Sunteți pe pagina 1din 21

UNIVERSITATEA DE TIINE AGRONOMICE I MEDICIN VETERINAR BUCURETI FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII Masterat Biotehnologii i sigurana alimentar, anul I

Tem: Tehnici clasice si moderne de detectie in alimente pentru Listeria Disciplin: Metode moderne de detectare a patogenilor i a microorganismelor modificate genetic (OMG) din alimente

Coordonator:
Conf. Dr. Florentina Matei

Student:
Barbu Emilia Nicoleta

-BUCURETI-

2013 Cuprins
Introducere..................................................................................................................................3 Genul Listeria-Taxonomie..........................................................................................................4 Habitat.........................................................................................................................................6 Izolarea si identificarea...............................................................................................................6 Metode de izolare, identificare si determinare cantitativa a speciei Listeria monocytogenes in produsele alimentare...................................................................................................................7
Metode bacteriologice ...................................................................................... 7 Procedeul FDA.................................................................................................... 7 Procedeul USDA-FSIS........................................................................................... 8 Procedeul NGFIS................................................................................................ 8

Metodologia de izolare utilizata in tara noastra..........................................................................9 Detectarea celulelor bacteriene listeria afectate de diferiti factori stresanti la un nivel subletal ...................................................................................................................................................11
Metode biochimice.......................................................................................... 13 Metode imunochimice....................................................................................... 14 Metode imunofizice........................................................................................ 15 Testul imuno-latex............................................................................................ 15 Flow-citometria................................................................................................. 16 Imunocaptarea.................................................................................................. 17 Metode fizice................................................................................................... 18 Impedansmetria ............................................................................................... 18 Metode de biologie moleculara.........................................................................18 Hibridarea cu sonde nucleare............................................................................19

Bibliografie...............................................................................................................................20

Introducere
Listeria spp. este destul de rspndit n natur, fie ca germen saprofit, epifit, fie ca patogen, att n mediile naturale ct i n organismul animalelor i al omului. n condiii prielnice de temperatur i umiditate, germenul poate supravieui mult timp n sol, ape, gunoi de grajd, furaje i plante, iar n anumite mprejurri dispune de capacitatea de a se nmuli n aceste medii, [Weis, J.et al., 1995]. n afar de om, marea majoritate a speciilor de mamifere, psri domestice i slbatice sunt receptive la infecia listeric, [Sergeant, E.S.et al., 1991] Impactul actual a listeriozei umane nu este pe deplin cunoscut, deoarece n cele mai multe ri este o boal nedeclarabil. Factorii de risc n listerioz sunt factori care nu par a avea o implicare singular i direct n producerea bolii. Astfel s-a demonstrat c pentru apariia bolii este necesar asocierea mai multor factori de risc. Orice factor de risc suplimentar poate crete sansele de producere a bolii, dar nu este obligatoriu s se ajung la listerioz, [Jensen, A., et. al., 1995].

Genul Listeria-Taxonomie
Genul Listeria cuprinde bacili gram pozitivi, cu dimensiuni cuprinse intre 0,4-0,5 micrometri diametru si 0,5-25 micrometri lungime, cu capetele rotunjite, neramificati, dispusi in palisade sau in lanturi. Sunt mobili (prezentand in acest sens un numar de 1-5 cili peritrichi), nesporulati, facultativ anaerobi. Cresc pe medii complexe, in limite largi de temperatura (3-42C) si in prezenta umor concentratii mari de NaCl (10-12%). Sunt catalazopozitivi, oxidazo-negativi, fermenteaza glucoza cu producere de gaz. n acest gen sunt incluse 8 specii: Listeria monocytogenes Listeria ivanovii Listeria innocua Listeria welshimeri Listeria seeligeri Listeria grayi Listeria murrayi Listeria denitrificans. Comitetul International de Sistematica Bacteriana-Subcomitetul de Taxonomie pentru Listeria, n 1992, la Copenhaga, a stabilit pentru genul Listeria 6 specii si 2 subspecii: Listeria monocytogenes Listeria innocua Listeria ivanovii cu doua subspecii:-ivanovii -londoniensis Listeria seeligeri Listeria welshimeri Listeria grayi. n editia a-9-a din 1994 a Bergeys Manual of Determinated Bacteriology, sunt incluse 7 specii:

Listeria monocytogenes Listeria innocua Listeria ivanovii Listeria seeligeri Listeria welshimeri Listeria grayi Listeria murrayi. n prezent Listeria denitrificans a fost exclusa din acest gen si reclasificata ca Jonesia denitrificans, iar Listeria grayi si Listeria murrayi pe baza studiilor de hibridare ADN/ARN facute de Stuart si Welshimer n 1974, sunt suficient de distincte de Listeria monocytogenes, pentru a forma un gen separat Murraya cu doua subspecii: Murraya grayi subsp.grayi Murraya grayi subsp.murrayi. Unii specialisti considera ca genul Listeria este format din 4 specii, Listeria monocytogenes fiind considerata ca un un grup heterogen care contine tulpini patogene dar si apatogene. Asa, Listeria innocua este considerata varianta nehemolitica si apatogena a Listeriei monocytogenes, iar Listeria seeligeri si Listeria welshimeri au fost scoase un timp din genul Listeria ca fiind apatogene, dar recent s-a demonstrat ca Listeria seeligeri poate determina meningita purulenta chiar si la persoanele imunocompetente.

