AISLAMIENTO Y SELECCION DE BACTERIAS CONCENTRADORAS DE FOSFATOS DE AGUA DE DESAGUE DOMESTICO DE TRUJILLO-PERU

Crdova-Espinoza, Rocio y Hel Miranda-Chvez

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
Laboratorio de Microbiologia Industrial Y Biotecnologia AV. JUAN PABLO II S/N. TRUJILLO. PERU

RESUMEN

Se ha aislado y seleccionado bacterias con capacidad de concentrar fosfatos, a partir de 54 muestras diferentes de desage domstico obtenidos de colectores finales e intermedios de la ciudad de Trujillo, Per. Tales muestras fueron filtradas y sembradas en placas de agar fosfato, las que fueron incubadas a temperatura

representativos diferenciados en base a sus caractersticas culturales y tintoreales. Cada cultivo se sembr en medio Tardieux-Roche y se incub durante 360 horas a temperatura ambiente, evalundose su produccin de biomasa y formacin de grnulos metacromticos; esta ltima por la coloracin de Epstein. Se seleccionaron los mejores cultivos; se evalu su capacidad de concentrar fosfatos en las diferentes fases de crecimiento celular, mediante el mtodo cuantitativo de Vanadiomolibdato de amonio y se eligieron, los que mostraron capacidad de concentrar fosftos hasta un 69 a 77%. Se logr demostrar que existen en desage domstico bacterias con capacidad significativa de concentrar fosfatos.

ABSTRACT

It has been selected and isolated bacteria with capacity of concentrating phosphatus, since 54 different sample of domestic wastewater, since were obtained from final and intermediate collecting of the Trujillo city. These samples were incubate to a normal temperature (21 2 oC) for 72 hours. From these remains it has been obtained representative and differentiated planting based on their cultural and colouring characteristics. Each isolated was planted in Tardieux-Roche, then it was incubated evaluating their production of biomass for 360 hours to a normal temperature, and formating of metacromatic granules

formation wich were done due to Epstein`s stain. It has been choosen the best isolated, it has been evaluated the capacity of concentring phosphatus in the different phaus of the cellular development, througe the cuantitative method of vanadiomolibdato of amonio, afterwords they were selected only the ones wichshowed capacity of 69 to 77 of concentrating phosphatus. It the end, it has been demostrated that inn wastewater, there are bacteria with a meaninful capacity of concentrating phosphatus.

INTRODUCCION

Hoy en da, la amplia aceptacin y uso que se da a los detergentes ha determinado que se reconozca a stos como la fuente principal, hasta en un 60%, de la gran cantidad de compuestos de fsforo presentes en las aguas residuales domsticas (1),(2). Estudios fsico-qumicos recientes han demostrado que los fosfatos pueden hallarse en efluentes a concentraciones que oscilan entre 2000 a 3000 mg/L. Estas concentraciones son extremadamente elevadas frente a la condicin estandar mxima sugerida de 2 mg/L. Este fenmeno aparentemente inofensivo, es motivo de honda preocupacin, ya que tanto los fosfatos como los productos de su hidrlisis ocasionan una disminucin del oxigeno y de la calidad de agua, induciendo a notorios cambios desestabilizantes de los ecosistemas marinos locales (3),(4),(5). Entre los tratamientos para disminuir la concentracin de fosfatos empleados hasta la actualidad est la precipitacin qumica con sales de aluminio y cloruro frrico; pero su uso se ha restringido a casos muy especiales debido a su elevado costo (6). Por otro lado, se ha reportado la existencia de diversos tipos de bacterias con capacidad de captar y concentrar diversas sales inorgnicas, especialmente fosfatos. El rol de estas bacterias en la reduccin de la concentracin de ciertas sustancias presentes en efluentes municipales e industriales ha sido explorado para residuos lquidos de caractersticas diferentes a los residuos que se eliminan en nuestra regin. As, por ejemplo, se ha evaluado la participacin de una serie de bacterias

tales como Escherichia coli y Acinetobacter empleando sistemas tanto aerobios con lodo activado como anaerbicos (4),(6),(7).

