcula medante la formacin de un superenrollamiento: la cadena entera del DNA gira sobre s misma de forma que las bases puedan disponerse de nuevo del modo ms prximo a la conformacin B-DNA. En primer lugar, si se reduce el nmero de vueltas de hlice, la tensin se libera formando una superhlce a la que se le asigna un valor negativo de superenrollamiento.
ESTADO NO RELAJADO o TENSO (de energa superior) originado por desenrollamiento de la doble hlice (prdida de vueltas)
La molcula de DNA ha sufrido una prdida de una vuelta: El cromosoma de 210 pb contiene ahora 19 vueltas de hlice, con 11,1 pb/vuelta la tensin se libera (prdida de energa) mediante la formacin de un bucle o superhlice
Conformacin de mnima energa, obtenida mediante un SUPERENROLLAMIENTO NEGATIVO
compactacin de la molcula de DNA circular por un superenrollamiento negativo
Si se considera que la prdida de una vuelta de hlice ha ocurrido en la regin de 63 pb, sta tendr 5 vueltas de hlice con 12,6 pb/vuelta: > 10,5 pb/vuelta, es decir, tensa
El cromosoma superenrollado tiene 20 vueltas con 10,5 pb/vuelta: conformacin no tensa
Si, por el contrario, se aumenta el nmero de vueltas de hlice, la tensin se libera por formacin de una superhlice de sentido opuesto, con un superenrollamiento positivo.
ESTADO NO RELAJADO o TENSO (de energa superior) originado por superenrollamiento de la doble hlice (aumento de vueltas)
La molcula de DNA ha sufrido un aumento de una vuelta: El cromosoma de 210 pb contiene ahora 21 vueltas de hlice, con 10,0 pb/vuelta
Conformacin de mnima energa, obtenida mediante un SUPERENROLLAMIENTO POSITIVO
la tensin se libera (prdida de energa) mediante la formacin de un bucle o superhlice (de sentido contrario al anterior) Si se considera que el aumento de una vuelta de hlice ha ocurrido en la compactacin de la molcula regin de 63 pb, sta tendr 7 vueltas de hlice con 9,0 pb/vuelta: < 10,5 de DNA circular por un pb/vuelta, por tanto tensa
superenrollamiento positivo
7.1.1.3 Demostracin experimental del superenrollamiento
El cromosoma superenrollado tiene 20 vueltas con 10,5 pb/vuelta: conformacin De estas dos posibilidades, el DNA se encuentra normalmente en las clulas en un no tensa
estado de superenrollamiento negativo. La primera evidencia experimental que llev a proponer la hiptesis del superenrollamiento de las cadenas se obtuvo gracias a la aplicacin de la tcnica de ultracentrifugacin isopcnica (basada en el equilibrio de sedimentacin en un gradiente de densidad de cloruro de cesio, pg. 137). Se observ que el DNA de polioma, un pequeo virus que causa cncer a ratones, se separaba en tres bandas en el gradiente. Las tres fracciones, sin embargo, tenan la misma masa molecular, por lo que la diferencia deba estar en su forma o estructura. Se pudo comprobar que las molculas menos densas eran lineales, mientras que las dems eran circulares. Slo tras la hiptesis del superenrollamiento se pudo explicar la diferencia entre esas dos fracciones ms densas.
70
banda III, 14S (menor velocidad de sedimentacin): DNA de doble hebra lineal estructura menos compacta
banda I, 20S (mayor velocidad de DNA de doble hebra circular,
banda II, 16S (velocidad de sedimentacin intermedia): DNA de doble hebra circular, relajado
sedimentacin):
superenrollado estructura ms compacta
ooo
7.1.2 Aspectos tericos del superenrollamiento
El empleo de la Topologa (rama de las Matemticas que estudia las propiedades de posicin relativa de las partes de un objeto, propiedades que no cambian al ser sometido a deformacin) ha permitido aclarar la estructura del DNA superenrollado. El signo y magnitud del superenrollamiento se asignan con base en dicho estudio topolgico, del cual slo se comentan aqu los aspectos ms elementales. Posibles disposiciones tericas de dos hebras (por ejemplo, dos cabos de cuerda) con diferente grado de enrollamiento entre s (diferente nmero de enlace). L = nmero de enlace = n de veces que las hebras se cruzan. (El modelo de la derecha, con L=20, correspondera al DNA relajado de 210 pb considerado anteriormente)
(S> 0
L=l L=4 L=20 las dos hebras slo se pueden seprarar por sucesivos cortes de una de ellas y retorcimientos Se define el ndice o nmero de enlace topolgico (L o Lk, de linking number) como el nmero de veces que las dos hebras se cruzan entre s; ms especficamente, el nmero de veces que una hebra cruza el plano definido por la otra (como anillo o curva cerrada). Se le asigna valor positivo cuando las hebras se cruzan hacia la derecha. Se habla de enlace topolgico porque cuando LÔ las dos hebras estn fsicamente ligadas (es decir, no se pueden separar), a pesar de que no hay enlaces covalentes entre ellas. Slo se podran separar (L=0) rompiendo algn enlace covalente (es decir, cortando una hebra). Lo mismo es aplicable para cualquier cambio del valor L. Por la misma razn, la deformacin, plegamiento, etc., de las hebras, sin cortarlas, no alteran el nmero de enlace ni el nmero de superenrollamiento. Para el caso del DNA, la conformacin relajada posee, por tanto, un nmero de enlace igual al nmero de vueltas de hlice, siempre positivo puesto que la doble hlice del DNA es dextrgira. Como ya se ha estudiado, las situaciones de superenrollamiento surgen de cambios en el nmero de vueltas de hlice, es decir, en el nmero de enlace L. Para discernir y cuantificar los estados superenrollados se refiere su valor de L al del estado relajado, definiendo un nuevo valor numrico de superenrollamiento como la diferencia (AL) entre el nmero de enlace de una conformacin concreta del DNA y el nmero de enlace de su forma relajada. Este valor de superenrollamiento puede, lgicamente, ser positivo o negativo. l
Para un DNA doble circular de 210 pb de longitud, la estructura B tiene 210 pb / 10,5 pb/vuelta = 20 vueltas. Por tanto, la conformacin relajada de ese DNA sera la de =20. Por encima y por debajo de L=20 se habla de un superenrollamiento positivo o negativo, respectivamente. (Todas las formas representadas son las de mnima energa para cada caso)
OOO
superenrollamiento negativo /, = 18 superenrollamiento = 2
L = 19
superenrollamiento positivo g. .f-9 superenrollamiento = 0 = 21 superenrollamiento = +1 = 22 superenrollamiento =+2
superenrollamiento = -1
ESTRUCTURA DE LOS RNAS
71
7.2
ESTRUCTURA DE LOS RNAs
Como ya se ha indicado (pg. 33), los RNAs son polirribonucletidos (polinucletidos con ribosa, y U en lugar de T) formados por cadenas lineales, de hebra sencilla, de varias decenas o millares de unidades, pero de longitud muy inferior a las de DNA. No se presentan como cadenas dobles de hebras complementarias.
7.2.1
Composicin de bases y estructuras primaria y secundara del RNA
La estructura primaria de los RNAs ha sido estudiada anteriormente (tema 4). En cuanto a la secundaria, es caracterstica la ausencia de una estructura repetitiva y bien definida, a diferencia del DNA; realmente slo existe estructura secundaria en parte de la molcula de tRNAs y rRNAs. Al no existir un apareamiento sistemtico de dos hebras, la composicin de bases en los RNAs es mucho ms variada que en el DNA y no se cumplen las reglas de Chargaff (pg. 38). Por otro lado, en algunos RNAs hay cierta abundancia de nucletidos distintos de los cuatro principales (A, G, C y U), aunque en proporcin baja con respecto a la de stos.
Composicin de bases de varios RNAs (%) Organismo Tipo de RNA A Rata nuclear 20.2 (hgado) mitocondrial 17.8 ribosmico 20.0 de transferencia 20.9 mensajero 23.8 Levaduras ribosmico 24.9 de transferencia 18.5 mensajero 27.5 ribosmico -25 E. col i de transferencia 19.3 mensajero 24.1
G 25.7 31.8 30.5 30.9 28.3 27.7 29.2 25.1 - 31 32.0 27.7
C 29.5 28.4 31.6 28.5 27.4 19.4 28.4 20.3 -22 28.3 24.7
U 24.6 20.9 20.2 20.4 20.5 26.7 20.0 27.1 -21 16.0 23.5
Obsrvese cmo, a diferencia de lo que ocurre con el DNA, la composicin de bases vara dentro de una misma especie (segn el RNA considerado) no existe una equivalencia entre bases (AÛ, G^C, purinas^pirimidinas)
Algunos RNAs adoptan estructura secundaria en pequeas regiones de su molcula, gracias al plegamiento de su nica hebra sobre s misma, siempre que ste permita el apareamiento intracatenario de dos zonas cuyas secuencias sean complementarias, a pesar de estar separadas en la estructura primaria; se forma as una doble hlice local, de carcter antiparalelo. De manera similar se forman tambin dobles hlices entre una molcula de RNA y una hebra sencilla de DNA (hbridos RNA-DNA). En estos casos, si el grupo 2-OH de la ribosa adopta la conformacin C2-endo presenta impedimentos estrcos con otros tomos de la cadena de RNA, lo que impide que se forme la doble hlice (que sera de tipo B). En concreto, el 2 -OH estara muy cerca de los tomos del grupo fosfato contiguo y del C8 de la base adyacente. En cambio, en la conformacin C3-endo el grupo 2OH se proyecta hacia fuera, lejos de otros tomos del esqueleto y no aparece impedimento estrico alguno, por lo que es posible la formacin de la doble hlice, en este caso de tipo A. En resumen, la nica doble hlice en la que puede participar un RNA es la de tipo A (el DNA, al carecer del OH en 2, puede adoptar tanto la A como la B, como ya se ha estudiado en el tema 6 ).
este grupo OI I intcraccionara desfavorablemente con los nucletidos vecinos
(C2 fuera del plano) 2'
conformacin C3 -endo (forma A, nica posible para el RNA)

en esta posicin no hay interaccin con los nucletidos
4' (C1 C3\ C4 yO coplanares)
conformacin C2-endo (esta conformacin es vlida para la forma B en el DNA, pero es imposible para el RNA)
72
7.2.2
Estructura tridimensional de los RNAs en general
Existe una gran diversidad en la estructura tridimensional de las molculas de RNA. sta es compleja, nica para cada tipo de RNA, y resulta de la combinacin de estructuras secundarias locales, estabilizadas por enlaces de hidrgeno y por interacciones hidrofbicas de apilamiento de bases. Su estudio concreto se har ms adelante, para cada tipo de RNA.
horquilla
hebras simples A ui UM- saliente . rn-G-C' Xu-r S A-C A-A-G 1 U . i doble henee AU A ...
r/G-A. J 0 -A** V A* V/\_C-u/ \
G C \A burbuja C G bucle o lazo
/\
T, tipo A
Â -C-A-A-G-u . ! | "*A A G \C-A^ SA-C-L