Habitat
Este prezent peste tot n natur: la nivelul solului,plantelor, animalelor i omului. Infecteaz animale domestice (mai ales ovine) i slbatice, psri, reptile, peti,crustacee. Poate fi izolat din alimente, cu precdere din brnzeturi. Studii mai recente au evidentiat prezenta L. monocytogenes in alimentele crude sau insuficient preparate termic, de tipul carnii, produselor din carne, pestilor, crustaceilor, legumelor (ridichi, castraveti), produselor lactate.

Izolarea si identificarea
nainte de jumtatea anilor 1980, mbogirea la rece , bazat pe capacitatea Listeriei de a depi prin cretere la temperaturi sczute germenii competitivi, a fost utilizat n principal pentru izolarea selectiv. Totui datorit lipsei de specificitate a acestei metode i a faptului c este lenta (unii cercettori au incubat bulion pana la 6 luni), procedeurile au fost mult mai mbuntite. Ai fost dezvoltate medii care utilizeaza diversi agenti selectivi, incluzand acriflavina, clorura de litiu, colistin, acid nalixidric, cicloheximida si polimixina. Aceste metode au largit capacitatea laboratoarelor de microbiologie (in special a celor implicate in controlul alimentelor) de a izola selectiv Listeria. Pentru detectarea listeriilor in alimente sunt din ce in ce mai mult utilizate hibridizarea acizilor nucleici si testele imunoenzimatice.

Metode de izolare, identificare si determinare cantitativa a speciei Listeria monocytogenes in produsele alimentare

Metode bacteriologice
Majoritatea procedeelor de izolare si mbogatire selectiva pentru detectarea speciei Listeria monocytogenes se bazeaza pe rezistenta acestei bacterii la anumiti agenti selectivi care inhiba dezvoltarea florei de asociatie. Agentii selectivi cel mai frecvent utilizati n prepararea mediilor de mbogatire selectiva includ : acriflavina, acidul nalidixic, clorura de litiu, feniletanolul, moxalactamul si altii . Procedeele de detectare a acestei specii bacteriene n produsele alimentare sau n spatiile de prelucrare a alimentelor, cele mai raspndite sunt cele recomandate de USDA -FSIS (US Departament of Agriculture - Food Safety Inspection Service) pentru detectarea speciei Listeria monocytogenes n carne si produsele din carne si de FDA (Food and Drug Administration), n lapte si produsele lactate.

Procedeul FDA
Acest procedeu implica o mbogatire initiala a 25g sau 25ml de proba n 225ml LEB (Listeria enrichment broth). LEB contine TSB la care se adauga 0,6% extract de drojdie, 50mg cicloheximida, 15mg acriflavina si 40mg acid nalidixic /litru. Probele se incubeaza la 30C/24-48h, o modificare a procedeului original care cere o mbogatire de 1-7 zile la 30oC. Urmeaza transplantarea de pe LEB pe mediile: Oxford si LPM (lithium chloride phenylethanol moxalactam), ambele medii nlocuiesc agarul Mc Bride modificat (MMA), recomandat initial ca mediu selectiv de izolare. Mediile se incubeaza la 35C/48h apoi coloniile trebuie confirmate ca apartin speciei Listeria monocytogenes. Testele de confirmare includ examinarea coloniilor alb-bleo n lumina oblica la 45 o, mobilitatea, catalaza, hemoliza pe agarul cu snge, testul CAMP, rosu-metil, Voges Proskauer, fermentarea 7

manitolului, xilozei si ramnozei . Procedeul FDA a fost conceput, n mod special pentru optimizarea izolarii speciei Listeria monocytogenes n lapte si produsele lactate.

