EVALUACIN RPIDA DE LA VIABILIDAD DE LOS HUEVOS DE HELMINTOS CON COLORANTES BIOLGICOS Ma.

Neftal Rojas, Matilde Galvn y Jorge de Victorica Instituto de Ingeniera, UNAM, Apdo. Postal 70-472, Mxico, D.F., 04510 Tel: (52)(5)622-3323; FAX: (52)(5)616-2164; EMail: jva@pumas.iingen.unam.mx

RESUMEN

En este trabajo se presenta un mtodo rpido para evaluar la viabilidad de los huevos de helmintos (su capacidad de desarrollarse hasta la etapa infectante); en el se utilizan los colorantes biolgicos azul tripn, rojo congo, eosina "Y", solucin lugol, hematoxilina, safranina, verde de metilo y azul de metileno en combinacin con el mtodo de concentracin de membrana. Los resultados de su aplicacin en el laboratorio, mostraron que los huevos potencialmente viables son impermeables a cualquiera de los colorantes empleados en este estudio y por lo tanto no se tien, mientras que los huevos no viables fijaron el colorante. Este mtodo se contrast siempre con una muestra de huevos sin adicin de colorante, de los que al final del tiempo de incubacin se consideraron viables los que se desarrollaron hasta la etapa de larva mvil. Los resultados fueron validados estadsticamente con anlisis de ANOVA doble y simple, t de Student, prueba de Tukey y Dunnett, con lo que se demostr que los colorantes son tan confiables como el mtodo de incubacin in vitro para determinar la viabilidad de los huevos de Ascaris suum. Tambin se evaluaron muestras de aguas residuales domsticas crudas y de sus efluentes tratados por lodos activados, biodisco y filtro rociador de la Planta de Tratamientos de la Universidad Nacional Autonoma de Mxico, aplicando el mtodo Norma y el de filtracin/transparentacin de la membrana, conjuntamente con el de tincin al final. La concentracin de huevos detectada fue de 9 a 17/l de agua cruda y de 0 a 11/l en el agua tratada. El nmero de huevos no teidos (potencialmente viables) evaluados en el agua cruda fue de 0 a 7/l, mientras que en los efluentes slo se observaron huevos teidos.

INTRODUCCIN Los estudios epidemiolgicos asociados al uso de las aguas residuales en la agricultura, en algunas regiones del mundo y en particular los de Mxico, han evidenciado que existen riesgos de adquirir enfermedades diarreicas e infecciones intestinales ocasionadas por virus, bacterias, protozoarios y helmintos. El trmino "helminto" ha sido asignado a un amplio grupo de organismos que incluye a todos los gusanos parsitos de humanos, animales y vegetales. Una de las formas de diseminacin de estos organismos en el medio ambiente, es en su estadio de huevo. En esta forma, se han encontrado en grandes cantidades en las aguas residuales, provenientes de las excretas de individuos enfermos o portadores. En Mxico, las helmintiasis ms frecuentes son las ascariasis (30 %), tricuriasis (21 %), enterobiasis (19 %) y uncinariasis (17 %). En comunidades rurales y zonas tropicales se ha encontrado ms del 90 % de la poblacin infectada entre enfermos y portadores; se estima que una tercera parte de la poblacin mundial est afectada por ascariasis producida por el nemtodo Ascaris lumbricoides (Tay, 1995). La presencia de las formas