.U.A.G.U.AI ,u-A'C
A
c 1
A. u
SU.A/
C
''
tallo
A pesar de la inexistencia de una estructura secundaria propiamente dicha para toda la molcula, la cadena sencilla de cualquier RNA adopta localmente variadas estructuras: horquillas, cruciformes, bucles, lazos, etc. Algunas de ellas se deben al apareamiento de bases intracatenario formando cortos tramos de doble hlice de tipo A, como se acaba de indicar. La proporcin de zonas helicoidales varia ampliamente entre distintos RNAs, pero puede alcanzar hasta un 50% de la estructura total.
7.2.3
Tipos de RNA: propiedades y estructuras particulares
Tanto en procariotas como en eucariotas existen tres tipos principales de RNA: mensajero (mRNA), de transferencia (tRNA) y ribosmico (rRNA). Adems de ellos, en eucariotas existen RNA nuclear heterogneo (hnRNA), nuclear pequeo (snRNA) y citoplsmico pequeo (scRNA), y RNAs de orgnulos (mitocondrias y cloroplastos). Todos ellos tienen en comn una funcin relacionada, directa o indirectamente, con la expresin gnica (maduracin postranscripcional y traduccin). Adicionalmente, en algunos virus el RNA juega el papel de portador de la informacin gentica, que en el resto de organismos corresponde al DNA. Las diferencias fundamentales entre los distintos tipos de RNA se resumen en la tabla. Clase Ubicacin celular mRNA citoplasma (P y E) tRNA citoplasma (P y E) rRNA citoplasma (P y E) 3 tipos, en ribosomas de procariotas: hnRNA snRNA scRNA mtRNA 4 tipos, en ribosomas de eucariotas: ncleo (E) ncleo (E) citoplasma (E) mitocondrias (E) 5% 20% 75% Cantidad s Tamao n nucletidos
estructura sencilla lineal hay 50-60 diferentes, especficos para cada aa
Caractersticas particulares
16S 600-3.000 75 a 95 23S 1.500 5S 2.900 120
forma parte de la subunidad pequea del ribosoma forman parte de la subunidad grande del ribosoma
minoritario minoritario minoritario minoritario
18S 28S 5,8S 5S
1.900 4.700 160 120 200-30.000 100-300
forma parte de la subunidad pequea del ribosoma forman parte de la subunidad grande del ribosoma transcrito primario, precursor del mRNA forma parte de ribonucleoprotenas nucleares pequeas (snRNPs)
E = eucariotas P = procariotas
s = coeficiente de sedimentacin (medido en Svedbergs, pg. 123)
73
74
7.2.3.1
RNA mensajero (mRNA)
La propuesta de la existencia de una molcula que transfiere el mensaje gentico desde el ncleo al citoplasma se debe a Frangois Jacob y Jacques Monod (premios Nobel en 1965). Dicha molcula es el RNA mensajero que, al ser una copia de la informacin contenida en la secuencia del DNA, acta posteriormente en el ribosoma como molde o plantilla para la sntesis proteica. Las caractersticas principales del mRNA son las siguientes: Se encuentra en el citoplasma de todas las clulas, en baja proporcin respecto al RNA total y con una vida media corta dada su rpida sntesis y degradacin. Aparece asociado transitoriamente al ribosoma. Sus molculas son de tamao muy diverso (en relacin con el tamao de las protenas que codifican). Es el tipo de RNA de estructura ms sencilla, con una cadena lineal, formada exclusivamente por los ribonuclesidos A, U, C y G. La composicin de bases es un reflejo de la del DNA molde del que proceden. La molcula carece de una conformacin definida: la cadena se mantiene extendida, sin adoptar estructuras secundarias ni terciarias significativas, gracias a la participacin de protenas que se asocian a ella.
7.2.3.2
RNA de transferencia (tRNA)
Fue Francis Crick quien sugiri que los aminocidos se unan a una molcula intermedia, o adaptador, antes de interaccionar con el mRNA. Efectivamente, los tRNAs actan como molculas adaptadoras en la sntesis de protenas. Esta funcin depende de una doble interaccin: Por un extremo de la molcula unen el aminocido para dar aminoacil-tRNA (pg. 302), la forma activa necesaria para la reaccin de formacin del enlace peptdico. Por el otro extremo se aparean con el mRNA, en presencia del ribosoma, transfiriendo el aminocido al pptido creciente. De esta manera, los aminocidos se ordenan correctamente en la protena, de acuerdo con la secuencia leda por el tRNA sobre el mRNA (pg. 311).
El tRNA es el mediador entre el mensaje del mRNA y la secuencia de aminocidos del polipptido que se est sintetizando:
interaccin con un aminocido
interaccin con el mRNA

A pesar de ser los RNAs de menor tamao, los tRNAs estructural. Se han aislado y estudiado muchos, de distintos comn a pesar de sus distintas secuencias, que reflejan la especificidad. presentan una gran complejidad organismos, mostrando una estructura necesidad de adaptacin a su
a) Especificidad de los tRNAs por los aminocidos

Los tRNAs constituyen una fraccin importante del RNA total y se encuentran disueltos en el citosol. Una clula puede contener hasta 60 tRNAs diferentes, es decir, en nmero superior al de aminocidos (20), puesto que cada tRNA interacciona especficamente con un solo aminocido, pero algunos aminocidos son reconocidos por ms de un tRNA (se habla en este caso de tRNAs sinnimos, pg. 296). La especificidad se indica con el nombre del aminocido en superndice (por ej., tRNAAla); los tRNAs sinnimos llevan subndices numricos (por ej., tRNATrP1 y tRNATrP2). Cuando un tRNA est unido con el aminocido se dice que est activado o cargado, se denomina aminoacil-tRNA y se indica con el aminocido como prefijo (por ejemplo, Ala-tRNAAla, Trp-tRNATrP1, Trp-tRNATrP2, etc.).
75
b) Presencia de nuclesidos infrecuentes
Una de las caractersticas de los tRNAs es que en su composicin presentan, adems de los cuatro principales, otros nuclesidos no corrientes o infrecuentes, que pueden suponer hasta un 10% del total. Generalmente se trata de derivados de los cuatro principales, A, G, C, U, as como de la hipoxantina, a menudo con grupos metilo en la base o la desoxirribosa. Adems, es caracterstica la presencia de ribotimidina. La presencia de todos estos nuclesidos est relacionada con la estructura terciaria y tiene por ello una clara influencia sobre la funcin.
in
g
G
er
p;
NH,
NII2
H-N
base: hipoxantina
k X >
34
H-N
</> '
H2N
dU
O ,N
76
c) Apareamiento de bases intracatenario
A pesar de la abundancia de nucletidos no usuales, los tRNAs muestran un cierto grado de complementariedad, es decir, de regiones con estructura secundaria en doble hlice basada en apareamientos de bases intracatenarios. Con frecuencia se observan apareamientos distintos de los de Watson y Crick, llamados genricamente de Hoogsteen: por ejemplo, G puede aparearse con U mediante un enlace menos fuerte que el enlace G=C. En otros casos, en el enlace de hidrgeno participa el 2 -OH de la ribosa. Tambin pueden existir bases enfrentadas pero no complementarias, as como una o ms bases a lo largo de la cadena separadas mediante un bucle para facilitar el acoplamiento de otras bases.
=G
tfU:
"\v\,
/Âpareamiento A=U, pero^ en posiciones atpicas: N7~HN3 y N6H202, en lugar de los pares de Watson y Crick, V^J^-HN3 y N6H2--Q^y
/Ribosa
Ribosa O ................. AA I.
/[ H - N
4 \ Nj Ribosa
9/
. Bases (UG, GG) ^ normalmente no complementarias, apareamientos distintos de Watson y Crick, imperfectos, menos fuertes que C=G
Apareamiento normal G=C de Watson y Crick. H

\
7^0 <P
_ Ribosa - O
A=UA
N-H-
Vw
8L
rH_l
N^ 2
W
H
3/^N
/l ^
/4 5
n---------- H-N \
'Enlace de H en' el que se ve implicado el v OH del azcar,
G=G=C
Apareamiento normal U=A de Watson y
H-N
\4 ____ 5
Apareamiento^ atpico, distinto de Watson y Crick, imperfecto, menos fuerte^y
Apareamiento G=C, pero doble en vez de triple y en posiciones atpicas: !V2H2"*N y N1!!O , en lugar de los pares de Watson y Crick, n2h2~o2 , n'h-a3 y o6-n4h|
77
d) Estructura secundaria en trbol

Al comparar la estructura de distintos tRNAs se observa una notable semejanza. El plegamiento ms probable es la estructura secundaria denominada en trbol (por su analoga con tres hojas y un tallo, o para otros con cuatro hojas), donde el apareamiento entre bases es mximo. En ella se distinguen: Tres brazos o asas principales; una central, II, y dos perifricas, I y III (cada una con tallo y bucle) Un brazo o asa menor (IV), de dimensin variable entre los diferentes tRNAs Un brazo abierto o brazo aceptor
Bra/O aceptor: formado por los dos extremos (5 y 3) de la Estructura secundaria general (hoja de trbol) de los tRNAs
(prcticamente invariable) 5 zonas con apareamiento (doble hlice) 3 cadena, apareados hasta el 2 o 52 ltimo nucletido. El extremo 5 es pG en la mayora de los tRNAs, mientras que el extremo 3 es CCA-OH en todos. El -OH 3-terminal es importante porque se une al grupo -COOH del aminocido; de ah el nombre de brazo aceptor.
17 pb
Brazo T. T\|/C O asa 1: contiene esa secuencia