Procedeul USDA-FSIS
Procedeul de mbogatire selectiva USDA-FSIS pentru izolarea speciei Listeria monocytogenes din carne, a fost dezvoltat de Mc Clain and Lee (25). Ulterior, acest procedeu a fost utilizat cu succes si pentru produsele lactate si probele de mediu. De asemenea, acest protocol include o mbogatire initala a 25ml sau 25g proba n 225ml mediu LEB 1, care nlocuieste bulionul initial de mbogatire UVM (University of Vermont Medium). Bulionul de mbogatire primara LEB 1 contine pe litru: 5g proteoza- peptona, 5g triptona, 5g Leb Lemco, 5g extract de drojdie, 20g clorura de sodiu, 12g fosfat disodic - 7hidratat, 1,35 fosfat monobazic de potasiu, 1g esculina, 20g acid nalidixic, 1,2mg acriflavina. Urmeaza incubarea la 30C/20-24h. Apoi 0,1ml mediu de mbogatire primara se transfera n 10ml bulion de mbogatire secundara Fraser si se incubeaza la 35oC/ 24h si 40h. Bulionul de mbogatire secundara Fraser, contine pe litru: 52g UVM, 3g clorura de litiu, 25mg acriflavina si 0,5g citrat feric de amoniu. Se incubeaza la 35C/24-48h, dupa care probele se trec pe agar Oxford modificat(MOX), care se incubeaza la 35C/24h si se examineaza coloniile tipice de Listeria. Hidroliza esculinei si reactia ulterioara cu citratul feric de amoniu, determina producerea unui precipitat negru n jurul coloniilor de Listeria pe agarul MOX. Coloniile tipice sunt transplantate pe agar cu 5% snge de cal. Coloniile transparente, betahemolitice sunt transplantate n bulion BHI, care se incubeaza peste noapte la 35 oC si se efectueaza testele de confirmare prezentate la procedeul FDA.

Procedeul NGFIS
O metoda larg raspndita n Europa, pentru detectarea speciei Listeria monocytogenes n alimente este metoda NGFIS, recomandata de Netherland Goverment Food Inspection Service, elaborata de Van Netten si col. 8

Acesti autori au raportat o sensibilitate superioara a acestei metode, fata de procedeul USDA, cnd se urmareste detectarea speciei Listeria monocytogenes din alimente n care se afla sub nivelul de 10CFU/ml. n procedeul NGFIS, pentru mbogatirea selectiva se utilizeaza bulionul PALCAMY, cu incubare la 30oC/24-48h, apoi cultura se trece pe agar PALCAM. Bulionul de mbogatire selectiva L-PALCAMY contine la litru de apa distilata: 23g peptona Oxoid, 5g extract de drojdie, 5g Lab Lemco, 5g lapte peptonizat Oxoid, 5g Na Cl, 5g D-manitol, 0,8g esculina, 0,5g citrat feric de amoniu, 80mg rosu fenol, 100000UI polimixina B, 5mg acriflavina, 10g clorura de litiu, 30mg ceftazidime, moxalactam si 25ml emulsie de galbenus de ou. Agarul PALCAM contine la litrul de apa distilata: 39g agar Columbia, 0,5g D-glucoza, 10g D-manitol, 0,8g esculina, 0,5g citrat feric de amoniu, 80mg rosu fenol, 100000UI polimixina B, 5mg acriflavina, 15g clorura de litiu si 20mg ceftazidime sau moxalactam. Numeroase studii au urmarit compararea diferitelor procedee de izolare a speciei Listeria monocytogenes din produsele alimentare. Doyle and Schoeni(21), au comparat procedeul FDA, cu metoda de mbogatire la rece (Gray) si cu un procedeu propriu de mbogatire selectiva, SEP, (selective enrichment procedure). S-a urmarit izolarea prin aceste procedee a speciei Listeria monocytogenes dintr-un lot de brnza "soft ripened" contaminat. Prezenta bacteriei a fost confirmata, n 41 din 90 de probe examinate. Prin procedeul de mbogatire la rece, prezenta bacteriei a fost detectata n 21 probe, n timp ce prin procedeul FDA, numai n 16 probe. n cadrul unui studiu al CDC, asupra factorilor de risc alimentari pentru listerioza sporadica, n perioada noiembrie 1988, decembrie 1990, Hayes si col., au condus un studiu comparativ al celor 3 procedee microbiologice de izolare a bacteriei din 899 probe de alimente. Sensibilitatea de detectare pentru fiecare metoda a fost: 65% pentru procedeul FDA, 74% pentru procedeele USDA si NGFIS. Folosind o combinatie a ultimelor doua procedee, sensibilitatea de detectare a crescut la 90%. Pe baza acestor rezultate CDC a adoptat utilizarea simultana a metodelor USDA si NGFIS pentru izolarea acestei bacterii din alimente . L-