infectivas (huevos) de estos organismos en el ambiente, especialmente en las aguas para riego, en suelos y cultivos, es uno de los principales indicadores de contaminacin fecal. Se reconocen principalmente dos tipos de huevos de helmintos, los infrtiles o no fecundados y los frtiles o fecundados (Schmidt y Roberts, 1984). Un huevo frtil es considerado tambin un huevo potencialmente viable, es decir, que tiene la capacidad para desarrollarse hasta la etapa infecciosa. Se considera viabilidad potencial, porque el desarrollo puede verse interrumpido por diferentes causas y no llegar a la etapa infecciosa (Rojas, 1998 y Rojas et al., 1998). En la prctica actual, para determinar si un huevo es verdaderamente viable, es necesario observar su desarrollo embrionario en condiciones naturales, por medio de tcnicas tradicionales de incubacin, que son de dos tipos: a) la incubacin in vivo, que consiste en inocular animales de experimentacin, como conejos, cerdos etc. con los huevos de helmintos, esperar el tiempo requerido para el desarrollo de los embriones y despus sacrificar a los animales al trmino del ciclo biolgico del parsito, para examinar los rganos afectados por la presencia de larvas y b) la incubacin in vitro, para la cual los huevos se colocan en un soporte slido o lquido y se incuban bajo condiciones favorables para que los embriones se desarrollen hasta la etapa infectante. En ambas tcnicas, el tiempo de respuesta toma mnimo 21 das (dependiendo del ciclo vital de los distintas especies de helmintos), lo que significa que no son anlisis prcticos para la determinacin del riesgo a la salud de aguas residuales tratadas aplicadas al riego. Dado que estos mtodos son complicados y toman demasiado tiempo para su anlisis, se ha tratado de determinar si un huevo es potencialmente viable, mediante el empleo de algunos procedimientos no convencionales, por ejemplo, la observacin de la presencia o ausencia de la corteza externa y la movilidad de los embriones estimulados con enzimas (Lambert, 1975 y Schmidt y Roberts, 1984). Sin embargo, estos mtodos no han sido validados. Por otra parte, un procedimiento no convencional que ha dado buenos resultados, es por tincin vital desarrollado por primera vez por Zhou et al. (1985), en el cual se emple nicamente el colorante Metileno Azul-Eosina-Borax. Con esta idea fue que se desarroll el mtodo de tincin que se presenta en este trabajo. Este mtodo se basa en los cambios de permeabilidad de la cubierta externa de los huevos, provocados a su vez por la modificacin de las estructuras qumicas de los componentes de sus envolturas, una vez que se ha perdido la viabilidad.

METODOLOGA El trabajo de investigacin se inici con la recoleccin de hembras grvidas de helmintos con la finalidad de obtener una suspensin de huevos frescos para la experimentacin. Se seleccion al gnero Ascaris, por ser el de mayor distribuicin en nuestro pas y cuyas formas infectivas son sumamente resistentes a las condiciones ambientales adversas, lo que da como resultado que su viabilidad puede persistir por aos. Para disminuir el riesgo de infeccin durante la manipulacin de los organismos en el laboratorio, se decidi utilizar la especie Ascaris suum, parsita casi exclusivamente de cerdos, pero que es morfolgicamente indistinguible de la especie que parasita al humano, Ascaris lumbricoides. Con la suspensin de huevos se efectuaron pruebas para detectar las posibles interferencias de los colorantes con los reactivos empleados en la preparacin de la suspensin de huevos de helmintos y en el procedimiento de incubacin in vitro para determinar viabilidad (ltima parte de la tcnica de la US EPA (1992), que fue propuesta en el proyecto de NOM-001-ECOL-1996 publicado el 24 de junio de 1996).

Los huevos de A. suum se obtuvieron por diseccin de teros grvidos de hembras de la especie y se conservaron en suspensin isotnica. La concentracin de los colorantes fue al 0.1% en solucin acuosa, que es la recomendada para tincin biolgica. Se prepararon unidades experimentales, de la siguiente manera: a nueve tubos de centrfuga de 1.5 ml se le aadi 0.8 ml de solucin salina isotnica (NaCl al 0.85%), 0.1 ml cido sulfrico 0.1 N (para disminuir la

posible interferencia bacteriana) y 0.1 ml de una suspensin de huevos cuya concentracin promedio fue de 500 huevos/0.1 ml. Al inicio de la incubacin, de cada unidad experimental se tomaron alcuotas de 0.1 ml y se colocaron en portaobjetos; a siete de ellos se les adicion 0.1 ml de una solucin acuosa al 0.1 % del colorante biolgico correspondiente; al octavo se le aadi la misma cantidad de lugol parasitolgico, que fungi como testigo negativo (puesto que tie indistintamente estructuras viables y no viables); al noveno no se le aadi ningn colorante, ya que se utiliz como testigo positivo (este procedimiento constituye los "tratamientos"). Enseguida se determin microscpicamente el nmero de huevos teidos y sin teir en cada preparacin. Para los testigos positivo y negativo, se tomaron en cuenta las caractersticas morfolgicas y la evolucin del desarrollo embrionario de los huevos, con el fin de hacer la comparacin entre estadio de desarrollo y penetracin del colorante (tincin).

Una vez hechas las lecturas iniciales, se descartaron las preparaciones y las unidades experimentales se sometieron a incubacin a 25 C, en oscuridad y con agitacin constante para mantener una adecuada aereacin del cultivo, para facilitar el embrionamiento. Las subsecuentes lecturas se hicieron cada ocho das, cuatro veces ms, siguiendo el mismo procedimiento y manteniendo las unidades experimentales en incubacin entre una y otra lectura. Al final de la experimentacin, se obtuvieron los datos sobre nmero de huevos teidos y no teidos de cinco observaciones para cada unidad experimental. En la tabla 1 se resumen las caractersticas bajo las cuales se realizaron los experimentos.