5 pb
con dos ribonuclesidos infrecuentes (ribotimidina y pseudouridina), muy conservados.
3-4 pb
III IV
|5 pb
Brazo variable, brazo menor o asa IV: En los

tRNAs de clase I tiene entre 3 y 5 nucletidos (en este grupo se incluye el 75% de los tRNAs). Cuando la longitud es de 13 a 21 nucletidos apareados, con un lazo de unos 5 nucletidos, se habla de tRNAs de clase II.
razo D. PHU o asa UI:

tambin llamado brazo de la dihidrouridina porque contiene la base infrecuente dihidrouracilo (Ul l2). Participa en la unin del aminoacil-tRNA al ribosoma.
anticodn
Brazo del anticodn o asa II: situado en el centro de

la molcula, contiene la secuencia de tres bases o anticodn que se aparear especficamente con la secuencia triplete del mRNA o codn. La presencia de un nuclesido modificado adyacente al anticodn es tambin universal
78
ej Estructura terciaria en L
Mediante anlisis por difraccin de rayos X de cristales de tRNAs se puede observar una estructura terciaria compacta, en forma de L. sta se origina por un retorcimiento en el espacio de la estructura secundaria en trbol, impuesto por las dobles hlices locales y por puentes de hidrgeno que acercan los brazos D y T. Estos puentes son de tipos infrecuentes, incluyendo en algunos casos tripletes de bases (pg. 73). La estructura en trbol es, por tanto, slo una representacin bidimensional simplificada de la verdadera estructura tridimensional. Plegamiento del esqueleto en la estructura terciaria. Aparcamiento de bases complementarias: Se mantiene gracias a puentes de hidrgeno entre se detallan las zonas en doble hlice. bases de brazos distintos.
Vista de perfil:
tallo T
tallo del brazo aceptar
tallo D
. tallo del brazo del anticodn
Diversas representaciones de la molcula completa:
^nucletido' 3-terminal: esqueleto base esqueleto bases nucletido 5-terminal: esqueleto base
V ____
J
anticodn:
esijueSet
bases
El conocimiento detallado de esta estructura permite comprender una peculiaridad de los tRNAs: todos son distintos (por tener distinta secuencia e interaccionar con un codn de mRNA y un aminocido especficos), pero al tiempo son de algn modo similares (por adoptar una estructura terciaria comn, unirse a ribosomas y ser reconocidos por los factores que intervienen en la traduccin).
79
7.2.3.3
RNA ribosmico (rRNA)
Es el soporte estructural y componente principal de los ribosomas. Existen distintos tipos de rRNA en cada clula procariota y eucariota, con masas moleculares diversas, constituyendo la mayor parte del RNA total (75%). Al igual que el tRNA, presentan un alto contenido de nuclesidos infrecuentes (H7, T y aqullos con bases metiladas, fundamentalmente). Los RNAs ribosmicos adoptan una conformacin compleja. Estn formados por una sola hebra con regiones helicoidales cortas resultantes del apareamiento intracatenario de bases. Son molculas con muchos repliegues sobre s mismas, muy flexibles y deformables, que se comportan hidrodinmicamente como espirales al azar, especialmente a baja fuerza inica o alta temperatura. Parece que su estructura constituye un armazn o molde sobre el que se ensamblan varias protenas para dar lugar al ribosoma.
Prediccin de plegamiento para los rRNA 5S y 16S de E.coli, bajo una conformacin con el mximo nmero de apareamientos de bases:
Modelos tridimensionales del rRNA 5S, obtenido del oocito de la rana Xenopus laevis. Obsrvese su similitud con el de E. coli
En eucariotas, la mayor parte del RNA presente en el ncleo son los transcritos primarios, molculas obtenidas directamente de la transcripcin del DNA y que se convertirn en RNA maduro tras sufrir el proceso de maduracin postranscripcional. El tamao del mayor transcrito primario precursor del rRNA vara entre 6 y 14 kb, segn la especie (con un coeficiente de sedimentacin de 35 a 47S). Poco despus de ser sintetizado, ese pre-rRNA es escindido para dar tres rRNAs maduros, de 28S, 18S y 5,8S; stos, junto al rRNA 5S (producto de un gen independiente y, por ello, de un pre-RNA diferente) son los RNAs que constituyen la mayor parte de los ribosomas eucariticos (pg. 80). En procariotas, un nico pre-rRNA da lugar, tambin por procesamiento postranscripcional, a rRNAs maduros de 16S, 28S y 5S, que forman el ribosoma procaritico (pg. 80). El mismo precursor produce adems algunos tRNAs.
7.2.4
Ribozimas: funcin cataltica de algunos RNAs
Algunas molculas de RNA son capaces de actuar como biocatalizadores; de ah que el concepto clsico de enzima haya sido ampliado ms all de las protenas. A estos RNAs con actividad cataltica, es decir, con capacidad de disminuir la energa de activacin de determinadas reacciones bioqumicas, se les llama ribozimas, para distinguirlos de las enzimas proteicas. La capacidad cataltica estriba igualmente en la gran complejidad y diversidad de estructura tridimensional que pueden adoptar los RNAs, lo que les permite adaptarse al sustrato, as como en su reactividad gracias a los grupos funcionales de bases y esqueleto. De hecho, se han podido realizar estudios cinticos con algunas ribozimas, verificando que cumplen la cintica de Michaelis-Menten, tpica de enzimas proteicas. Se piensa que las ribozimas fueron los primeros biocatalizadores que aparecieron en la evolucin, siendo desplazados posteriormente por las enzimas proteicas, ms verstiles. Los RNAs seran as las molculas primordiales de la vida, antes de que evolucionasen los DNAs como portadores de informacin gentica y las protenas como catalizadores. Se conocen ribozimas que actan en diversos tipos de reacciones de inters en Biologa Molecular e Ingeniera Gentica:
80
7.2.4.1 Accin cataltica en la maduracin de RNA

El primer ejemplo conocido de molcula de RNA con actividad cataltica fue la RNasa P (se ha estudiado en procariotas, pero parece existir una actividad similar en eucariotas). Esta enzima est formada por molculas de protena y de RNA, pero se ha comprobado que la actividad cataltica reside en el componente RNA. Reconoce como sustrato al precursor mixto de rRNAs y tRNAs en procariotas y cataliza una de las reacciones de su maduracin postranscripcional (para dar los rRNAs y tRNAs funcionales), en concreto la generacin de los extremos 5 de los tRNAs (pg.283).
sustrato:
RNA precursor mixto de rRNAs y tRNAs
enzima:
RNasa P
producto:
pre-tRNAs parcialmente procesados (extremo 5 definitivo y 3 inmaduro)
JIlili
(posteriores reacciones de maduracin)
tRNAs
precursor de rRNAs
(posteriores reacciones de maduracin)
rRNAs
7.2.4.2 Accin autocataltica en la eliminacin de intrones

La siguiente actividad ribozimtica encontrada fue la del precursor de rRNA en el protozoo Tetrahymena (eucariota unicelular). A diferencia del caso anterior, este ribozima acta de forma autocataltica, es decir, el sustrato es su propia molcula. Mediante un mecanismo similar actan como ribozimas otros pre-RNAs procariotas y eucariotas, aqullos que poseen intrones de tipo I y II. Los intrones (pg. 245) son secuencias del RNA precursor que no se traducen a protena o no forman parte del RNA maduro, pues se eliminan durante la maduracin; el pre-RNA comprende, pues, el RNA maduro y los intrones. Los tipos de intrn y los procesos de maduracin del RNA precursor por corte y empalme se estudian en el procesamiento postranscripcional del RNA (pg. 280). En este caso no se puede estrictamente hablar de catlisis, pues uno de los requisitos es que el catalizador no se consuma en el proceso. Sin embargo, el producto final de una serie de reacciones de autohidrlisis del intrn de Tetrahymena es una molcula (derivada del propio intrn y denominada L-19 IVS) que es capaz de catalizar reacciones de hidrlisis y esterificacin de oligonucletdos externos a ella. Por tanto, si bien no lo son el pre-RNA o el intrn originales, L-19 IVS s es un verdadero biocatalizador.
rRNA maduro
pre-rRNA
de Tetrahymena
paso 1 Ia autoescisin
paso 2 2* autoescisin y empalme
centro
activo
L-19 IVS
intrn liberado; sigue teniendo actividad enzimtica sobre s mismo y sobre otrps RNA sustratos:
CpCpCpC
+
sustratos sintticos: CpCpCpCpC + CpCpCpCpC
\
transesterificacin (pg.
281)
CpCpCpCpCpC
81
7.2.4.3
Accin cataltica y autocataltica en viroides: ribozimas de posible aplicacin teraputica
Los viroides son molculas circulares de RNA monohebra con capacidad para infectar plantas. En algunos de ellos se han encontrado tambin ribozimas capaces de actuar, de forma anloga al caso anterior, sobre su propia molcula o sobre secuencias de RNA de molculas diferentes. Estas ribozimas contienen dos componentes esenciales: por un lado, las secuencias de reconocimiento del RNA sustrato (por apareamiento de bases complementarias) y, por otro, su centro cataltico, que adopta una estructura tridimensional peculiar, denominada cabeza de martillo (hammerhead), y produce la escisin del RNA sustrato, inactivndolo.
hebra sustrato
(puede ser una molcula ajena o una parte del propio ribozima)
sitio de corte] (3) 1(5)
(3) (5)
hebra cataltica = ribozima
accin cataltica (o autocataltica)
productos: (3) 1(5) fragmentos de la hebra sustrato
la enzima no se consume en el proceso de catlisis
Modelo tridimensional de la ribozima unida con el sustrato. Obsrvense las regiones de apareamiento de bases, con doble hlice local, de la hebra cataltica consigo misma y con la hebra sustrato (La trayectoria del esqueleto se ha destacado uniendo los tomos ^^dc P con una barra gruesa)
Se han ensayado anlogos sintticos de alguno de estos ribozimas (obtenidos por ingeniera gentica) para la destruccin selectiva de molculas de RNA con secuencias caractersticas. Este es un planteamiento de terapia gnica, dentro de la estrategia de inhibicin dirigida de la expresin gnica. Se trata de preparar ribozimas artificiales con secuencias de reconocimiento qu e les permitan unirse antisentdo a un mRNA, de forma que el centro cataltico lo escinda, suprim iendo la sntess de la protena correspondiente. (El concepto de cadena antisentido se introducir en el tema de transcripcin, pg. 248.) Otro tipo de planteamiento de terapia, dentro de la estrategia de correccin dirigida de mutaciones, consiste en e l corte mediante ribozimas de un transcrito precursor de RNA cuya secuencia estuviese mutada (por proceder de un gen mutado), de forma que la escisin ocurra alrededor de la mutacin y resulte un transcrito corregido.
7.2.4.4
Accin cataltica transpeptidasa en la sntesis de protenas
El cuarto ejemplo lo constituye la ribozima que ejerce la actividad transpeptidasa o peptidiltransferasa, responsable de la formacin del enlace peptdico en la biosntesis proteica, entre los residuos aminocidos situados en los sitios A y P del ribosoma (pg. 313). En este caso, la accin ribozimtica radica en el rRNA 23S, uno de los componentes de la subunidad mayor (50S) del ribosoma procaritico, y posiblemente tambin en el rRNA homlogo de eucariotas (rRNA 28S de la subunidad 60S).
LOS RIBOSOMAS
82
ribosoma
pcptidil-tRNA
tRNA-O-CO-NH2
aminoacil-tRNA
tRNA-OH
actividad pep ti di 1 tran sferasa tRN A-( >- co
NH
co- aan -NH-co- aa^.,
I NH ...
(n)peptidil-tRNA + aminoacil-tRNA ---------------- > (n+l)peptidil-tRNA + tRN A libre