Metodologia de izolare utilizata in tara noastra

n tara nostra, se utilizeaza o metodologie de izolare si identificare a speciei Listeria monocytogenes din produsele alimentare de origine animala, n care sunt incluse 3 metode de izolare: USDA, TERPLAN si MERCK. Procedeul USDA a fost prezentat anterior. Metoda TERPLAN utilizeaza 4 medii de cultura si anume: un bulion de mbogatire, agarul Oxford, mediile TSA si TSB. Bulionul de mbogatire contine acid nalidixic, hidroxid de potasiu, triptona, peptona, dextroza, fosfat dipotasic, extract de drojdie si apa distilata. Mediul TSA este un agar cu triptona din soia, iar mediul TSB este un bulion cu triptona din soia si extract de drojdie. Proba nsamntata n bulionul de mbogatire se incubeaza 48h la 30 oC, dupa care se fac strieri pe agarul Oxford. Incubarea se realizeaza n aceleasi conditii. Coloniile caracteristice pentru Listeria spp. sunt mici, nconjurate de un halou negru, 3-5 astfel de colonii se transplanteaza n mediile TSA si TSB. Metoda MERCK utilizeaza un bulion de mbogatire si agarul MERCK. Bulionul de mbogatire contine: triptona, glucoza, clorura de sodiu, tiocianat de potasiu, tiamina si tripaflavina n apa distilata. Agarul MERCK contine: triptona, glucoza, clorura de sodiu, tiamina, tripaflavina, acid nalidixic, agar si apa distilata. Proba se nsamnteaza n bulionul de mbogatire, se incubeaza 48h, la 30oC, apoi se fac strieri pe agarul MERCK. Se incubeaza n aceleasi conditii si 3-5 colonii caracteristice (mici cu centrul galben-verzui si periferia transparenta usor verde- albastruie), se transplanteaza n bulion si agar nutritiv. n continuare se executa testele pentru identificare din care amintim: mobilitatea, reactia catalazei, reactia oxidazei, fermentarea glucidelor, testul de hemoliza si testul CAMP. Dupa ce bacteria izolata a fost identificata ca Listeria monocytogenes, urmeaza serotipizarea tulpinii respective. Datorita faptului ca majoritatea cazurilor de listerioza la om sunt determinate de trei serotipuri (1/2a, 1/2b si 4b), serotipizarea are o importanta minora n investigatiile epidemiologice. Numeroase metode de subtipizare au fost utilizate n decursul timpului: tipizarea fagica, tipizarea izoenzimatica (prin MEE-multilocus enzyme electrophoresis), ribotipizarea (utilizand Ribosomal DNA fingerprinting), tipizarea plasmidica si tipizarea n functie de monocinele sintetizate de tulpinile de Listeria monocytogenes [13]. n ultimul timp, pentru detectarea acestei specii bacteriene n produsele alimentare au fost utilizate o serie de metode rapide care utilizeaza ELISA, flow citometria, sau amprente AND. nsa aceste metode sunt conditionate de necesitatea mbogatirii probei la un nivel 10

minim detectabil de 105-106 Listeria/ml. Toate aceste procedee mentionate anterior, conventionale sau rapide, folosesc medii de mbogatire nalt selective, care faciliteaza dezvoltarea bacteriilor din genul Listeria, n pofida florei de asociatie. Totusi aceste medii selective nu permit detectarea celulelor bacteriene care au fost afectate de caldura, frig sau substante chimice, nsa la un nivel subletal si care ar putea exista n diferite alimente, sau spatiile tehnologice de obtinere a acestora.

Detectarea celulelor bacteriene listeria afectate de diferiti factori stresanti la un nivel subletal
Stresul provoaca modificari n structura macromoleculara si organizarea celulei bacteriene. Modificarea proteinelor este de o importanta majora datorita implicarii lor n metabolismul microorganismului respectiv. Efectul diferitilor factori de stres (temperatura joasa: 4oC si ridicata: 49oC, valori extreme de pH :4 si 9,5 precum si diversi factori chimici: detergenti-SDS 0,015%, deoxicolat 0,3% si etanol 5%) asupra profilului proteic la Listeria monocytogenes a fost studiat de Gormon and Phan-Thanh n anul 1994 [36]. Autorii au observat ca stresul a represat sinteza a 50% din proteinele sintetizate de aceasta bacterie n conditii normale si a indus sinteza unor proteine noi specifice de stres. Fiecare factor de stres a determinat sinteza unui set de proteine specifice, totusi au existat si proteine comune sintetizate n prezenta unor factori diferiti. Mai mult dect att, acelasi factor a indus sinteza unui singur tip de proteina la 2 specii diferite: Listeria monocytogenes si Listeria innocua ceea ce demonstreaza ca bacterii nrudite pot dezvolta strategii similare, daca nu identice, n raspunsul fata de acelasi factor de stres. Specia Listeria monocytogenes ar putea fi afectata n timpul prelucrarii produselor alimentare de factori ca: ncalzirea, congelarea, uscarea, iradierea, sau expunerea la diferiti agenti chimici (dezinfectante, conservanti, acizi). Toate procedeele de detectare curenta, cu exceptia mbogatirii la rece, implica mbogatirea selectiva. Tehnica de mbogatire la rece nu se poate utiliza nsa n analizele de rutina datorita timpului ndelungat (aproape 2 luni) necesar pentru mbogatire. Metodologia curenta subestimeaza nsa numarul real de bacterii prezent ntr-un produs, datorita neglijarii celulelor bacteriene stresate subletal. Numeroase studii au testat diferiti compusi (acriflavina, polimixina, feniletanolul) care intra n compozitia mediilor 11