TABLA 1.

VARIABLES Y CONDICIONES EXPERIMENTALES SELECCIONADAS VARIABLES DE CONTROL

Tiempo total de incubacin Temperatura de incubacin Oscuridad Aireacin Concentracin de la suspensin de huevos Muestras testigo Muestras teidas

30 das 25 C Constante Constante 500 huevos en 0.1 ml (aproximadamente) Preparadas con solucin salina ms cido sulfrico 0.1 N sin teir. Igual que el testigo ms teidas con Azul Tripn, Eosina "Y", Rojo Congo, Hematoxilina, Safranina, Verde de Metilo, Azul de Metileno y Lugol (al 0.1 %). Al inicio y posteriormente cada ocho das durante un mes

Periodicidad de medicin de cada unidad experimental

VARIABLES DE RESPUESTA No. de huevos teidos No. de huevos no teidos No. de huevos viables No. de huevos no viables

Para propsitos del anlisis estdistico de los resultados, los experimentos se realizaron en orden aleatorio y sin reemplazo, considerando cinco rplicas de cada uno de los nueve tratamientos, lo que di como resultado un total de 45 muestras por ensayar. La evaluacin estadstica de los datos se realiz de dos maneras. La primera incluyendo los testigos positivos como uno de los tratamientos, para lo cual se aplic el ANOVA doble y simple, la prueba de t de

Student y la prueba de Tukey; la segunda forma fue comparando todos los tratamientos de los colorantes con las muestras sometidas al procedimiento convencional de incubacin in vitro (o sea los testigos positivos), mediante la prueba de Dunnett. Una vez demostrada la confiabilidad de la tcnica de tincin, se procedi a utilizarla en el anlisis de muestras naturales, con el fin de determinar su aplicabilidad, comportamiento y posibles interferencias con los componentes comunes de las aguas residuales y tratadas. Se usaron muestras de aguas residuales domsticas crudas y de efluentes de sedimentador secundario, lodos activados, biodisco, filtro rociador, filtros de arena y clorador de la Planta de tratamientos de la Universidad Nacional Autonoma de Mxico (PTUNAM). Se decidi trabajar con la tcnica de concentracin por filtracin y transparentacin de la membrana (F/TM) en combinacin con la tcnica de tincin para el anlisis de estas muestras.

RESULTADOS Y DISCUSIN

Los resultados mostraron cualitativamente que todos los huevos fecundados potencialmente viables no se tean con todos los colorantes empleados (con excepcin de los que se tieron con el lugol) y en un lapso de 8 a 15 das, el embrin se desarroll hasta larva activa de primer y segundo estadio antes de salir a travs de un abertura poco visible. Al salir la larva del cascarn, ste se tea inmediatamente y la larva se mantena sin teir. En el caso del Lugol las larvas se observaron bien teidas e inmviles dentro del huevo y nunca eclosionaron, debido a que este colorante es tambin fijador. Los huevos teidos con los colorantes vitales se consideraron no viables y los no teidos, viables. Estos resultados concuerdan con lo citado por Meyer (1978) y Zhou et al., (1982), que demuestran que, de acuerdo con su fisiologa y morfologa, los huevos viables conservan su impermeabilidad y, por lo tanto, no aceptan los colorantes. Con estas observaciones, se puede decir que desde el punto de vista cualitativo, todos los colorantes vitales empleados en este estudio son confiables para discriminar entre huevos viables y no viables.

Tratamiento Estadstico.

En la Tabla 2 se observan los promedios de los resultados de los experimentos de tincin realizados con muestras sintticas, as como las medidas de tendencia central y dispersin de los datos, considerando que los huevos viables son los que no se tieron y los no viables los que se tieron. Los datos son el promedio de las cinco lecturas realizadas durante el tiempo de incubacin, de las cinco rplicas de cada tratamiento. Se observa que el coeficiente de variacin para los huevos no viables (definido como la relacin entre la desviacin estndar y la media, expresada en porcentaje) es ligeramente menor (de 11.8 %), en comparacin con el coeficiente de los huevos viables (13.1 %). Estos resultados indican que la desviacin estndar (dispersin de los datos alrededor de la media) representa menos del 15 % de la variacin del total de la poblacin, por lo que las variaciones observadas en este caso no son muy significativas y por lo tanto se puede confiar en la recoleccin de los resultados individuales. No obstante, es conveniente determinar las posibles causas de las variaciones observadas, las cuales pueden deberse a mltiples, por ejemplo a las caractersticas qumicas de los colorantes, la baja fertilidad de la hembra de la que se obtuvo la suspensin, las diferencias entre la composicin bioqumica de la membrana externa de los huevos viables y no viables, o por un error aleatorio. Con el fin de establecer la significancin de tales variaciones se aplic un anlisis de varianza (ANOVA) para una clasificacin doble con un doble juego de hiptesis: a) Para determinar la variacin entre los