A nivel fisiolgico, la RNasa P y la peptidiltransferasa ribosmica son posiblemente los que mejor reflejan el parecido de las ribozimas con las enzimas proteicas, a saber: actan sobre un sustrato especfico, aceleran la reaccin varios rdenes de magnitud, no se destruyen durante la catlisis y al parecer se comportan de acuerdo con la cintica michaeliana.
7.3
LOS RIBOSOMAS
Los ribosomas son partculas subcelulares, u orgnulos, de importancia crucial para la transmisin de la informacin gentica, al constituir el lugar fsico donde se realiza la sntesis de protenas. Se pueden considerar como estructuras qumico-mecnicas pues, por un lado, se desplazan sobre el mRNA ordenando la interaccin de sus codones con los correspondientes anticodones del tRNA y, por otro, proporcionan el entorno necesario para que los aminocidos formen los enlaces peptdicos del polipptido en crecimiento. Estructuralmente, los ribosomas son conjuntos plurimoleculares de protenas y rRNAs (35 y 65% en peso, respectivamente), con un tamao de 20 a 23 nm. Es decir, son nucleoproteidos. El estudio de otros nucleoproteidos caractersticos, los virus, ya se aborda generalmente en una materia propia, la Virologa.
7.3.1
Localizacin celular
En cada clula existen varios miles de ribosomas (por ej., ms de 15.000 en un E. coli), que llegan a suponer un cuarto del peso seco de la clula. Se encuentran en el citosol, as como en la matriz mitocondrial y en el estroma de cloroplastos. Pueden estar en forma libre, como partculas discretas, pero a menudo se observan en forma de hilera, agrupados sobre un mRNA; en este caso se les llama polisomas o polirribosomas; su grado de agrupacin o polimerizacin depende de la actividad metablica celular. Los ribosomas del citosol de eucariotas son ms complejos en composicin y mucho mayores en tamao que los ribosomas bacterianos. Los ribosomas de mitocondrias y cloroplastos eucariticos son semejantes a los bacterianos (citoslicos). Evolutivamente para todos los tipos se ha conservado una misma estructura secundaria, pero no la secuencia que la crea. EUCARIOTAS (animales, plantas, levaduras, hongos) PROCARIOTAS (bacterias)
ms grandes
LOS RIBOSOMAS
83
7.3.2 7.3.2.1
Caractersticas diferenciales de los ribosomas procariticos y eucariticos Origen
Los precursores del rRNA muestran una gran diversidad en su secuencia, que se manifiesta en la aparicin (durante el proceso de maduracin postranscripcional) de distintos tipos de rRNAs, caracterizados especialmente por su diferente coeficiente de sedimentacin, s.
7.3.2.2
Composicin
Los ribosomas estn formados por dos subunidades de tamao diferente y forma irregular, cada una constituida por uno o ms rRNAs y varias protenas de diversa masa molecular (entre 6 y 75 kDa). Tanto el ribosoma completo como sus subunidades y los rRNAs componentes se denominan segn su coeficiente de sedimentacin. Las protenas, por su parte, se designan por nmeros consecutivos precedidos por L (large) o S (small), segn pertenezcan a la subunidad grande o pequea, respectivamente.
Diferencias en origen, composicin y estructura de los ribosomas procariticos y eucariticos
ribosoma procaritico
precursor de rRNA de procariotas pre-(rRNA+tRNA) (30S)
rRNA K.S uno o varios tRNAs rRNA rvs rRN A 5S uno o varios iRNAs
ribosoma eucaritico
precursores de rRNA de eucariotas prc-rRNA pre-rRNA grande (45 S) jequeo rRNA rRNA (5SrRNA
18S 5.8S 28S 5S
\ \
(maduracin postranscripcional)
rRNA 16S
l RNA (65% peso) ] 21 protenas (35% peso)
V.\,
30S
Mr= 900.000 asociacin
no covalente
W polisoma ribosomas libres
recurdese que la suma de los valores S de ambas subunidades no es igual al valor S del V^ribosoma completoJ
84
LOS RIBOSOMAS
85
7.3.2.3
Estructura
La estructura de los ribosomas, igual en todas las clulas, es muy caracterstica; se ha dilucidado empleando difraccin de rayos X, difraccin de neutrones, microscopa electrnica en combinacin con mtodos inmunolgicos, etc. Debido a su enorme tamao (MDa) y la complejidad de su asociacin interna, el estudio de la estructura, dinmica y funcin de los ribosomas constituy un importante reto investigador. Las dos subunidades se asocian por interacciones no covalentes, de una forma peculiar, como si la subunidad pequea llenase el hueco de la grande, dejando una hendidura o tnel entre ambas por la que pasa el mRNA a medida que el ribosoma se Estructura en dos subunidades de los ribosomas y situacin aproximada de sus centros activos
Disposicin sobre el ribosoma del mRNA y de la cadena polipeptdica naciente

subunidad grande polipptido naciente
subunidad
pequea
mRNA
desplaza durante el proceso de traduccin y de la que emerge la cadena polipeptdica.
centro activo
GTPasa
(movimiento de tRNAs y mRNA)
subunidad grande, mayor o pesada: globular, 3 protuberancias
centro activo peptidiltransfer asa centro unin mRNA de del
subunidad pequea, menor o ligera: aplanada, 2 protuberancias
7.3.3
Separacin de los ribosomas, subunidades y componentes
Tanto los ribosomas individuales como sus subunidades y sus componentes (RNAs y diferentes protenas) se pueden separar mediante centrifugacin en gradientes de sacarosa o de cloruro de cesio, en presencia de concentraciones definidas de Mg +2. Las subunidades aisladas no son activas. Por otro lado, si se mezclan los componentes (rRNAs y protenas) a pH y fuerza inica correctos, se asocian espontneamente en unidades funcionales.
a
polisoma ribosomas libres
'rr
(otros componentes)
ribosomas (otros componentes)
Separacin de los componentes de los ribosomas procariticos
\ / centrifugacin en gradiente de sacarosa, con Mg 10 mM
subunidades
30S
subunidades 50S
centrifugacin en gradiente de sacarosa, con Mg2+ 0.1 mM subunidad SOS subunidad 30S
protenas partculas ncleo (core)
centrifugador gradiente de CsCI, con elevada/fuerza inica
protenas desprendidas
protenas 0 desprendidas A
ncleo 40S
ncleo 23S
X" \ urea y sales fenol
/ \ fenol urea y sales
*A
protenas del ncleo rRNA 23S 5S
rRNA 16S
21 protenas: 35% peso
protenas del ncleo
2 RNAs: 65% peso 1 RNA: 65% peso
86
Tema 8
Condensacin del DNA y cromosomas

8.1 Condensacin del DNA en eucariotas ............................................................................................................................ 83 8.1.1 Protenas componentes de la cromatna .............................................................................................................. 84 8.1.1.1 Hstonas ............................................................................................................................................ 84 8.1.1.2 Protenas no histonas ........................................................................................................................ 84 8.1.2 Niveles de condensacin del DNA nuclear eucaritico ......................................................................................... 85 8.1.2.1 Disposicin en nucleosomas y fibras de 10 nm .................................................................................. 85 8.1.2.2 Formacin de la fibra de 30 nm .......................................................................................................... 87 8.1.2.3 Cromatina o cromosoma interfsico ................................................................................................... 87 8.1.2.4 Cromosoma metafsico ..................................................................................................................... 8 8 Estudio del cromosoma metafsico................................................................................................................................ 88 8.2.1 Aspectos citogenticos ........................................................................................................................................ 8 8 8.2.1.1 Morfologa de los cromosomas .......................................................................................................... 8 8 8.2.1.2 Cariotipo y su anlisis ........................................................................................................................ 89 8.2.1.3 Bandeado .......................................................................................................................................... 90 8.2.2 Regiones con significado funcional ..................................................................................................................... 92 8.2.2.1 Centrmero ........................................................................................................................................ 92 8 . 2 . 2 . 2 Telmeros .......................................................................................................................................... 92 Dotacin gentica en eucariotas .................................................................................................................................... 93 8.3.1 Nmero de cromosomas (n): carcter haploide y diplode ................................................................................... 93 8.3.2 Contenido de DNA: valor C ................................................................................................................................. 94 8.3.3 Locus y alelo ....................................................................................................................................................... 94 8.3.4 Genotipo, fenotipo y dominancia ......................................................................................................................... 95
8.2
8.3
8.1
CONDENSACIN DEL DNA EN EUCARIOTAS
Para completar la descripcin de la estructura del DNA como material gentico y como requisito previo al estudio del ciclo celular (tema 9), es conveniente analizar el complejo problema de la condensacin del DNA nuclear, que ocurre a lo largo de la interfase de dicho ciclo. Este aspecto, junto al proceso enzimtico de la replicacin del DNA (tema 12) durante la fase S, es de la mayor importancia desde el punto de vista bsico y de sus aplicaciones. Como ya se ha indicado, la condensacin del DNA comprende dos aspectos, tericamente independientes pero funcionalmente relacionados y subordinados entre s:
f
Superenrollamiento propiamente dicho de la molcula de B-DNA (doble hlice dextrgira). Es anlogo al superenrollamiento negativo ya descrito para procariotas (pg. 66); se conoce peor en eucariotas por su mayor complejidad, debida en parte a la gran magnitud del genoma.
Condensacin del DNA / gnipaquctamcnt; plegamiento o compactacin de la molcula de DNA
debido a la asociacin con protenas, para dar lugar a nucleoprotenas. Se estudia en este tema. Este aspecto apenas existe en procariotas y orgnulos de eucariotas, donde no hay histonas y la condensacin se basa slo en el , superenrollamiento de la doble hlice.
La condensacin del DNA desde cromatina a cromosoma ocurre de forma gradual durante la fase G2 del ciclo celular (tema 9), mientras que el proceso inverso, la descondensacin del DNA, comienza despus de la divisin celular (fase M) y contina durante la fase Gi hasta alcanzar de nuevo la condicin difusa, que permite la replicacin (fase S). No se conocen con precisin los aspectos moleculares de ambos procesos, aunque se asume una gran analoga y se considera, por tanto, que ambos transcurren por los mismos mecanismos, en sentido inverso..
8.1.1 8.1.1.1
Protenas componentes de la cromatina Histonas
Son las principales protenas componentes del material gentico de eucariotas (equivalentes en masa al DNA). Su funcin
84
CONDENSACIN DEL DNA Y CROMOSOMAS
fundamental es estabilizar la estructura del DNA, contribuyendo a compactarla, para facilitar su empaquetamiento. Estructuralmente, las histonas constituyen una familia de protenas semejantes, de tamao relativamente pequeo y con elevado contenido (casi 1/3 del total) de aminocidos bsicos (pl de 9 a 10). Gracias a ello, muestran naturaleza policatinica a pH fisiolgico (numerosas cargas positivas en cada molcula) y se asocian fuertemente, mediante interacciones electrostticas, con los grupos fosfato del esqueleto polianinico del DNA.
% Lisina I-Il H2A H2B