selective si s-a constatat ca acestia inhiba dezvoltarea bacteriilor afectate (stresate) termic. Studiul factorilor nutritivi care au indus regenerarea listeriilor afectate termic a fost facut de Busch and Donnely care au constatat ca: Glucoza, lactoza, sucroza, extractul de drojdie, piruvatul, magneziul si fierul au determinat regenerarea bacteriilor din speciile Listeria monocytogenes si Listeria innocua afectate de caldura. A fost formulat un mediu de cultura lichid de regenerare/mbogatire, care include acesti compusi. Acest mediu, LRB ( Listeria repair broth ), a permis completa revitalizare a celulelor bacteriene afectate, n timp de 5h la 37oC. LRB contine pe litrul de apa distilata: 30g TSB, 5g glucoza, 6g extract de drojdie, 4,94g sulfat de magneziu, 0,3g sulfat feros, 10g acid piruvic, 8,5g MOPS-free acid si 13,7g MOPS sare de sodiu. Dupa regenerare, agentii selectivi: acriflavina, acidul nalidixic si cicloheximida se adauga la LRB n aceleasi concentratii cu cele din bulioanele utilizate de procedeele USDA si FDA. Comparnd eficacitatea LRB de a induce regenerarea/ mbogatirea bacteriilor din genul Listeria afectate termic, cu cea a altor medii, s-a observat ca bulioanele de mbogatire FDA si UVM nu au indus revitalizarea. Populatiile de Listeria, n mediile de mbogatire selectiva dupa 24h incubare, au fost cuprinse ntre 1,7 x 10 8 si 9,1 x 108

UFC/ml, comparativ cu populatiile n LRB de 2,5 x 1011- 8,2 x 1011 UFC/ml. Totodata a fost studiata rezistenta listeriei la conditiile de congelare. Golden si col.[32] au comparat gradul de afectare a 4 tulpini de Listeria monocytogenes, supuse congelarii la -18oC, timp de 7 si 14 zile. Procentul de afectare a oscilat ntre 72 si 80%. El-Kest and Marth [24] au observat un procent de afectare de 65% si 55% mortalitate, dupa mentinere n tampon fosfat, la 18oC, 24h. Glicerolul n concentratie de 2 si 4% a asigurat protejarea bacteriilor n timpul congelarii. Palumbo and Williams au utilizat diferite medii pentru a determina cantitativ Listeria monocytogenes (afectate sau nu), n diferite produse congelate si a aratat ca pH-ul produsului a influentat gradul de afectare n timpul stocarii prelungite la - 18oC. De asemenea a fost examinat modul de revitalizare a bacteriilor din specia Listeria monocytogenes, afectate de congelare si diferite substante dezinfectante, n LRB. BudoAmoako si col. au observat ca bacteriile afectate termic (5 min. la 60 oC) si prin congelare (7 zile la -20C), s-au regenerat n 6-8 h n TSB cu 0,6 % extract de drojdie (TSBYE) la 35 oC, dar si-au pierdut capacitatea de regenerare n LEB. Procentul de afectare/mortalitate al speciei Listeria monocytogenes au influentat tipul si concentratia dezinfectantelor, timpul de expunere si procedeul de mbogatire. Mediul LRB a permis revitalizarea bacteriilor afectate de actiunea substantelor dezinfectante, pe cnd 12

UVM ( University of Vermont Medium) nu a indus regenerarea acestora. Crowford si col. au aratat ca n lapte, Listeria monocytogenes afectata termic, prin ncalzire la 71,7oC si-a pierdut capacitatea de regenerare n timpul stocarii la 4oC/28 zile. Donnely a studiat capacitatea speciilor Listeria monocytogenes si Listeria innocua afectate termic de regenerare n laptele pasteurizat. Capacitatea de regenerare a fost puternic influentata de temperatura. La 4oC, regenerarea a fost initiata dupa 8-10 zile si a fost

completa dupa 16-19zile. n schimb, la 10oC regenerarea a fost initiata imediat si a fost completa dupa 4 zile. La 26 si la 37oC regenerarea s-a produs dupa 13h si respectiv 9h. Diferentele ntre rezultatele obtinute de Crowford si Meyer reflecta temperaturile diferite utilizate pentru afectarea termica a bacteriilor. Temperatura ridicata folosita de Crowford a indus afectarea grava, ireversibila a germenilor . Produse (cum ar fi laptele), care permit regenerarea bacteriilor afectate, asociate cu nedetectarea germenilor n aceste alimente ar putea avea consecinte semnificative asupra sanatatii consumatorilor, mai ales daca se au n vedere studiile lui Mc Carthy care au demonstrat ca germenii din specia Listeria monocytogenes, stresati termic dupa regenerare, au fost la fel de patogeni ca nainte de afectarea termica.