tratamientos, b) Para determinar la variacin del nmero de huevos viables y no viables en relacin con los colorantes. Las hiptesis planteadas para el primer caso fueron: Ho) Los diferentes colorante empleados son igual de confiables para determinar huevos viables y no viables; Ha) Los diferentes colorantes muestran variacin de resultados para determinar huevos vaibles y no viables, o al menos dos tratamientos dan resultados diferentes. Para el segundo caso: Ha) No existe diferencia significativa en cuanto a la cuantificacin y comportamiento de los huevos viables y no viables frente a los colorantes, Ho) Se presenta diferencia significativa en la cuantificacin de huevos viables y no viables). Los resultados se muestran en la tabla 3. TABLA 2. PROMEDIO DEL NMERO DE HUEVOS VIABLES Y NO VIABLES DE CADA UNO DE LOS TRATAMIENTOS TRATAMIENTOS Huevos de Ascaris suum No viables 1. Testigo 2. Azul Tripn 3. Rojo Congo 4. Lugol 5. Eosina "Y" 6. Hematoxilina 7. Verde de Metilo 8. Safranina 9. Azul de Metileno _ Xj S CV % 353 318 274 307 379 361 275 292 317 319.5 37.6 11.8 Viables 188 126 155 163 158 154 198 158 189 165.5 21.73 13.1

_ Xj = media; S = desviacin estndar; CV = coeficiente de variacin.

De la prueba de F o relacin de varianza para evaluar la variacin entre los tratamientos, se obtuvo como resultado que la F calculada (0.78) es menor que la F de tablas (F 0.05(8,8) = 3.44). Esto implica que la variacin entre los diferentes tratamientos no es significativa, por lo que se acepta la hiptesis nula con una probabilidad menor del 5 % de error de rechazar una cosa cierta. Se concluye que cualquiera de los colorantes puede utilizarse indistintamente para diferenciar los huevos viables de los no viables.

TABLA 3.

ANLISIS DE VARIANZA PARA CLASIFICACIN DOBLE Y PRUEBA DE FISHER

CAUSAS Frmula general Colorantes Huevos teidos o no teidos Error Total (an-1) (a-1) (n-1)

GL Caso particular 8 1

SC

CM

F .05

FT .01 6 11

6784.5 106722

848.06 106722

0.78 98.4

3.4 5.3

(a1)(n-1)

9 17

8673.9 122180

1084.3

a = nmero de tratamientos (9); n = caractersticas de los huevos (2: viables y no viables); an = 18; GL = Grados de libertad; SC = suma de cuadrados; CM = cuadrados medios; F = F calculada; FT = F de tablas.

Por otro lado, el valor de la F calculada (98.4) para evaluar la variacin entre huevos viables y no viables es mucho mayor que el valor de F de tablas (F0.01(1,8) =11.3), lo que significa que los colorantes discriminan entre huevos viables y no viables debido a causas no aleatorias, siendo precisamente la caracterstica de viabilidad-permeabilidad la que determinar si un huevo se tie o no, por lo tanto se acepta la hiptesis alterna. Adems de la prueba de F, se aplic la prueba de t de Student para corroborar los resultados, ya que:

t calculada = F calculada
o bien,
2 t =F

El valor de la tcalculada = 9.92; por lo tanto t = 98.45. Este valor es prcticamente igual al de la Fcalculada = 98.42. Por lo tanto se cumple la igualdad y se llega a la misma conclusin. En cuanto al manejo de los resultados de los huevos viables, se plante un anlisis de varianza para una clasificacin simple, cuyas hiptesis tambin se probaron mediante la prueba de F y fueron: Ho) Los colorantes vitales se pueden emplear para determinar la viabilidad de huevos de helmintos al igual que la tcnica de incubacin in vitro; Ha) No todos los colorantes sirven para determinar la viabilidad de los huevos de helmintos. En el tabla 4 se observa que las medidas de tendencia central y de variabilidad estn acordes con los resultados cualitativos que se observaron en el laboratorio. En el caso del Testigo y del Verde de Metilo se nota una mayor variacin en la media, desviacin estndar, varianza y coeficiente de variacin. La similitud de resultados entre ambos se debe a que este ltimo da una coloracin muy tenue, por lo tanto es difcil determinar los huevos teidos de los no teidos. La determinacin de la viabilidad en este caso, al igual que en el testigo y el lugol, se bas sobre todo en la morfologa y el desarrollo embrionario de los

huevos. En el caso del azul de metileno, posiblemente la variacin que se observ se debi a que se complic la localizacin de los huevos no teidos, porque este colorante es muy oscuro y la materia orgnica que tambin se tie encubra a los huevos no teidos.