H3 H4
% Arginina 1,3-2,6 9,3 6,4 13,3 13,7
%(Lys+Arg) 27,4-30,8 20,2 22,4 22,9 24,5
N de aminocidos 215-244 129 125 135 102
Masa molecular 21,1-23,0 kDa 14,0 kDa 13,8 kDa 15,3 kDa 11,2 kDa
24,8-29,5 10,9 16,0 9,6 10,8
Existen cinco tipos principales de histonas bien caracterizadas, que se diferencian en su composicin y, como se ver despus, en su papel estructural en la organizacin del nucleosoma y cromosoma. La histona H1 se presenta con mayor variabilidad de secuencia y tamao en distintas especies o tejidos, mientras que las otras cuatro estn altamente conservadas. En algunos casos, H1 es sustituida por una variante, denominada H5, con especial afinidad por la cromatina, lo que refuerza el empaquetamiento y la inactividad transcripcional. El grado de condensacin del DNA se regula en parte mediante la acetilacn y fosforilacin de las histonas (pg. 326), afectando as a la accesibilidad del DNA para la transcripcin; de este modo las histonas intervienen en el control de la expresin gnica.
8.1.1.2
Protenas no histonas
En la cromatina se pueden encontrar otras protenas, menos abundantes, ms variables entre tejidos y especies y en general peor caracterizadas:
a) Con funcin estructural

Protenas bsicas: Protaminas: Desempean la funcin equivalente a las histonas en tipos celulares concretos, particularmente el espermatozoide. Son protenas pequeas (50 aminocidos, en algn caso) con elevada proporcin de Arg, Ala y Ser, y estructura predominantemente a-helicoidal. Su menor tamao permite la compactacin del DNA en el espacio mnimo disponible en el espermatozoide. Protenas cidas: HMG: Hasta un 5% de las protenas nucleares corresponden al grupo llamado HMG (high mobility group), protenas del grupo de alta movilidad electrofortica, por su carcter cido, relativamente pequeas. Algunas se asocian al nucleosoma (al menos in vitro), mientras que otras nteraccionan con el DNA espaciador (pg. 8 6 ). Este grupo incluye algunos factores de transcripcin. Protenas del esqueleto o matriz nuclear: Esta estructura, que sirve de soporte o gua en el empaquetamiento de la cromatina (pg. 87), est formada por diversas protenas, incluyendo algunas HMG y otras protenas de carcter cido.
b) Con otras funciones

Asociadas a la cromatina, aunque en mnima cantidad, se pueden encontrar numerosas protenas, muy diferentes, que intervienen en la replicacin y transcripcin (temas 12 y 19) y en la propia regulacin del grado de condensacin de la cromatina: DNA- y RNA-polimerasas, sus protenas auxiliares, factores de replicacin, factores de transcripcin, receptores hormonales, topoisomerasas, etc.
85
8.1.2
Niveles de condensacin del DNA nuclear eucaritico
Se puede resaltar el grado de condensacin alcanzado recordando que la longitud del DNA es varios rdenes de magnitud superior a las dimensiones de las estructuras celulares que lo albergan (pg. 6 6 ). Se denomina grado de condensacin o de empaquetamiento al cociente entre la longitud del B-DNA en doble hebra y el tamao del mismo una vez condensado; este parmetro se utilizar para comparar los distintos niveles de compactacin. La condensacin del DNA puede estudiarse en cuatro niveles, aunque esta divisin es relativa, ya que todava no se comprende con detalle cmo acontece este fenmeno a nivel molecular. Es importante indicar que la condensacin y descondensacin a travs de esos niveles est estrechamente asociada a la progresin por las distintas fases del ciclo celular (pgs. 1 0 0 -1 0 1 ).
Cromosoma metafsico
(2 cromtidas)
Nivel 4
Heterocromatina Bucles de cromatina

II /\ /\
1 |jm
(1000 nm)
Eucromatina Cromosoma interfsico ,7

Asas (fibra 30 nm) > Esqueleto nuclear > (protenas)
^
300 nm (hasta
y Nivel 3
(grado de condensacin: ~ 50.000) 100 kb)
O <r> O
o
Fibra de 30 nm / (solenoide)
xv
/\
Nivel 2
(grado de condensacin: 40) 53
53 CU rD 53 c/ & O*
Fibra de 10 nm (nucleosomas)
DNA
espaciador (entre nucleosomas; longitud variable) ' 2 nm
Cadena de DNA (doble hlice)
8.1.2.1
Disposicin en nucleosomas y fibras de 10 nm
El nucleosoma es la unidad bsica o elemental de la cromatina y los cromosomas. Constituye un patrn regular de interaccin entre DNA e histonas, responsable de la organizacin estructural del material gentico en todos los organismos eucariotas (en cualquier tipo celular y etapa del ciclo). Tanto el nucleosoma como sus componentes y las fibras en las que se integra han sido obtenidos y analizados por digestin con DNasas, tcnicas de entrecruzamento (icrosslinking), hibridacin, difraccin de rayos X, microscopa electrnica, difraccin de neutrones, dicrosmo circular, ultracentrifugacin analtica, etc. La propuesta de la existencia del nucleosoma surgi del estudio de la accin de DNasas: sobre un DNA nativo, el tamao de los fragmentos producidos es siempre mltiplo de 200 pb, mientras que si
86
actan sobre un DNA previamente liberado de histonas, los fragmentos son de cualquier tamao. Esto sugiri que la unin de las histonas protege regiones de DNA de unos 200 pb. Cada nucleosoma est formado por 9 molculas de histonas y un tramo de DNA. Bajo ciertas condiciones experimentales puede liberarse la histona H1, localizada externamente, lo que hace accesible a la DNasa una parte adicional del DNA. El nucleosoma queda as reducido a la llamada partcula ncleo (core), formada por un octmero de histonas rodeado por DNA. El arrollamiento levgiro del DNA sobre las histonas supone un superenrollamiento negativo de la cadena de DNA (en procariotas el superenrollamiento se consigue por simple retorcimiento del DNA circular, sin implicacin de protenas, y no existen nucleosomas).
200 pb DNA (H2A,H2B,H3,H4)2
^^,5 nm
DNA nativo (cromatina)
DNasa
cambio de fuerza inica DNasa
La histona H1, de mayor tamao otras, interacciona con el exterior de la partcula ncleo y con los tramos de DNA entrante y saliente del
55 pb
N-terminaJ C-terminai
La doble hebra de DNA (hlice dextrgira) rodea (1,75 vueltas) al octmero de histonas en un superenrollamiento de sentido levgiro
La situacin \ / externa del DNA ^ sobre el octmero de histonas lo mantiene accesible para interaecionar con jotras protenas J
'
"x
Las partes ms hidrofbicas de las 8 histonas se disponen hacia el interior, mientras que en la superficie del octmero se sitan los residuos bsicos, que as interaccionan electrostticamente con el DNA polianinico. Los extremos N-terminales de las histonas sobresalen de la partcula ncleo, y son dianas de mclilacin, acetilacin Finalmente, otras y fosforilacin, modificaciones que alteran la protenas no histonas tambin participan en la estructura: HMG-14 y HMG-17 se condensacin de la cromatina
asocian, al menos in vitro, con cada nucleosoma, mientras que HMG-1 y HMG-2 interaccionan con el DNA espaciador. Una misma molcula de DNA envuelve sucesivamente a distintos nucleosomas y los conecta entre s. La porcin presente entre dos nucleosomas sucesivos se denomina espaciador, ligador o DNA internucleosmico (linker); su longitud puede variar entre 2 0 y ms de 1 0 0 pb, dependiendo del organismo o incluso del tejido dentro de un mismo organismo. Esta estructura de nucleosomas espaciados a lo largo de la molcula de DNA se denomina fibra bsica de cromatina o fibra de 10 nm, pues su grosor corresponde al dimetro del nucleosoma. El grado de empaquetamiento alcanzado es unas 6 veces superior al de la doble hlice del DNA extendida. La fibra de 10 nm tambin se llama estructura en cuentas de rosario, por su aspecto caracterstico al microscopio electrni co, generalmente slo observado cuando se prepara in vitro a baja fuerza inica (por ejemplo, 1 mM), mientras que dentro de la clula la cromatina se encuentra mayoritariamente en formas ms condensadas, y su disposicin en este estado relativamente extendido se limita, en todo caso, a pequeas zonas.
87
8.1.2.2
Formacin de la fibra de 30 nm
En las preparaciones de cromatina obtenidas in vitro a mayor fuerza inica (por ejemplo, hasta 100 mM), la fibra de 1 0 nm se arrolla en sentido levgiro para dar lugar a una forma ms condensada, denominada solenoide o fibra de 30 nm, que supone un grado de empaquetamiento 40 veces superior al de la doble hlice original. Esta fibra contiene algo ms de 6 nucleosomas por cada vuelta de solenoide. Aunque se desconoce su estructura exacta in vivo, se cree que la histona H1 queda situada en el interior del solenoide, acercando los nucleosomas entre s. De hecho, experimentalmente la formacin de la fibra de 30 nm, a diferencia de la de 10 nm, requiere la presencia de H1. Esta es probablemente la forma fisiolgica ms descondensada de la cromatina, adoptada por la mayora del DNA durante la interfase.
8.1.2.3 Cromatina o cromosoma interfsico