Metode biochimice
Metodele biochimice se bazeaza pe sisteme biochimice miniaturale cu ajutorul carora sunt testate tulpinile izolate pe mediile selective. SISTEMUL API LISTERIA (Bio Merieux, Mary LaEtoile, France) se bazeaza pe investigarea a zece caractere biochimice ntr-un sistem microtest, iar rezultatele se obtin n 24h. MONO CONFIRM TEST (AES Laboratoire, Combourg, France) este o micrometoda bazata pe determinarea a patru caractere biochimice care permit confirmarea genului Listeria si identificarea speciei Listeria monocytogenes. Evidentierea enzimei D-aminopeptidaza, permite diferentierea tulpinilor de Listeria monocytogenes n 24 h de alte specii de Listeria.

13

MICROBACT 12L (Rhone-Diagnostic-Lyon-France) este o coloana de identificare compusa din 11 teste de fermentare a glucidelor si un test de hemoliza. Rezultatele sunt obtinute n 6-24 ore.

Metode imunochimice
Aceste metode se bazeaza pe recunoasterea antigenului Listeria cu ajutorul anticorpilor specifici anti-Listeria si mai recent anti-Listeria monocytogenes. Complexul antigen-anticorp este pus n evidenta printr-o reactie chimica de culoare sau prin fluorescenta. Aceste metode au o sensibilitate de 105-106 bacterii/ml, ceea ce necesita o mbogatire prealabila, de obicei n doua etape (n bulion de mbogatire). Caracteristicele unor metode imunochimice sunt prezentate n tabelul 1.

TABEL 1 Caracteristicile unor metode imunochimice pentru detectare Listeria METODA Tehnica Specificitate mbogatire Sensibilitate (UFC/ml) Rapiditate Tehnica de evidentiere KIT LISTERIA Elisa tip sandwich Listeria spp. 2-3 zile 7x10 4 1,5h Colorimetrie (Ac. cuplati cu peroxidaza) LISTERIA TEK Elisa tip sandwich Listeria spp. 2 zile 10 5 1,5h Colorimetrie (Ac. cuplati cu peroxidaza) VIDAS ELFA (Enzime Linked Fluorescent Assay) Listeria spp. Listeria 2 zile 10
5

monocit. 2 zile 5x10


5

45min. Florimetrie

1,1h Florimetrie

(Ac. cuplati cu (Ac. cuplati cu fosfataza alcalina) fosfataza alcalina)

Sistemul VIDAS permite detectarea Listeria spp. sau Listeria monocytogenes prin tehnica ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay). 14

Dupa o dubla mbogatire n bulionul Fraser, proba este depusa ntr-un cartus al sistemului automat. Prin aspirarea probei cu ajutorul unui un con sensibilizat cu anticorpi monoclonali se asigura fixarea specifica a germenilor din genul Listeria. Complexul antigenanticorp este pus n contact cu anticorpi marcati cu fosfataza alcalina, iar ansamblul este evidentiat cu un substrat al acestei enzime ( 4-metil-umbeliferil-fosfat), prin determinarea intensitatii fluorescentei la 450 nm.

Metode imunofizice
Aceste metode au la baza formarea complexului antigen-anticorp care este evidentiat cu ajutorul unei tehnici fizice. Principalele metode sunt prezentate n tabelul 1.

Testul imuno-latex
KIT-ul Listeria Rapid Test (Unipath,Dardilly, France) este un test imunologic realizat pe o placa ce contine anticorpi monoclonali anti antigenul flagelar B-Listeria, dispusi sub forma de banda. Proba, dupa o dubla mbogatire n bulion Fraser si LEB tamponat, este depusa pe suportul absorbant al placii, care contine particule de latex bleo sensibilizate cu anticorpi. Prezenta n proba a germenilor din genul Listeria va induce formarea de complexe antigen-anticorp, cu anticorpii fixati pe particulele de latex. Aceste complexe vor migra prin capilaritate, de-a lungul suportului pna vor ntlni anticorpii monoclonali dispusi sub forma de banda. Datorita imobilizarii complexelor produse, se formeaza o banda de coloare albastra, n cazul reactiei pozitive. Principalele avantaje ale acestei tehnici sunt: ergonomia, simplitatea de aplicare si rapiditatea de interpretare. Ca si n cazul metodelor ELISA si ELFA, sensibilitatea intrinseca a acestui kit nu permite ntotdeauna detectarea rapida a bacteriilor stresate, care se multiplica foarte lent.

15

TABEL 2 Metode imunofizice METODA Detectare Specificitate Sensibilitate intrinseca (UFC/ml) mbogatire Rapiditate* Sistem de detectare FLOW CITOMETRY Calitativa Listeria spp.
106 107

IMUNO-LATEX Calitativa Listeria Rapid Test Listeria spp.