Se ha reportado diversos estudios sobre la eficiencia de eliminacin de materia orgnica carbonada y nitrgenada as como de algunos aspectos del mecanismo de acumulacin y consumo de estos sedimentos. As mismo se ha reportado la obtencin de cultivos de E. coli recombinantes con capacidad de sobreproducir las enzimas comprometidas en una elevada concentracin intracelular de fosfato (8),(9),(10),(11). En el Per, an no se ha instalado proceso alguno que en forma sistemtica sirva para el tratamiento de desages generados en las ciudades ni tampoco algn proceso concebido para la separacin y eliminacin de sales como los fosfatos de los detergentes; por lo que stos son evacuados directamente al mar o a los ros con el subsecuente deterioro de la biodiversidad tpica de estos ecosistemas. El problema se empeora con el crecimiento de la poblacin, el hacinamiento, las migraciones y la industrializacin. Urge pues, implementar y optimizar tecnologas limpias y eficientes para una adecuada captacin de los fosfatos eliminados como consecuencia del amplio uso de detergentes y que son acumulados en los principales ecosistemas acuticos locales. Tales tecnologas requerirn la seleccin, mejoramiento y optimizacin de cultivos microbianos con capacidad de concentrar productos metlicos txicos presentes en los diversos efluentes. La obtencin de tales cultivos se presenta como una alternativa biotecnolgica valiosa (3). Con el propsito de contribuir al conocimiento en el tratamiento de aguas de desecho domstico, se ha intentado aislar y seleccionar cultivos bacterianos nativos con capacidad de concentrar fosfatos, para luego en posteriores estudios evaluar la

potencialidad de su uso en forma progresiva a nivel de laboratorio, planta piloto y finalmente a gran escala para la reduccin o eliminacin de fosfatos de los desages y efluentes de origen municipal e industrial.

MATERIAL Y METODO

1.0. MATERIAL Y METODO 1.1.Procedimiento: Se obtuvieron 54 muestras de agua de desage domstico obtenidas de los colectores finales e intermedios de la zona urbana y urbano-marginal de la ciudad de Trujillo.

Las muestras fueron trasladadas al laboratorio donde fueron filtradas con papel whatman nmero 4. A 500ml. del filtrado de cada muestra, se aadi 0,05 g. de K2HPO4 y 0.05 g de KH2PO4 horas; luego se sembr por estra en placas de agar fosfato (agar agar 1,5 g.; peptona 0,5 g; NaCl 0,5 g.; extracto de carne 0,3 g.; KH 2P04 1,5 g.; K2HPO4 1,5g; agua destilada 100 ml.; pH 8.0); las placas se incubaron bajo las mismas condiciones que el filtrado. Del desarrollo obtenido se eligieron las colonias de caractersticas culturales y tintoreales distintivas y se aislaron en tubos de agar

fosfato; stos se incubaron a temperatura ambiente por 72 horas y luego se conservaron en fro (10oC) como cultivos stock.

La seleccin de cultivos con mayor capacidad acumuladora de fosfatos se realiz en forma escalonada para lo cual se procedi de la siguiente manera:

- Se prepar una suspensin bacteriana de cada cultivo de 72 horas en SSF estril hasta obtener una concentracin de 106cel. viables/ml usando el mtodo de

recuento en placa. Una alicuota de 2 ml. de la suspensin de cada cultivo bacteriano se inocul en un frasco conteniendo 200 ml. del medio TardieuxRoche. Los reactores fueron incubados por 360 horas a Temperatura ambiente