TABLA 4. RP 1 I II III IV V Xc _ X S S
2

RESULTADOS CORRESPONDIENTES AL NMERO DE HUEVOS VIABLES T R A T A M I E N T O S (ver tabla 2) 2 128 122 118 122 140 630 126 8.6 74 6.8 3 166 144 148 152 170 780 156 11 131 7.3 4 155 148 161 151 200 815 163 21 451 13 5 160 144 155 164 167 790 158 9 81 5.7 6 147 142 158 149 174 770 154 12 158 8.1 7 185 140 188 204 223 940 188 30 948 16 8 161 145 155 155 174 790 158 10 112 6.7 9 184 158 182 191 230 945 189 26 679 13. 8 1461 1293 1456 1479 1711 T 7400 Xh

175 150 191 191 233 940 188 30 913 16

CV

RP. = Rplicas; Xh sumatoria por hileras; Xc = sumatoria por columnas; X = Media muestral; S = 2 Desviacin estndar; S = Varianza o cuadrado medio; CV = coeficiente de variacin T = suma total de resultados. Respecto de los tratamientos con eosina "Y", safranina y azul tripn se consideraron, cualitativa y cuantitativamente, los ms indicados para determinar los huevos viables y no viables, ya que adems de presentar los menores coeficientes de variacin (6.8, 5.7 y 6.7, respectivamente), diferenciaron en el laboratorio notablemente los huevos teidos de los no teidos, sin presentar interferencias con la materia suspendida o particulada en el fondo. Como ejemplo de estos resultados se muestran las fotografas 1, 2 y 3, en las que se observan claramente huevos teidos (infrtiles) y no teidos (frtiles y larvados). El soporte estadstico de lo anterior se obtuvo mediante un anlisis de varianza para una clasificacin simple, con prueba de F, y posteriormente por comparaciones mltiples mediante la prueba de Tukey. En la tabla 5 se muestran los resultados del ANOVA y de la prueba de F. El valor de la F experimental es menor que el de la F de tablas (F 0.05(8,36) =2.2), por lo que no existe diferencia significativa entre los colorantes y el mtodo de incubacin in vitro; es decir, para determinar la viabilidad de los huevos de helmintos se puede aplicar indistintamente el mtodo de incubacin in vitro o el de tincin con cualquiera de los colorantes biolgicos probados.

TABLA 5.

ANLISIS DE VARIANZA PARA UNA CLASIFICACIN SIMPLE Y PRUEBA DE FISHER (F) GL Frmula general Caso particular 8 36 44 17281 14205 31486 2160 1775 1.21 SC CM F .05 2.2 FT .01 3.1

CAUSAS

Colorantes Error Total

(a-1) a(n-1) (an-1)

a = nmero de tratamientos (9); n = nmero de rplicas para cada tratamiento (5); an = nmero total de observaciones (45); GL = Grados de libertad; SC = suma de cuadrados; CM = cuadrados medios; F = F calculada; FT = F de tablas. Adems, para comparar los tratamientos de manera individual entre s, se aplic la prueba de Tukey, para la cual se tomaron los valores promedios de los huevos viables (tabla 4) y se ordenaron por su magnitud creciente a decreciente: a) Xa =189 f) Xf =158 b) Xb =188 g) Xg =156 c) Xc =188 h) Xh =154 d) Xd =163 i) Xi =126 e) Xe =158 El nmero de comparaciones mltiples o diferencias entre los tratamientos se obtuvo mediante la frmula:

a(a - 1) 2
dando como resultado 36 comparaciones a efectuar. Se prosigui a elaborar las comparaciones o diferencias: a) Xa - Xb;... Xa - Xi; b) Xb - Xc;... Xb - Xi; c) Xc - Xd;... Xc - Xi y ....h) Xh - Xi. stas se compararon con el valor terico comn o diferencia mnima significativa mediante la aplicacin de la frmula: W = qSx, 2 2 en la que: Sx = error estndar de la media igual a la raz cuadrada de S /n; S igual a CM o varianza del error experimental (1775); n, nmero de observaciones, repeticiones o valores para calcular las medias (5) y q es el valor tabular, o valor de t modificado, dependiente del nmero de tratamientos (9) y de los GL del error (36). Al efectuar los clculos se obtuvo que: W= q0.05(9,36)Sx = 4.63 X 18.84 = 87.23 Todos los resultados de las diferencias entre medias fueron menores que el valor terico calculado, por lo tanto las diferencias son estadsticamente no significativas. Con estos ltimos anlisis estadsticos se comprueba sin lugar a dudas que el mtodo de incubacin in vitro y el mtodo de tincin son equivalentes para determinar la viabilidad de los huevos de helmintos (en particular de Ascaris suum). Los resultados de la prueba de Dunnett para comparar todos los tratamientos de los colorantes con las