10 4 105

IMUNOCAPTARE Cantitativa Lister Test Listeria spp. 1 fara 27h** Etalare pe geloza dotblot Calitativa Lister Screen Listeria spp. 1 18h 42-66h Etalare pe geloza PALCAM

24h 26h Fluorescenta

42h 43h Imobilizarea complexelor Ag/Aclatex

* Fara confirmarea rezultatelor **Cu confirmarea coloniilor prin dot-blot.

Flow-citometria
Aceasta metoda permite detectarea unei populatii bacteriene marcate, n mediu lichid.

16

Dupa o mbogatire selectiva n bulion LEB, ADN-ul bacterian este colorat cu iodura de propidium, apoi celulele bacteriene din genul Listeria, sunt marcate cu anticorpi specifici cuplati cu izotiocianat de fluoresceina. n faza urmatoare, proba este expusa unui fascicul de raze laser si se realizeaza interpretarea. Celulele bacteriene sunt caracterizate n functie de morfologie, antigenele de suprafata si continutul n ADN. Flow-citometria are o sensibilitate intrinseca de 106-107 Listeria monocytogenes/ml, iar cu o faza de mbogatire de 24h, contaminarea minima detectabila este de 10 2 Listeria monocytogenes/ml. Tehnica este aplicabila si pe probe de consistenta solida, daca examinarea se executa n bulion de mbogatire

Imunocaptarea
Imunocaptarea este o metoda originala care permite detectarea si concentrarea germenilor din genul Listeria existenti ntr-o proba. Bacteriile sunt captate cu ajutorul anticorpilor policlonali fixati pe bile magnetice microscopice. Complexele Listeria-imunobile sunt captate sub actiunea cmpului magnetic, apoi imunobilele sunt spalate, iar complexele Listeria-anticorpi policlonali sunt evidentiate prin diferite metode. n combinatie cu separarea imunomagnetica sunt utilizate numeroase sisteme rapide de detectare pentru Listeria: ELISA, PCR, dot-blot, hibridare etc. Cea mai folosita metoda consta n etalarea imunobilelor pe agar selectiv, ulterior coloniile caracteristice sunt supuse confirmarii. Aceasta metoda prezinta avantajul ca permite concentrarea germenilor din genul Listeria, existenti ntr-o proba. Datorita utilizarii unui numar mare de imunobile magnetice, sensibilitatea metodei este foarte mare (1 bacterie/ml.). Din punct de vedere comercial imunobilele VICAM (Watertown SUA) sunt distribuite sub forma a doua chituri:

Lister Screen Lister TestTM .

Lister Screen este o metoda calitativa, combinnd imunocaptarea cu

etalarea pe agar selectiv PALCAM, totodata este o metoda foarte sensibila (0,5-1UFC/ml.) si

17

specifica, prezentnd avantajul ca permite decelarea bacteriilor stresate din alimente.

Lister TestTM permite o analiza cantitativa a germenilor din genul

Listeria dintr-un produs alimentar sau o proba de mediu. Dupa etapa de imunocaptare imunobilele sunt etalate pe agar selectiv cu ceftazidima si acid nalidixic. Coloniile caracteristice sunt supuse confirmarii prin tehnica dot-blot, cu anticorpi monoclonali. Complexele imune sunt apoi puse n evidenta printr-o reactie enzimatica. Metoda MIPA (Magnetic Immuno PCR Assay) combina imunocaptarea cu detectarea prin PCR (poymerase chain reaction). Prin imunocaptare, pe lnga concentrarea germenilor se asigura si eliminarea unor inhibitori ai polimerizarii, prezenti n unele produse alimentare. Timpul necesar obtinerii rezultatelor este de 55h.

Metode fizice Impedansmetria


Aceasta metoda se bazeaza pe determinarea variatiilor electrice dintr-un mediu de cultura, datorate metabolismului microbian. n cultura obtinuta n bulion se aplica 2 electrozi care vor nregistra variatia impedantei n urma dezvoltarii culturii. Tehnica poate fi utilizata si pentru determinarea numarului de germeni si prezinta o serie de avantaje: rapiditatea de detectare (24h), automatizare, economie de medii si manopera. Totusi, detectarea este dificila atunci cnd probele sunt puternic contaminate si impune utilizarea unor medii nalt selective.

Metode de biologie moleculara


Tehnicile de biologie moleculara permit detectarea secifica a germenilor din genul Listeria, sau chiar a speciei Listeria monocytogenes cu ajutorul unor sonde nucleare a caror tinte sunt localizate pe ADN sau ARN. Totodata sunt metode deosebit de specifice care

18

asigura detectarea inclusiv a tulpinilor atipice. Dupa utilizarea sondelor nucleare constituite spre exemplu dintr-un fragment a genei care codifica listeriolizina O, [58], au fost sintetizate oligonucleotide pentru detectarea bacteriei fie prin hibridare cu o sonda, fie prin tehnica PCR cu ,,amorse".

