METODO DE FILTRACIN POR MEMBRANA PARA DETERMINACION DE COLIFORMES Y E. coli EN AGUA Seccin Microbiologa de Alimentos PRT-712.

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1.

OBJETIVO Este mtodo se utiliza para medir la calidad sanitaria del agua potable.

2. CAMPO DE APLICACIN Y ALCANCE Se aplica a agua clorada o agua naturales de muy baja contaminacin y sin turbidez. 3. FUNDAMENTO En la tcnica de filtracin por membrana, el grupo coliformes se define como todas las bacterias aerbicas y anaerobias facultativas, Gram negativas, no esporuladas que desarrollan una colonia roja con brillo metlico dentro de 24 horas de incubacin en un medio tipo Endo conteniendo lactosa. El grupo coliformes produce aldehdos por la fermentacin de la lactosa. E. coli bacteria perteneciente al grupo coliformes, que en un medio adecuado y a una temperatura restrictiva de 44,5 C +/- 0,2C, fermenta la lactosa produciendo cido, gas, posee actividad -D-glucoronidasa y actividad triptofanasa. Son negativas a la actividad oxidasa y ureasa. La norma NCh 409, en su versin 2005, seala que: Todas las muestras que se analicen mensualmente en un servicio de agua potable, deben estar exentas de E.coli. Para la verificacin de este requisito, en las muestras en las que se haya detectado la presencia de coliformes totales, se debe confirmar adicionalmente la ausencia de E. coli. REFERENCIAS Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 21 Ed. 2005. 9222B Standard Total Coliform Membrane Filter Procedure.

4.

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5.

TERMINOLOGA

Grupo Coliformes: todas las bacterias que desarrollan una colonia roja con brillo metlico dentro de 24 horas de incubacin a 35 C en un medio tipo Endo conteniendo lactosa. 7 MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS

6.1. EQUIPOS 6.1.1. Bomba de vaco 15 cm Hg y < 25 Bar de presin 6.1.2. Bao de agua termoregulado a 44,5 0,2C 6.1.3. Manifol o soporte 6.2. MATERIALES 6.2.1 Vasos de filtracin plsticos de 47 mm de dimetro sin recipiente inferior (Millipore XX 11047.10). 6.2.2 Filtros de membrana de steres mezclados de acetato y nitrato de celulosa, poro de 0,45 um, superficie cuadriculada, que retengan los organismos a ser cultivados, estables, libres de qumicos que puedan inhibir o estimular el desarrollo microbiano, resistentes a la filtracin (5 minutos), envase de 200 unidades (Millipore HAWG 047 S1). 6.2.3 Placas Petri plsticas estriles de 47 mm. de dimetro, cj 100 unidades (Millipore PD10 047 00). 6.2.4 Matraces de 2000 mL con Silica gel. 6.2.5 Botelln de 25 000 mL. 6.3. MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTE 6.3.1 Agar M-Endo Les 6.3.2 Agua de dilucin buffer fosfato estril 6.3.3 Caldo Lauril Sulfato Triptosa (LST) 6.3.4 Caldo Bilis Verde Brillante (BVB) 6.3.5 Caldo EC-MUG

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DESARROLLO

7.1 RECUENTO COLIFORMES 7.1.1 7.1.2 7.1.3 7.1.4 7.1.5 Colocar la membrana de 0,45 mm en el soporte con pinza estril. Homogeneizar la muestra agitndola vigorosamente 25 veces, con movimientos de arriba abajo. Verter 100mL. de la muestra, en el vaso del filtro y aplicar vaco, para hacer pasar la muestra a travs de la membrana. El vaco no debe exceder de 15 libras de presin. Enjuagar el vaso tres veces, con porciones de 20 a 30 mL. cada vez, de agua de dilucin, y aplicar vaco igual que en la muestra. Cada vez que se procesen muestras incorporar un control de esterilidad de agua de dilucin. Si se procesa un mayor nmero de muestras incorporar este control cada 10 muestras. Retirar la membrana con una pinza estril y depositarla en una placa Petri plstica, preparada previamente con 4 mL. de agar M Endo Les. Las placas preparadas se guardan en refrigeracin y protegidas de la luz, y pueden usarse hasta dos semanas despus de su preparacin. Presionar suavemente la membrana sobre el medio de cultivo utilizando pinza estril. Incubar 22 a 24 hrs. a 35+/- 0,5 C, en incubadora de aire con 15 % de humedad o en caja plstica cerrada con esponja humedecida. Contar las colonias tpicas y atpicas. Ocasionalmente colonias tpicas pueden ser producidas por organismos no coliformes y colonias atpicas pueden ser producidas por organismos coliformes, por lo que se recomienda verificar un nmero representativo de colonias tpicas y atpicas. Colonias tpicas: color rojo, con brillo metlico. Colonias atpicas: color rojo intenso sin brillo metlico 7.1.10 Registrar el recuento de colonias presuntivo en el registro cdigo RG-712.00-025 y realizar las pruebas confirmativas para coliformes.