cultivos aislados primariamente. - A partir del momento de la siembra y cada 24 horas, se tom alcuotas de 3,5 ml. de cada reactor y se midi la densidad ptica en un Spectronic 20 a 540 nm. de longitud de onda. - Para la seleccin final se sembr cada cultivo en el medio Tardieux-Roche siguiendo el mismo esquema utilizado para la seleccin anterior. Concludo el C a 15 libras de presin por 15 minutos y se realiz la determinacin de fosfato residual por el mtodo colorimtrico del vanadomolibdato de amonio (14). Se seleccionaron finalmente 5 cultivos bacterianos teniendo en cuenta los siguientes aspectos: mayor produccin de biomasa, presencia de grnulos metacromticos y cantidad en ppm. de fosfato residual en muestras tomadas al inicio del crecimiento (tiempo cero), en la fase de latencia, al final de la fase logartmica y al cabo de las 360 horas de cultivo. Se evalu la capacidad concentradora (acumuladora) de fosfatos durante el conocimiento, se estim la productividad de esta capacidad a travs del ndice de Monod expresado como ppm de fosfato acumulado/ml de medio/108 clulas microbianas.

Todas las evaluaciones contaron con controles que consistieron en el medio de cultivo sin inculo bacteriano. Se hicieron tres repeticiones por cada ensayo.

- Para la identificacin de los cultivos bacterianos seleccionados se recurri al Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (15).

RESULTADOS

CRECIMIENTO. Se obtuvo la curva de crecimiento que describieron los cinco cultivos seleccionados; MIT-17F, MIT-25F, MIT-34F, MIT-59F y MIT-85F en el medio TardieuxRoche luego de 360 horas de incubacin a temperatura ambiente. Los cultivos MIT25F y MIT-34F presentaron diferencia no significativa con relacin al curso de su curva de crecimiento (p<0.05) y culminaron su fase logartmica aproximadamente a las 192 horas; en cambio los cultivos MIT-17F; MIT-59F y MIT-85F si difirieron significativamente en relacin a su crecimiento y culminaron su fase logartmica aproximadamente a las 168 y 216 horas respectivamente.La fase de latencia dur aproximadamente 92 horas para los cultivos MIT-25F y MIT-59F y 120 horas en los cultivos MIT-17F, MIT-59F y MIT-85F.

CAPACIDAD CONCENTRADORA DE FOSFATO.

Se observ que los cinco cultivos selecionados concentraron mayor cantidad de fosfato en la fase logartmica, siendo el cultivo MIT-17F el que en menor tiempo (168 horas) redujo la cantidad de fosfatos hasta 26 ppm, seguido por los cultivos MIT-25F y MIT-34F que en 192 horas la llevaron a 30 ppm; finalmente, los cultivos MIT-59F y MIT-85 en 216 horas la disminuyeron a 35 ppm y 26 ppm respectivamente. En la fase de latencia, los cinco cultivos slo disminuyeron muy ligeramente la cantidad de fosfato presente en el medio (Fig. 2).

CRECIMIENTO Vs. CAPACIDAD CONCENTRADORA DE FOSFATO. La fig. 1 representan el porcentaje de fosfato concentrado en cada fase de crecimiento. Con respecto a la fase de latencia el cultivo MIT-17F present el mayor porcentaje (17,39%), en tanto que el cultivo MIT-59F acumul tan slo 1,3%. En lo referente a la fase logartmica, fueron los cultivos MIT-17F y MIT-85F los que presentaron el porcentaje ms alto de acumulacin de fosfato (77,39 y 77,40% respectivamente). El valor ms bajo para esta fase correspondi al cultivo MIT-59F con 69,57%. En la fase estacionaria, el comportamiento de los cinco cultivos fue semejante aprecindose un ligero decremento en la cantidad de fosfato, descendiendo en los cultivos MIT-17F y MIT-85F hasta 77,01% en MIT-59F hasta 66,43% y para los cultivos MIT-25F y MIT-34F hasta 63,48%. El ndice de Monod estimado en la fase logartmica de los cultivos permiti observar que el cultivo MIT-17F present mayor capacidad con un valor de 4.76 ppm de fosfato acumulado x ml./108 cel. y la menor capacidad correspondi al cultivo MIT85F con 1.02 ppm de fosfato acumulado x ml./108 cel.

IDENTIFICACION DE LOS CULTIVOS.

De acuerdo a las caractersticas culturales y comportamiento bioqumico, los cultivos en estudios fueron compatibles con los gneros: Gluconobacter sp., Branhamella sp., Phenylobacterium sp. y Aeromonas sp.