muestras sometidas al procedimiento convencional de incubacin in vitro (o sea los testigos positivos), tambin mostraron que no hay diferencias significativas entre el control y los tratamientos, ya que no se obtuvo ningn valor mayor al valor calculado de 12.56. No obstante, aun cuando los resultados de los anlisis estadsticos indican que se pueden utilizar todos los colorantes probados de manera confiable, en la prctica se demuestra que su aplicacin depende de la percepcin del observador y que los ms recomendables son los tres colorantes que ya se mencionados: eosina "Y", safranina y azul tripn. Una vez demostrada la confiabilidad de la tcnica de tincin, se procedi a utilizarla en el anlisis de muestras naturales, se usaron muestras de aguas residuales domsticas crudas y de efluentes de sedimentador secundario, lodos activados, biodisco, filtro rociador, filtros de arena y clorador de la Planta de tratamientos de la Universidad Nacional Autonoma de Mxico (PTUNAM). Los resultados se muestran en la tabla 6.

TABLA 6.

NMERO PROMEDIO DE HUEVOS DE HELMINTOS VIABLES Y NO VIABLES, PRESENTES EN LAS MUESTRAS DE LA (PTUNAM). COLORANTES A TIPO DE MUESTRA DE LA PTUNAM (No. huevos/l) B 3 4 2 4 1 2 2 1 C 7 4 3 5 1 2 1 2 D 11 7 5 8 3 3 4 4 E 1 1 0 2 1 1 0 0 F 1 2 1 2 0 0 0 0 G 2 1 1 1 0 0 1 1 H 0 0 0 0 0 0 0 0 I 0 0 0 0 0 0 0 0

Azul Tripn Rojo Congo Lugol Eosina "Y" Hematoxilina Verde de Metilo Safranina Azul de Metileno

17 12 10 16 9 10 14 11

A = agua cruda; B = efl. de lodos activados; C = efl. del biodisco; D = efl. del filtro rociador; E = efl. del sedimentador secundario de lodos activados; F = efl. del sedimentador secundario del biodisco; G = efl. del sedimentador secundario del filtro rociador; H = efl. filtro de arena I = efl. agua clorada. La proporcin en promedio encontrada de huevos viables (no teidos) y no viables (teidos) en el agua cruda se observa en el tabla 7. Como se puede ver, la mayora de los colorantes aplicados diferenciaron bien los huevos teidos de los no teidos; en el caso de las muestras testigo a las cuales no se les agreg ningn tipo de colorante no se pud observar bin los huevos ya que no resaltaban y quedaban cubiertos por la materia orgnica, el Lugol se comport del mismo modo que con las muestras experimentales, ya que ti indistintamente a todos los huevos de helmintos y no se pudo diferenciar claramente un huevo viable de otro no viable. Con el verde de Metilo se presentaron interferencias con algunos componentes del agua, ya que el color no se distingua claramente. El Azul de Metileno present el inconveniente de teir fuertemente en algunos casos el fondo de la preparacin, interferiendo con las lecturas. De todos los colorantes probados, los que siempre diferenciaron claramente los huevos teidos de los no teidos, sin presentar interferencias ni problemas, fueron nuevamente el azul tripn, la safranina y la eosina "Y".

TABLA 7.

COMPORTAMIENTO DE LOS COLORANTES EN EL AGUA CRUDA CON RESPECTO A LA TINCIN DE LOS HUEVOS DE HELMINTOS DEL AGUA CRUDA PROVENIENTE DE COPILCO EL ALTO. COLORANTES AGUA CRUDA HUEVOS VIABLES (NO TEIDOS) Azul Tripn Rojo Congo Lugol Eosina "Y" Hematoxilina Verde de Metilo Safranina Azul de Metileno 7 3 0 5 1 0 5 0 10 9 10 11 8 10 9 11 HUEVOS NO VIABLES (TEIDOS)