7.1.6

7.1.7 7.1.8 7.1.9

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7.2 TEST CONFIRMATIVO COLIFORMES Y E. COLI 7.2.1 7.2.2 Inocular al menos 5 colonias tpicas y 5 atpicas, en caldo LST y caldo BVB, simultneamente. Incubar los tubos de LST y BVB por 48 hrs. a 35 +/- 0,5 C y observar la formacin de gas. Si los tubos de caldo BVB, resultan negativos, y los de caldo LST presentan gas, traspasar los tubos positivos nuevamente a caldo BVB, e incubar 48 hrs. a 35 +/- 0,5 C. Observar la formacin de gas en los tubos de fermentacin de BVB, la presencia de gas y crecimiento en caldo BVB, confirma la colonia como coliformes. Anotar los resultados del test confirmativo en el registro cdigo RG-712.00-025 y de las cepas control en el registro cdigo RG-712.00-004. De los cultivos positivos en caldo LST inocular una asada a tubos con caldo EC-MUG para confirmar la presencia de E. coli. Incubar los tubos de caldo EC-MUG en un bao de agua a 44,5 0,2 C durante 24 +/- 2 hrs. Observar bajo una fuente de luz ultravioleta, los tubos que presenten crecimiento y formacin de gas, y registrar en RG-712.00-025 y las cepas control en el registro RG712.00-005. Los tubos que presenten fluorescencia son considerados positivos para la presencia de E. coli.

7.2.3

7.2.4 7.2.5 7.2.6

7.2.7

7.3 EXPRESION Y CALCULO DE RESULTADOS 7.3.1 Considerar aquellas placas que tienen entre 20-80 coliformes y un total de todo tipo de colonias de no ms de 200.

El recuento de coliformes se calcula de la siguiente forma: Coliformes totales /100 mL= N colonias coliformes contadas x 100 mL de muestra filtrada

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7.3.2

Ajustar el recuento inicial sobre la base del porcentaje de verificacin positivo como: x 100 Porcentaje de coliformes verificadas = N de colonias verificadas N total de colonias coliformes sujetas a verificacin

7.4 INFORME DE RESULTADOS 7.4.1 7.4.2 7.4.3 7.4.4 Los resultados del Recuento de coliformes, se expresan cuantitativamente como N coliformes/100 mL de muestra. Si no se ha observado colonias coliformes informar como <1 coliformes/100 mL de muestra. Los resultados para Ausencia. E. coli, se expresan cualitativamente como Presencia o

En el caso de presentarse crecimiento confluente que no permite diferenciar separacin entre las colonias, expresar el resultado como Desarrollo confluente por 100 mL con o sin presencia de organismos coliformes. Cuando el nmero de colonias tanto coliformes como no coliformes es mayor a 200 colonias por membrana o si las colonias no son distinguibles para realizar un recuento preciso, expresar el resultado como Muy Numerosas Para Contar o Confluente, respectivamente.

7.4.5

7.5 CONTROL DE CALIDAD 7.5.1 Incluir como control positivo una cepa de Escherichia coli y como control negativo una de cepa de Staphylococcus aureus sembrada en caldo LST y BVB utilizados para confirmacin de coliformes. Tambin incluir medios de cultivo sin inocular para controlar la esterilidad de los medios de cultivo en el momento de uso. Incluir como control positivo una cepa de Escherichia coli y como control negativo una cepa de Enterobacter aerogenes en Caldo EC_MUG. Tambien incluir medios de cultivo sin inocular para controlar la esterilidad de los medios de cultivo en el momento del uso.

7.5.2

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8.

REGISTROS Tiempo retencin y disposicin 5 aos y despus eliminar a la basura 5 aos y despus eliminar a la basura 5 aos y despus eliminar a la basura 5 aos y despus eliminar a la basura 5 aos y despus eliminar a la basura

Identificacin Almacenamiento Proteccin Recuperacin del registro Registro cepas control de Carpeta roja Bajo custodia Papel incubadoras, RG-712.00- Laboratorio 348 Jefe 004 Laboratorio 348 roja Bajo custodia Papel Registro cepas control de Carpeta baos de agua para anlisis Laboratorio 348 Jefe de coliformes fecales, RGLaboratorio 712.00-005 348 Registro control de Carpeta roja Bajo custodia Papel esterilidad de medios de Laboratorio 348 Jefe cultivo RG-712.00-006 Laboratorio 348 Registro control de Carpeta roja Bajo custodia Papel ambiente RG-712.00-050 Laboratorio 348 Jefe Laboratorio 348 Registro de resultados Carpeta roja Bajo custodia Papel anlisis de coliformes, Laboratorio 348 Jefe coliformes fecales y E. coli Laboratorio en muestras de agua RG348 712.00-025

METODO DE FILTRACIN POR MEMBRANA PARA DETERMINACION DE COLIFORMES Y E. coli EN AGUA Seccin Microbiologa de Alimentos 9. TABLA DE MODIFICACIONES Motivo del cambio Cambio de nombre para adaptar a NCh 409/05. Agrega en item fundamento, los requisitos de la NCh. Actualizar referencia. Se incluyo cado EC-MUG para adaptar a NCh 409/05 Especificar vigencia del medio M Endo Les plaqueado. Acotar tiempos y temperaturas de incubacin. Se incluye algunas recomendaciones Los puntos referidos a control de calidad se trasladaron al item 7.5 Control de Calidad. Indicacin para confirmacin de coliformes. Correccin formula Agregar algunos cambios en la interpretacin de resultados. Incluir item sobre Control de Calidad. PRT-712.03-009

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Revisin N Pg. Modificada 1

Fecha Aprobacin

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10. ANEXOS No Aplica