Este nivel de condensacin supone la presencia de lazos y superenrollamientos de la estructura anterior. Los bucles o asas radiales, formados por unos 50 100 kb de fibra de 30 nm, emergen de un armazn de protenas no histonas denominado ncleo o andamiaje central, matriz nuclear o proteica, o esqueleto nuclear. Estos bucles sufren superenrollamiento, regulado por topoisomerasas asociadas al esqueleto. Parece que, adems de contribuir al empaquetamiento del DNA, los bucles constituyen unidades transcripcionales, al haberse observado la presencia dentro de un solo bucle de un gen completo o bien de un grupo de genes regulados de forma comn. Es tpica la observacin de asas radiales en la interfase de cromosomas politnicos gigantes de larvas de insectos y en cromosomas plumosos meiticos de oocitos de anfibios. A partir de esta estructura se forman enrollamientos superiores, que hacen que la cromatina en la interfase presente en el ncleo un grado de condensacin variable; se calcula que se multiplica el grado de condensacin del DNA por 1.000 2.000. Esta diversidad local en la densidad de condensacin se observa en forma de la presencia simultnea de eucromatina y heterocromatina en una clula en interfase. Heterocromatina Aspecto al microscopio bajo tincin (definicin original) Grado de condensacin del DNA Se tie intensamente con el colorante May-GrnwaldGiemsa Mxima condensacin de la cromatina (prxima, aunque menor, a la del cromosoma metafsico) Eucromatina (cromatina verdadera) Se tie dbilmente aspecto difuso y con
Forma menos condensada
Contribucin al total de la cromatina
Minoritaria; slo algunas porciones del material gentico Mayoritaria durante la interfase se encuentran en esta forma: Heterocromatina constitutiva: regiones del genoma que se encuentran permanentemente en forma de heterocromatina (durante toda la interfase) y en todas las clulas Se descondensa el tiempo mnimo necesario para replicarse durante la fase S del ciclo celular. Incluye el DNA satlite (tema 10), concentrado especialmente en reglones telomricas y centromrica de los cromosomas (pg. 92) Heterocromatina facultativa: se encuentra como heterocromatina slo en algunas clulas de un mismo organismo o en algunos individuos de una especie; puede pasar a eucromatina, en respuesta a determinadas seales Uno de los ejemplos es la inactivacin de uno de los 2 cromosomas X en la mujer, puesto que se puede inactivar tanto el X materno como el paterno. Uno permanece condensado como heterocromatina, mientras el otro est en forma de eucromatina
Al final de la fase G2 , previa a la divisin por mitosis 0 meiosis, toda la cromatina de la clula adopta la forma de heterocromatina (antes de condensarse an ms para dar el cromosoma) Accesibilidad de la molcula de DNA para su interaccin con protenas (DNA polimerasas, RNA polimerasas, factores de transcripcin...; pg. 250) No es accesible, debido a su elevada condensacin. Se habla de cromatina transcripcionalmente inactiva. Se replica al final de la fase S. Los genes que contiene no se expresan Es accesible: cromatina transcripcionalmente activa. Se replica al principio de la fase S. Sus genes se expresan
88
8.1.2.4
Cromosoma metafsico
Aunque al final de la profase cada cromosoma ya est condensado como heterocromatina, durante la metafase se condensa an ms, adquiriendo el aspecto tpico de los cromosomas metafsicos, corpsculos observables al microscopio ptico que muestran, en general, aspecto de bastoncillos con dos cromtidas ms o menos separadas entre s. Las fibras de heterocromatina se arrollan en una primera espiralizacin para formar una espiral menor de paso muy pequeo, que se arrolla a su vez sobre s misma (en unas 10-30 vueltas) para dar la espiral somtica. Con esa doble espiralizacin se acorta la cromtida a una vigsima parte, sin aumentar su dimetro. Esto la hace ms visible al microscopio ptico. Algunas regiones de la cromtida se arrollan slo en espiral menor, como, por ejemplo, las del centrmero.
8.2 8.2.1
ESTUDIO DEL CROMOSOMA METAFSICO Aspectos citogenticos Morfologa de los cromosomas
8.2.1.1
Se llama centrmero, constriccin primaria o central a la regin ms estrecha del cromosoma, por la que permanecen unidas las dos cromtidas hermanas. El centrmero delimita los brazos cromosmicos (cuatro antes de la mitosis, dos tras ella). Los brazos cortos se designan con la letra p (de petit) y los largos con q (de queue). Cada brazo se nombra, pues, por el nmero del cromosoma al que pertenece, seguido de la letra p o q. Por ejemplo, 6p es el brazo corto del cromosoma 6 , 8q el brazo largo del cromosoma 8 , etc. Los cromosomas se clasifican atendiendo a la posicin del centrmero y, por tanto, segn el tamao relativo de los brazos:
Cromosomas mctacntricos: brazos de tamao similar Cromosomas submctacntricos: brazos de tamao diferente Cromosomas acrocntricos: un brazo muy pequeo
antes de la mitosis (cromosoma doble, DNA duplicado, 2C' 2 cromtidas, 4 brazos)
En los cromosomas acrocntricos es caracterstica la presencia de satlites; en ellos se encuentran los genes mltiples de rRNA 18S y 28S satlite cromosmico
brazo menor (p) centrmero o constriccin primaria
tras la mitosis (cromosoma sencillo, DNA simple, C, l cromtida, 2 brazos)
En los brazos cortos de los cromosomas acrocntricos (excepto el Y) existen, adems, otros estrechamientos de la cromtida, denominados constricciones secundarias, zonas en las que la espiral somtica presenta un dimetro ms reducido. Delimitan una seccin terminal en el cromosoma, a modo de una pequea esfera, a la que se llama satlite cromosmico.
ESTUDIO DEL CROMOSOMA METAFSICO
Clasificacin de los cromosomas humanos, segn: tipo (Metacntrico, Submetacntrico o Acrocntrico) tamao (Grande, Mediano, Pequeo) grupo de clasificacin (A,B,C,D,E,F,G)
U :
i S S ^TT B B B r j B T T T 1 9 1 9 b
cromosoma: I tipo: M AA tamao: grupo: G G 2 3 S G A 4 MS G B
5
S
6
S
7
S
8
S
9
S
10
S M
fi
t-
f i
:
17
tipo: AAAM tamao: M M M P DD grupo: S P D
" i
T T i 18 19 20
S P M P M P
PT 0
-021 n
A P A P
22
8.2.1.2 Cariotipo y su anlisis
x 2n Z=> Cariotipo
conjunto de cromosomas (sin bandeado)

conjunto de cromosomas con bandeado (en algunos textos a esto se le llama tambin cariotipo)
Cariotipo =
constitucin cromosmica o complemento cromosmico de un individuo. Es un rasgo caracterstico de cada especie: todos los organismos de una especie tienen el mismo cariotipo. Sin embargo, especies muy similares pueden tener cariotipos muy diferentes.
2 x 2n
Cariograma
x 2n C=> Idiograma
representacin esquemtica del cariograma (en algunos textos se usa cariograma como sinnimo)
Son varios los mtodos desarrollados para el anlisis del cariotipo. Normalmente, este estudio se realiza sobre cromosomas en el estado de prometafase o metafase. Las preparaciones de cromosomas metafsicos se emplean adems para analizar anomalas cromosmicas, determinar la presencia o ausencia de cromosomas extra. A este fin, el mtodo original y ms sencillo de obtencin de cromosomas parte de leucocitos, como clulas nucleadas del organismo ms asequibles.
90
Preparacin de clulas para estudiar el cariotipo

1. Se cultivan las clulas de una muestra de sangre u otro tejido en un medio nutritivo con agentes estimulantes de la mitosis (mitgenos como fitohemaglutinina)
Anlisis del cariotipo

Los cromosomas en el cariotipo humano se clasifican en grupos (A, B, C, D, E, F y G), en funcin de su tamao y de la posicin del centrmero. se caracterizan tambin por su patrn de bandas
Se aade un inhibidor de la formacin del huso mittico (antimitticos, p.ej., colchicina) para detener el crecimiento celular de los leucocitos al llegar a metafase )
cromosomas. stos aparecen como corpsculos teidos uniformemente

72 h
^Tse lavan las clulas conN medio fresco, se tratan con disolucin hipotnica para que se hinchen y los cromosomas se extiendan, y se aade un fijador (por ejemplo, metanol+actico 3:1)
^3. Se recogen'' las clulas por ^centrifugacin ^