Es importante mencionar que slo se detectaron huevos no teidos (potencialmente viables) en el agua cruda (tabla 7), esto no quiere decir que en los diferentes procesos de tratamiento no se encuentren huevos viables, si no que debido a que es menor la cantidad de huevos frtiles que se producen en comparacin de los no frtiles la mayor parte de huevos que se obtuvieron se tieron y tambin puede ser que los huevos viables se sedimentaron debido a que son ms pesados que los huevos no frtiles los cuales flotan facilmente y debido a que se tomaron muestras de los efluentes de todos los procesos de tratamiento y no de los sedimentos pudo haber perdida en las lecturas de huevos viables. No obstante bajo las condiciones de estudio de este trabajo y con los huevos que se capturaron, se observo que los huevos que no se tieron presentaron desarrollo embrionario por lo que se consideraron huevos potencialmente viables, algunos de esos huevos se muestran en las fotografas 4, 5 y 6.

Evaluar la viabilidad mediante la tcnica de incubacin in vitro fue un tanto difcil, ya que los huevos que se lograron ver en las muestras de aguas residuales (recuperados al raspar el filtro de membrana), se observaron una vez y ya no se pudieron recuperar para su posterior observacin; no obstante, se pudo tomar un par de fotografas de un huevo de Ascaris lumbricoides y otro de Trichuris trichiura (obtenidas del agua cruda fotografas 7 y 8 respectivamente) que no se tieron al aplicar Azul Tripn, por lo que se consideraron viables. Se prob nicamente un colorante porque no se encontraron muestras positivas suficientes para hacer la prueba con todos los colorantes. Las especies de helmintos encontradas en la PTUNAM fueron: Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura y ocasionalmente Enterobius vermicularis. Entre las tres especies, se presentan diferencias en la composicin de la cubierta de huevo, la cubierta de Ascaris lumbricoides es muy similar a la cubierta del huevo de Ascaris suum (especie experimental) y los resultados observados en las muestras de la PTUNAM de la tincin de los huevos no viables (teidos) y potencialmente viables (no teidos) de esta especie estan ocordes con lo observado en el laboratorio para la especie de Ascaris suum ya que se localizaron huevos que no se tieron a pesar de haber agregado colorante al medio.

Estos ltimos resultados ponen de manifiesto que aunque la experimentacin se realiz con Ascaris suum, el mtodo de tincin tambin es confiable para evaluar la viabilidad de otras especies que se encuentran ordinariamente en las aguas residuales y naturales. Las concentraciones de huevos de helmintos que se encuentran en las aguas residuales varan conforme a la zona de estudio por sus caractersticas en cuanto al aspecto climtico y sociocultural, adems de las tcnicas que se emplean para su anlisis. Para el caso de este estudio, fue conveniente trabajar con aguas residuales que tuvieran bajas concentraciones de huevos de helmintos, para distinguir de manera ms efectiva si se presentaba alguna interferencia por la materia orgnica y sustancias que pudiera tener las aguas residuales y principalmente para distinguir claramente entre un huevo viable y no viable y la especie de helminto correspondiente. Las preparaciones obtenidas por medio de la tcnica de F/TM permitieron que se pudiera observar el desarrollo embrionario de algunos huevos como los de las fotografas 4,5 y 6, ya que la glicerina que se aplica antes de la observacin final, permite mantener hidratada la membrana sin alterar las estructuras, ni obstaculizar el desarrollo embrionario del huevo, ni cambiar el tono del colorante, durante ms de dos meses. Los colorantes vitales empleados en este estudio, adems de ser muy baratos y de fcil adquisicin, son estables en solucin acuosa por largo tiempo si se mantienen en frascos color mbar. Los precios (tabla 8) en pesos mexicanos son realmente muy baratos, ya que con un gramo de cualquiera de estos colorantes se puede preparar 100 ml. los cuales pueden servir para teir aproximadamente 1000 muestras, esto depende del uso del experimentador. En el caso del colorante Verde de Metilo que es el ms caro, se puede omitir de la lista ya que da una coloracin muy tenue y por lo tanto no muy buenos resultados. Para el caso de la solucin Lugol se necesita yoduro de potasio y yodo en polvo, no obstante su costo sigue siendo muy accesible, el problema es que como ya se dijo, no sirve para diferenciar un huevo viable de otro no viable. TABLA 8. PRECIOS DE LOS COLORANTES BIOLGICOS EMPLEADOS EN ESTE ESTUDIO. COLORANTES Azul Tripn Rojo Congo Lugol Eosina "Y" Hematoxilina Verde de Metilo Safranina Azul de Metileno PESO (gr.) 25 25 25 25 25 25 25 25 PRECIO 113.00 103.00 24.5 + 275.00 370.00 1,790.00 367.50 64.00