TABLA 1 TASA DE ACUMULACION DE FOSFATO (INDICE DE MONOD) EN LA FASE LOGARITMICA DE CINCO CULTIVOS BACTERIANOS EN EL MEDIO TARDIEUX-ROCHE.

--------------------------------------------------------------------------FOSFATO _ INDICE DE C U L T I V O CONCENTRADO Cel.x108/ml MONOD (ppm.) (ppm.ml/108cel.)

--------------------------------------------------------------------------MIT-17F 89.0 1.87 4.760 MIT-25F MIT-34F MIT-59F 85.0 85.0 80.0 7.42 7.74 2.61 1.150 1.098 3.060

MIT-85F 89.0 8.72 1.020 ---------------------------------------------------------------------------

DISCUSION
Es importante destacar que la fase de latencia de los cultivos acumuladores de fosfato aislados en este estudio, fue relativamente larga, lo que se debi

posiblemente a una disminucin de la afinidad a nivel de membrana de los transportadores de fsforo (16),(17).

Las curvas de fosfato residual correspondientes a los cinco cultivos (fig. 2) describieron una cada brusca durante la fase logartmica como consecuencia de que, en sta etapa de crecimiento, los microorganismos se limitan a asimilar el material disponible en su entorno tanto para incrementar preferentemente su masa celular como para elaborar material de reserva. Kato (6) y Lemke (18), empleando recombinantes de E. coli y Acinetobacter sp. lograron determinar que el mayor consumo de sales minerales se verifica en la fase logartmica, donde el requerimiento de nutrientes se eleva en forma constante. Por otro lado, el incremento de fosfato residual (fig. 2) en la fase estacionaria, se justific debido a que el fosfato incorporado en el interior de la clula sera liberado al medio externo, fenmeno frecuentemente observado en no pocas especies microbianas concentradoras de fosfatos cuando se hallan sometidas a fuertes presiones y condiciones de desarrollo (17),(19).Al comparar el incremento de biomasa y la concentracin de fosfato durante la fase logartmica, se observ que los fosfatos son concentrados a medida que se incrementa la biomasa y es en esta fase donde se logr reducir hasta en un 77% la cantidad de fosfato presente en el medio, lo que proviene de una relacin directa entre: cantidad celular, necesidades metablicas, actividades celulares y su acumulacin como material de reserva. Resultados similares fueron hallados por Murata, Beachman y Hardoyo,(4),(20),(21); quienes determinaron que el incremento de biomasa es paralelo al consumo de sales inorgnicas de fsforo; ya que los fosfatos concentrados no slo son empleados por las clulas para elaborar grnulos metacromticos, sino que otorga a las clulas la capacidad de sobrevivir mayor tiempo ante la impronta de factores o

circunstancias adversas, adems de permitir la fosforilacin de enzimas y compuestos orgnicos que sirven como fuente de energa para el metabolismo bacteriano. Recientemente se ha demostrado que el fosfato es incorporado a la clula bacteriana con ayuda de trasportadores y que por accin enzimtica, logran acoplar fsforo a diferentes vas metablicas, las mismas que van a servir como fuente de energa para el metabolismo microbiano. Ordinariamente en condiciones naturales, los microorganismo son capaces de remover cantidades que van de 20 a 40% de la cantidad de fosfatos presentes en los desages domsticos. Por otro lado, en las mejores condiciones de cultivo y empleando recombinantes genticos se ha llegado a concentrar hasta 98% de fosfatos. En el presente trabajo se determin que el porcentaje de fosfato concentrado por los cultivos nativos seleccionados alcanz un nivel de 69 a 77% (Fig. 3), los cuales reflejan significativa capacidad metablica para incorporar fosfatos por los cultivos seleccionados (6).

RECONOCIMIENTO

A la Oficina General de Promocin y Desarrollo de la Investigacin de la U.N.T., en la persona del M.Sc. Hermes Escalante Aorga, por la confianza depositada en la ejecucin del presente trabajo al ser auspiciador del I Concurso de Tesis.

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GRAFICOS :

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