7. Se recorta la foto, se emparejan y ordenan los cromosomas
suspensin de clulas tijadas
5. Las clulas, que permanecen enteras y con sus cromosomas intactos, se extienden sobre un portaobjetos y se observa al microscopio el conjunto de
...ejor caracterizacin individual de los cromosomas se usan las tcnicas de bandeado o bandeo. Para ello, se tie la preparacin con diversos reactivos, dando lugar a distintos tipos de bandeado cromosmico (bandeo G, Q, R, T, C ...)
Actualmente, se parte ya no slo de cultivos de leucocitos, con la desventaja de su vida corta, de 3 a 4 das, sino de cultivos a largo plazo de clulas de diversos tipos de tejidos (fibroblastos, mdula sea, lquido amnitico, biopsas, etc.). Las ms usadas son las de mayor potencial de divisin o mayor facilidad de cultivo. Asimismo, existe una variedad de tratamientos de desnaturalizacin y/o degradacin enzmtica de la cromatina, y de tinciones con colorantes especficos para el DNA. Por ltimo, se han desarrollado sistemas de cariotipificacin que pueden ser informatizados de forma que seleccionen automticamente las clulas a analizar, el tipo de tincin y el anlisis de los cromosomas.
8.2.1.3
Bandeado
Aplicando distintas tcnicas de tincin, utilizadas de forma rutinaria en laboratorios de citogentica, se puede observar en los cromosomas bandas plidas y oscuras alternativamente, que definen grandes regiones cromosmicas llamadas socoros. Este bandeo o bandeado de cromosomas no es consecuencia de agrupamientos fortuitos, sino que est relacionado con la organizacin estructural del genoma, reflejando variaciones tales como la composicin de bases, grado de condensacin cromosmica, conformacin de la cromatina, secuencias repetitivas y no transcritas, etc. Los patrones de bandas de cada cromosoma son prcticamente idnticos en clulas diferentes, y en casi todos los tejidos, pero pueden diferir entre individuos; por ejemplo, al menos 1 2 cromosomas muestran variaciones en la longitud de ciertos segmentos en distintas personas. Se pueden llegar a apreciar hasta 500 bandas en un cromosoma; en funcin de la resolucin microscpica alcanzada, las bandas principales se subdivden sucesivamente en subbandas y subsubbandas. A todas ellas se les asigna un nombre, que incluye el cromosoma, el brazo y un nmero correlativo desde el centrmero hacia los extremos.
ESTUDIO DEL CROMOSOMA METAFSICO
91
cada cromtida: dos brazos varias bandas (grandes zonas)
cromosoma (con 2 RESOLUCIN CRECIENTE cariograma cromtidas)
sub-bandas
sub-sub-bandas 7q21. 1 7q21. 2 7q21. 3 7q22
Los cromosomas se reconocen por su tamao y la posicin del centrmero. Si se ha realizado una tincin (generalmente G o R) se aprecian adems las bandas.
Brazo pequeo P brazo grande 4
A la menor resolucin ya se pueden distinguir zonas claras y oscuras, en posiciones constantes y caractersticas para cada cromosoma. Esas bandas se numeran partiendo del centrmero para ambos brazos.
Empleando tcnicas con mayor resolucin (preparacin de los cromosomas, tincin y microscopa) se pueden observar zonas claras y oscuras dentro de cada banda principal y de cada sub-banda.
Para el bandeado de cromosomas se emplean diversos mtodos de tincin del DNA con colorantes especficos:
a) Bandeo G
Es la tcnica ms utilizada. Se basa en una desnaturalizacin controlada de las protenas cromosmicas (generalmente por digestin con tripsina), seguida de tincin con Giemsa (de donde viene el nombre de bandeo G) y observacin al microscopio (el reactivo de Giemsa es una mezcla compleja de colorantes). Cada par de cromosomas muestra as patrones caractersticos de tincin, con bandas oscuras (G-positivas o bandas G) y bandas claras (G-negativas).
b) Bandeo Q
Los cromosomas se tien con un compuesto fluorescente, como mostaza de guinacrina (hidrocloruro de quinacrina), 4,6 diamidino-2-fenil-indol (DAPI) o Hoechst 33258, que se intercalan en el DNA doble. Se requiere, por tanto, un examen mediante microscopa de fluorescencia. Aparece un patrn especfico de bandas brillantes (bandas Q o Q-positivas), que se corresponden casi exactamente con las bandas G (G-positivas, G-oscuras). Las bandas G y Q contienen DNA que, en general, es algo ms rico en pares AT (55-60%), pues la quinacrina se Inserta preferentemente entre estos pares. Corresponden a cromatina altamente condensada, con DNA de replicacin tarda dentro de la fase S del ciclo celular, relativamente inactivo transcripcionalmente.
c) Bandeo R
Se basa en un tratamiento de los cromosomas con calor (para desnaturalizar el DNA rico en AT), antes de la tincin con Giemsa. Resultan as bandas oscuras (bandas R) que coinciden con las bandas G o Q claras (el nombre deriva de patrn reverso). Tambin se consigue el mismo patrn de bandas empleando olivomicina, un colorante con afinidad por los pares GC. Las bandas R contienen DNA rico en GC (50-60%), de baja condensacin cromatnica, que se replica en etapas tempranas de la fase S y es relativamente activo transcripcionalmente.
d) Bandeo T
Identifica un subconjunto de bandas R especialmente concentradas en los telmeros, las de tincin ms intensa, y se visualizan empleando un tratamiento trmico particularmente severo antes de teir los cromosomas con Giemsa o una combinacin de tinciones y fluorocromos.
ej Mtodos especiales
Otros mtodos de cultivo cromosmico y de tincin se utilizan para situaciones particulares: bandeo C, para regiones heterocromticas; tincin OR, para la regin organizadora del nuclolo, que contiene los genes de rRNA 18S y 28S; bandeo de profase y prometafase, o de alta resolucin, sobre cromosomas detenidos en una etapa temprana de la mitosis, con un estado relativamente descondensado (su mayor longitud permite apreciar ms detalles, llegndose a observar hasta 850 bandas en un solo cromosoma), etc. Finalmente, la citogentica molecular emplea sondas de DNA clonado (preparadas por tcnicas de DNA recombinante, pg. 176) para examinar cromosomas, de forma similar a los ensayos de hibridacin molecular pero sobre preparaciones de cromosomas completos. sta es la tcnica denominada hibridacin in situ con fluorescencia (FISH, fluorescence in situ hybridization, pg. 172). Se dispone de sondas especficas para cromosomas individuales y para reglones cromosmicas, que permiten, por ejemplo, identificar reordenamientos cromosmicos particulares u obtener un diagnstico rpido de la existencia de un nmero anormal de cromosomas.
92
8.2.2
Regiones con significado funcional
Los cromosomas eucariticos muestran tres elementos esenciales para una funcin correcta del ciclo celular y la divisin, imprescindibles para la expresin, duplicacin, y segregacin de los cromosomas: el centrmero (lugar de unin del cromosoma a las fibras del huso acromtico), los telmeros (regiones situadas en los extremos de los cromosomas) y los orgenes de replicacin (puntos numerosos en cada cromosoma donde se inicia la copia de las dos hebras de DNA). Se tratan a continuacin los aspectos morfolgicos relacionados con los dos primeros; el anlisis de los orgenes de replicacin se pospone hasta que se estudie el proceso de replicacin (pg. 150).
8.2.2.1
Centrmero
Se puede considerar el centro cintico del cromosoma, pues sobre l se sitan las estructuras llamadas cinetocoros, a las cuales se unen las fibras que constituyen el huso acromtico o huso mittico. Estas fibras, filamentos contrctiles o microtbulos, de naturaleza proteica, ejercen la traccin necesaria para separar las dos cromtidas durante la divisin celular. De esta forma se produce la segregacin ordenada de los cromosomas y cada clula hija recibe una cromtida de cada cromosoma, es decir, idntica dotacin gentica. La ausencia de centrmero (cromosoma acntrico) impide que el cromosoma se una al huso mittico y, por tanto, que se incluya en el ncleo de las clulas hijas. Las secuencias esenciales para la funcin de los centrmeros son muy ricas en pares AT, tienen unos 170 pb en humanos y se repiten entre 2.000 y 30.000 veces en cada centrmero. Forman, pues, parte del llamado DNA repetitivo (pg'. 113) y adems suponen una parte importante de la fraccin de heterocromatina constitutiva, aqulla que slo llega a descondensarse un tiempo mnimo en el ciclo celular, el preciso para su replicacin.
8.2.2.2
Telmeros
Telmero es una palabra de etimologa griega: telos, extremo, y meros, parte o regin, que hace referencia a regiones situadas en los extremos de los cromosomas eucariticos, constituidas por secuencias especializadas de DNA asociado a protenas y con caractersticas estructurales y funcionales propias que las diferencian de otras regiones cromosmicas. Los telmeros de la mayora de eucariotas estn formados por dos tipos de secuencias de DNA. Una de ellas, denominada secuencia telomrica, repeticin telomrica o repeticin terminal, constituye el extremo de la cadena de DNA del cromosoma, mediante la repeticin en tndem de un oligonucletido corto (variable segn especies; en humanos es TTAGGG). Generalmente esta secuencia telomrica es ms rica en G en una de las hebras, la que forma el extremo 3, que sobresale unos 12 -16 nucletidos sobre la hebra que aporta el extremo 5. Ese extremo saliente es reconocido por protenas ligantes del telmero (TBP, telomere binding proteins), que actan a modo de caperuza protectora de dicho DNA terminal. Existen tambin unas secuencias ms complejas adyacentes a las anteriores (es decir, ms internas en el cromosoma), que se denominan asociadas a telmeros o secuencias subtelomricas. cromosoma (las secuencias y cifras corresponden a humanos) telmero telmero secuencias telomricas |Jj ----------------------------- CX) secuencias telomricas (1 -12 kb en total) C __________ ____________ - p - ( 1 - 1 2 kb en total) secuencias subtelomricas (2-4 kb en total) (5) CCCTAACCCTAAs** TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG (3) (3) GGGATTGGGATTGGGATTGGGATT-^^ / -AATCCCAATCCC (5) _ o ______ ii ______ ii ______ i repeticiones (150-2.000) _ __ saliente 3 (12-16 nt) Se han asociado a los telmeros distintas funciones: Participar en la estabilizacin y mantenimiento de la integridad estructural del cromosoma: en ausencia de telmeros, el extremo del cromosoma tiende a unirse a otros y aumentan las posibilidades de que sufra recombinacin y degradacin. Por otra parte, los telmeros permiten a las enzimas encargadas de la reparacin del DNA diferenciar entre el extremo natural del cromosoma y uno que resulte de la fragmentacin accidental de la cadena de DNA; en este ltimo caso se detiene el ciclo celular, evitando la replicacin hasta que se haya reparado la lesin. La funcin ms importante consiste en asegurar la replicacin completa de los extremos del cromosoma. Este aspecto se estudiar una vez considerado con detalle el proceso de la replicacin del DNA (pg. 157). Se especula tambin con la implicacin del telmero en la arquitectura tridimensional del ncleo y/o del apareamiento cromosmico.
hebra rica en G
DOTACIN GENTICA EN EUCARIOTAS
93
8.3
Es conveniente completar el conocimiento de la organizacin del material gentico considerando el contenido total de este material presente en las clulas eucariticas y su relacin con el tipo de clula y el estadio en el que se encuentra. Para ello, es preciso describir el significado de algunos trminos y conceptos genticos bsicos, necesarios tambin para la comprensin del ciclo celular y de los dos tipos de divisin, mitosis y meiosis (tema 9).
8.3.1
Nmero de cromosomas (n): carcter haploide y diploide
El nmero de cromosomas nucleares es caracterstico de cada especie, y vara mucho de unas a otras. Se habla de clulas haploides (y de organismos haploides, s estn formados slo por ellas) cuando cada cromosoma se presenta en forma individual, de modo que cada clula contiene un juego de cromosomas, todos distintos entre s. El nmero de cromosomas se identifica con el nmero n.
Clula haploide humana:

espermatozoide u vulo (clulas sexuales o gametos). Tiene 23 cromosomas (=23); cada uno de ellos est formado por una molcula lineal de DNA de doble hebra.
Q 2 uno de estos dos en cada clula haploide:
S l i l i c B S l b i S I S G S i E
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
22 autosomas (en todas las clulas e individuos)
* cr^^j)ma
Por el contrario, se denomina clulas diploides (y organismos diploides) a aqullas en las que se observan parejas o pares de cromosomas morfolgicamente iguales entre s; los dos miembros de la pareja se denominan cromosomas homlogos. Por tanto, cada clula diploide tiene dos juegos de cromosomas, y este carcter diploide se Identifica con el nmero 2n (n parejas de cromosomas). En cada par, un cromosoma se ha heredado del padre y otro de la madre.
Clula diploide humana:

clulas somticas (hepatocito, neurona...), clulas germinales precursoras y cigoto. Tiene 46 cromosomas (2n): 46 molculas lineales de DNA de doble hebra. Forman 2 conjuntos de 23 cromosomas distintos, o 23 pares de cromosomas (a veces denominados 23 cromosomas diploides). De ellos, 22 pares, que son homlogos y adems similares en ambos sexos, se llaman autosomas; los 2 cromosomas restantes difieren dependiendo del sexo y slo son homlogos en la mujer.
^procedente del espermatozoide (haploide: 22 + X o 22 + Y) |
diploidcr 44 + X procedente del vulo (haploide: 22 + X) J
+X
o
XY
44 +
+Y
si es mujer, "ffffyy XXI
si es varn,
II iiiljnrniffmm
0 0
sSggig||giilelllIIgg| 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
Par cromosomas 22 pares de autosomas (en todas las clulas e individuos) homlogos
S!
XX XY
un par de cromosomas sexuales
94
cromosomas sexuales
Homologa:
mujer:
j XX,
varn:
jjj X Y, muy distintos
homlogos
El par n2 23 est formado por dos cromosomas homlogos, igual que los autosmicos (pares n25 1 a 22) p
5
1
El par na 23 est formado por 1; cromosomas no homlogos
dos
Slo una pequea regin del Y y el X son homologas
(regin pseudoa u toso mica)