40.75

CONCLUSIONES

Los resultados de este trabajo muestran que es factible sustituir el mtodo de incubacin in vitro por la tcnica de tincin, con lo que se reduce a unos minutos el tiempo de respuesta. Los colorantes biolgicos mencionados en este trabajo, adems de ser baratos y de fcil adquisicin, son estables en solucin acuosa por largo tiempo, lo que facilita que sean aplicados por laboratorios involucrados en la evaluacin de la calidad del agua para reuso. La tcnica de tincin se puede emplear de manera confiable para determinar la viabilidad potencial de los huevos de helmintos -en particular de Ascaris suum- al mismo tiempo que se realiza el recuento. De entre los colorantes probados la solucin de Lugol, si bien sirve para teir, no determina la viabilidad, porque tie indistintamente huevos viables y no viables. Los colorantes azul tripn, eosina "Y" y safranina, mostraron los mejores resultados cuando se aplican junto con la tcnica de filtracin, ya que diferenciaron claramente los huevos teidos de los no teidos. La tcnica de tincin en combinacin con la cuantitativa de filtracin, adems de permitir un manejo seguro de los colorantes (ya que no se presenta ninguna reaccin que pudiera alterar su tonalidad), permite la conservacin de las preparaciones por la adicin de la glicerina y el almacenamiento en oscuridad. Adems se puede emplear de manera confiable para determinar el nmero total de huevos de helmintos as como la fraccin que presenta viabilidad potencial en un slo paso.

Es factible determinar la viabilidad potencial de algunos huevos de helmintos como los huevos de Ascaris y Trichuris presentes en aguas residuales crudas y tratadas. Sin embargo, es necesario efectuar un estudio ms profundo para evaluar la eficiencia de la tincin en otras especies de helmintos.

RECOMENDACIONES

La tcnica de filtracin puede ser adoptada por la mayora de los laboratorios de las instituciones pblicas y privadas que estn involucradas en la evaluacin y control de la calidad parasitolgica del agua. Aunque los procedimientos descritos son sencillos, es recomendable que el personal que aplique estas tcnicas tenga conocimientos prcticos y experiencia en la identificacin microscpica de las estructuras parasitarias, ya que el agua puede contener materiales que un observador inexperto confundira con huevos o quistes. Dada la importancia de determinar la viabilidad de los huevos de helmintos, puesto que esta caracterstica determina la capacidad de un huevo de desarrollarse hasta la etapa infectante en la que puede causar enfermedad, los comits de normalizacin deben retomar este punto tan importante para incluirlo en la legisla cin, sobre todo porque pueden desarrollarse tcnicas ms rpidas, como la aqui presentada, la cual result adems sencilla y confiable.

REFERENCIAS Lambert, R.A. (1975) "Identificacin de helmintos". Guas de Laboratorio, Ed. El Manual Moderno, S.A- 45 pp.

Meyer, Y.B. (1978) "Recovery of Ascaris Eggs form Sludge". Journal of Parasitology. 64(2):380-383. Norma Oficial Mexicana NOM-001-ECOL-1996, que establece los lmites mximos permisibles de contaminantes en las descargas de aguas residuales en aguas y bienes nacionales. Diario Oficial (Mxico), 6 de enero de 1997. Rojas, V. N. (1998) "Evaluacin de la factibilidad de utilizar colorantes biolgicos para determinar la viabilidad de huevos de helmintos" Tesis de Maestria en Ciencias. Facultad de Ciencias, UNAM. Mxico, D.F. 78 pp. Rojas, V. N.; Galvn M. y de Victorica J. (1998) "Aplicacin de colorantes biolgicos para determinar la viabilidad de huevos de Ascaris suum (helminto)". Revista Ingeniera y Ciencias Ambientales. ao 10, nm. 35, marzo - abril. pgs. 22-27. Schmidt, G. D. y Roberts, L. S. (1984) "Fundamentos de parasitologa" Ed. Continental, S. A. de C.V, Mxico D.F. 665 pp. Tay Z. J. (1995) "Microbiologa y Parasitologa Mdicas". Mndez Editores, 1 ed., Mxico. 440 pp. U.S. Environmental Protection Agency (1992). "Environmental Regulations and Technology Control of Pathogens and Vector Attraction in Sewage Sludge" (Including domestic septage) under 40 CFR part 503". Appendix I, Analytical Method for Viable Helmith Ova. Washinton, D.C. 1540 pp. Zhou, B., F. Li y J. Liang. (1985) "The use of Methylene Blue-Eosin-Borax Stain in Determining Viability of Ascaris Ova". Journal of Parasitology and Parasitic Diseases, 3(1):48-49.
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