Gametos producidos: Procedencia de sus cromosomas: Se dice que la mujer es homogamtica: todos sus vulos llevan un mismo tipo de cromosoma, X un X de la madre, el otro X del padre Se dice que el varn es hetcrogamtico: la mitad de sus espermatozoides son portadores de X, la otra mitad de Y el X siempre de la madre, el Y siempre del padre
Transmisin de los cromosoma X a las hijas y a los hijos, indistintamente el X slo a las hijas, el Y slo a los hijos (al fertilizar (por fertilizacin con un espermatozoide X o Y, cualquier vulo, que siempre ser X) cromosomas: respectivamente) En algunas especies, a diferencia de los humanos, no existe cromosoma Y, sino que los machos tienen un solo cromosoma sexual X, sin pareja, mientras las hembras tienen dos cromosomas X homlogos.
En el caso de clulas (u organismos) con ms de 2 / 7 cromosomas (4n, 8n, etc.) se habla de carcter poliploide. Hay clulas que son poliploides de forma natural, porque han formado copias adicionales de su juego de cromosomas inicial mediante una replicacin sin divisin celular (endomitosis). Por ejemplo, las clulas del hgado en regeneracin son tetraploides (4n), y los megacariocitos gigantes de mdula sea contienen usualmente 8 n, 16n o 32/7. Hay tambin situaciones patolgicas caracterizadas por polploida: las ms frecuentes son la triploida (3n) y la tetraploida (4 /7 ). Estas anomalas cromosmcas se estudian en el tema 29.
8.3.2
Contenido de DNA: valor C
Durante el ciclo celular, la formacin de gametos y la fertilizacin tienen lugar variaciones en el nmero de cromosomas de la clula, indicadas medante los mltiplos de n. En humanos y animales, estas variaciones transcurren entre n (haploide) y 2 / 7 (diplode). No debe confundirse esa variacin con la del contenido en DNA de cada clula, aunque ste tambin vara durante los procesos citados. Para indicar este contenido se emplea una notacin basada en denominar C a la cantidad de DNA (de doble hebra) correspondiente a un juego haploide de cromosomas (es decir, n) antes de su replicacin. Se pueden encontrar clulas, tanto haploides como diploides, cuyo contenido C es diferente: Clula haploide n,C n,2C Clula diplode 2n,2C 2n,4C gameto maduro (vulo y espermatozoide) gametocito secundario (precursor de los gametos maduros) clula somtica cuando no est en divisin, antes de sufrir la replicacin de su DNA clula somtica tras sufrir la replicacin, a punto de dividirse por mitosis gametocito primario, antes de dividirse por meiosis dando 2 gametocitos secundarios
8.3.3
Locus y alelo
locus (A): posicin definida, ocupada por un gen (o una secuencia de DNA) en ambos cromosomas homlogos
7T nmdiferentes
alelo Ai otro locus (B) otro locus(C)
alelo Aj
alelo B
TT
iguales
~~C
P alelo
EZ
^ alelo C alelo: secuencia de DNA situada en un locus
B|
loci: varias posiciones para -genes diferentes en un mismo par de cromosomas
alelo C iguales
\J
cada par de alelos ocupa el mismo locus (un alelo heredado del padre y el otro de la madre)
95
En cualquier clula de una misma especie, un gen ocupa siempre el mismo lugar en un cromosoma determinado, y la posicin equivalente en su homlogo. (Por ahora, basta con que se entienda por gen una secuencia de DNA que codifica un producto funcional, bien protena o bien RNA.) Para referirse de forma genrica a esa posicin se utiliza el trmino locus. Por tanto, genes distintos ocuparn diferentes loci (plural de locus), en el mismo par de cromosomas o en otro. Estos trminos tambin se utilizan para la posicin de regiones de DNA que no sean genes. A cada secuencia concreta de DNA (gnica o no) situada en un locus se la llama alelo. Puesto que cada cromosoma se presenta como un par, en cada individuo hay dos alelos en el mismo locus, que pueden ser idnticos o diferentes. En general, los dos alelos que presenta un individuo en un locus determinado son diferentes de los de otro individuo de la misma especie (diversidad gentica o polimorfismo, pg. 365). Como consecuencia, en el conjunto de la poblacin existen ms de dos alelos diferentes para un locus. El estudio de trastornos clncos ha permitido identificar numerosos alelos, aqullos menos frecuentes en la poblacin, que sirven hoy como marcadores para identificar dichas patologas.
8.3.4
Genotipo, fenotipo y dominancia

Estudio restringido a un solo locus, en cuatro individuos de la misma especie. Alelos posibles en la poblacin: A1? A2 y A3 (presentes en proporciones diferentes)
individuo 1 individuo 2 I
----------------1
individuo 3 individuo 4
n
V J
Si ambos alelos del par son iguales, el individuo es homocigtico
Se define genotipo como la constitucin gentica de un organismo (es dccir, de un individuo de una especie dada). El trmino puede ser considerado en sentido general, como el conjunto de los alelos presentes en todos los loci de todos los cromosomas del individuo. Sin embargo, a efectos prcticos se suele considerar el genotipo para un locus particular, con lo que el genotipo de un individuo viene definido por los dos alelos presentes en ese locus en ambos cromosomas homlogos, de entre los mltiples alelos posibles para el locus en la poblacin de esa especie. Genotipo: Genotipo: Genotipo: Genotipo:
IAÎ
Si ambos alelos del par son diferentes, el individuo es hctcrocigtico
A2 A2
A2 j^.| (= AJA2)
A | A 3; (= A3A.)
Se define fenotipo como manifestacin externa del genotipo, es decir, el conjunto de rasgos o caracteres observables (morfolgicos, bioqumicos o moleculares), resultantes de la expresin del genotipo; esto incluye la interaccin entre los dos alelos y el efecto del medio ambiente. Al igual que el genotipo, el trmino se refiere tanto a un individuo concreto como a un carcter o grupo de Fenotipo: dominancia dos modelos de interaccin entre alelos: el alelo A| es dominante frente a los alelos A2 y A3, que son por tanto recesivos codominancia los alelos At, A2 y A3 son codominantes
wmm t
1 WM M . 1 i
Fenotipo: Fenotipo: caracteres de dicho individuo.
96
Fenotipo:
El fenotipo coincide con el genotipo slo en los individuos homocigticos Para un mismo genotipo, el fenotipo se ve afectado por el tipo de interaccin entre alelos
97
Relacin entre el nmero de alelos existentes en la poblacin para un solo locus y los genotipos diferentes a los que pueden dar lugar
Probabilidad de los genotipos en la poblacin (asumiendo que todos los alelos son igualmente frecuentes) de a Frecuencia de heterocigosis
5 situaciones posibles en
la poblacin: Na de alelos existentes
Nfi de genotipos homocigticos
Nfi de genotipos heterocigticos
N2 de genotipos Relacin posibles en total homocigticos heterocigticos
1: A, 2: AA2 3: A,, A2, A3 4: A|, A2, A3, A4

5: A], A2, A3, A4, A5
1: A,A, 2! A. | A |, A2 A2 3: A|A[, A2 A2, A3 A3 4: AjAj, A2 A2, A3 A3 , A4 A4

5: AtAb A2A2, A3 A3 , A4A4, A5A5
X
0 1: A,A2
3: A | A2, A1 A3 , A2A3
1
3 6
1 :0 2 :2
(;);)
0% 50% 66%
75% 80%
3 : 6 <*>
6 : A|A2, A1 A3 , A|A4 ^2 ^3 A2 A4, A3 A4

10: A|A2, A[A3, A|A4, AJAJ, A2A3, A2A4, A2A5, A3A4, A3 A5 , a4a5
10
15
4 : 12 (*>
5 : 20 (*>
x(x-iy2
x(x+l)/2
x: x(x-l)
(x-l)/xl00%
*** Un mismo genotipo heterocigtico es el resultado de dos combinaciones de cada dos alelos (por ejemplo, A,A2 =A2Al5 en la columna 3). Como consecuencia (columna 5), la probabilidad de existencia de cada uno de los genotipos heterocigticos en la poblacin es doble que la de cada genotipo homoeigtico. En las situaciones en las que existen dos o ms alelos en la poblacin se dice que hay polimorfismo, obviamente referido al locus considerado. Los polimorfismos del genoma humano son objeto de atencin especial en el tema 26.

Temas Acidos Nucleicos

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Tema 4

Estructura primaria de cidos nucleicos

Localizacin Eucariotas DNA Procariotas Virus

ESTRUCTURA PRIMARIA DE CIDOS NUCLEICOS

4.2 ESTRUCTURA PRIMARIA

4.3 FORMAS DE REPRESENTACIN LINEAL

DOS TIPOS DE CIDOS NUCLEICOS SEGN SU COMPOSICIN

DOS TIPOS DE CIDOS NUCLEICOS SEGN SU COMPOSICIN

cido ribonucleico (RNA) Ribonucletidos

cido desoxirribonucleico (DNA) Desoxirribonuclctidos

Fosfato Azcar Purinas

enlazando los monmer os (enlace fosfodister)

o " O O Pirimidinas G O C/J Cu Q O O

ESTRUCTURA PRIMARIA DE CIDOS NUCLEICOS

Segn la notacin de frmula completa, la representacin de ambos cidos nucleicos es la siguiente:

PROPIEDADES FISICOQUMICAS DE LOS CIDOS NUCLEICOS

PROPIEDADES FISICOQUMICAS DE LOS CIDOS NUCLEICOS

Hidrlisis qumica de cidos nucleicos Hidrlisis cida

Enlaces fosfodister (entre nuclesidos) s no

Enlaces fosfodister (entre nuclesidos) s no

Enlaces N-glicosdicos (en cada nuclesido) s s (todos o purinas)

Medio cido fuerte (p.ej., HCI 1M) Medio cido dbil

-P-dRib-P-dRib-P-dRib-P-dRib-P-dRib-P-dRib-P-dRibcido nucleico normal 3 0p.' 3 Ph 3 P- -.

...-P-dRib-P-dRib-P-dRib-P-dRib-P-dRib-P-dRib-P-dRibcido nucleico apirimidinico

ESTRUCTURA PRIMARIA DE CIDOS NUCLEICOS

HOH baSe HOH

Estructura secundara del B-DNA

ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL B-DNA

PROPORCIN DE BASES NITROGENADAS: REGLAS DE CHARGAFF

0,94 \ 1,50 2,73 0,73 0,35 1,34 1,18

Algunas relaciones entre bases son iguales en todas las especies

En prcticamente todas las especies, el contenido de A se aproxima al de T, y el contenido de G al de C:

Relacin entre purinas y pirimidinas

A+G 8 a T+C purinas pirimidinas 5.1.1.3

w 50% -> 50% ->

Razn (A+G) / (T+C) a 1 Razn purinas / pirimidinas 1

Relacin entre aminobases y oxobases

MODELO DE WATSON Y CRICK: FORMA B DEL DNA

Otras relaciones son diferentes segn la especie

, . . _ A + T %(A+T) 100 - %(G+C) razn de as.metna =

Plantas s|periores y Animales

MODELO DE WATSON Y CRICK: FORMA B DEL DNA

Complementariedad de las bases nitrogenadas

ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL B-DNA

Frmulas de partida (las usadas anteriormente):

Frmulas giradas 180 sobre s mismas:

Donador de SI Aceptor de H (Aceptor de H)

H- .11 N I-L H N Doiiador de H

Sigue siendo conformacin anti

MODELO DE WATSON Y CRICK: FORMA B DEL DNA

frmula segn criterio (2)

frmula segn criterio (3)

frmula segn criterio (2)

ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL B-DNA

Relacin entre bases individuales: A=T, C=G

Efecto del pH sobre el apareamiento de bases

W ............ V Q-H .............. /lN

(HjC) /" N N V-V5 ...... " t^\ ,/ N 'N

pH3 C-G H /N~h ..... C) N.

pH7 H /N~H ---- O N. <3............ -/~p n ............ _,K \ H H

pH12 yN~H ... -o N

MODELO DE WATSON Y CRICK: FORMA B DEL DNA

Geometra de los pares de bases