Hibridarea cu sonde nucleare


Tehnicile de hibridare a acizilor nucleici se bazeaza pe capacitatea catenelor complementare de ADN sau ARN de legare specifica si de a forma complexe stabile dublu catenare. Pentru detectarea speciei Listeria monocytogenes prin hibridare nucleara, se utilizeaza 2 sonde specifice de ARN ribozomal 16S (Metoda Gene Track sau AccuProbe). Aceste metode necesita o faza de mbogatire prealabila indiferent de sonda utilizata (Tabel 3).

TABEL 3 Metode de hibridare cu sonde comerciale pentru detectare Listeria METODA Specificitate mbogatire Sensibilitate (UFC/ml) Rapiditate Sistem de evidentiere 30 min. Colorimetrie (Reactie 2h 30min Luminiscenta GENE-TRACK Listeria spp. sau L.m. 24h 5x104 ACCUPROBE TM L. monocytogenes 24-48h* 106

imuno-enzimatica) (ester de acridinium) *n caz de rezultat negativ se aplica o mbogatire secundara. Kit-ul Accuprobe TM(Gen-Probe sau Diego, USA) permite detectarea specifica a speciei Listeria monocytogenes dupa mbogatire si etalare pe geloza. Apoi celulele bacteriene sunt lizate pentru a elibera ARN-ul ribozomal, iar hibridarea se realizeaza cu o sonda de ADN monocatenar marcata cu ester de acridinium. Hibrizii sunt detectati prin luminiscenta 19

(cantitatea de lumina este direct proportionala cu cantitatea de ARN ribozomal).

Bibliografie
1. CRAWFORD R.G., BELIVEAU C.M., PEELER J.T., DONNELY C. W. and BUNNING V.K. (1989). Comparative recovery of uninjured and heat-injured Listeria monocytogenes cells from bovine milk. Appl. Environ. Microbiol. 55, 1490-1494. 2. DESTRO M.T., J.M. FARBER (1996) Use of molecular typing methodes to trace the dissemination of Listeria monocytogenesin a shrimp processing plant., Appl. Envir. Microb., 62, 2, 705-711. 3. DONNELY C.W. and BAIGENT G.J. (1986). Method for flow cytometric detection of Listeria monocytogenes in milk. Appl. Environ. Microbiol. 52:689-695. 4. BUDO-AMOAKO E., TOORA S., ABLETT R. and SMITH J. (1992). Evaluation of the ability of primary selective enrichment to resuscitate heatinjured and freeze injured Listeria monocytogenes cells. Appl. Environ. Microbiol. 58, 3177-3179. 5. DOYLE M.P., L.M. MESKE and E.H. MARTH. (1985) Survival of Listeria monocytogenes during manufacture and storage of nonfat dry milk. J. Food Prot. 48, 740-742.
20

6. EL-KEST S.E. and MARTH E.H. (1992). Freezing of L.monocytogenes and other microorganism: A review. J. Food Prot. 55, 579-582 7. GOLDEN D.A. BEUCHAT L.R. and BRACKETT R.E. (1988). Inactivation and injury Listeria monocytogenes as affected by heating and freezing. Food Microbiol. 5, 17-23. 8. HUI Y.H., RICHARD GORHAM J., MURRELL K.D. and DEAN O. CLIVER. (1994). Foodborne Disease Handbook , Marcel Dekker, N.Y. 9. MEYER D.H. and DONNELLY C.W. (1992) - Effect of incubation temperature on repair of heat-injured Listeria in milk, J. Food Prot., 55, 579582. 10.PALUMBO S.A. and WILLIAMS A.C. (1991). Resistance of Listeria monocytogenes to freezing in foods. Food Microbiol. 8, 63-68. 11.Mc CARTHY S.A. (1991). Pathogenicity of nonstressed , heat-stressed and resuscitatea Listeria monocytogenes 1A1 cells. Appl. Environ. Microbiol. 57, 2389-2391. 12.THOMAS L.V. and J.W.T. WIMPENNY (1996) Investigation of the effect of combined variations in temperature, pH and NaCl concentration on nisin inhibition of Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus., Appl. Envir.Microb., 62, 2, 2006-2012. 13.WALKER S.J., ARCHER P. and BANKS J.G. (1990). Growth of Listeria monocytogenes of refrigeration temperatures. J. Appl. Bacteriol. 68, 157162. 14.BEUMER R.R. (1996)-Listeria spp. in domestic environments., Epidem. and Inf., 117, 3, 429- 437. 15.BAYLES D.O., B. A. ANNES and B.J. WILLKINSON (1996), Appl. Eviron Microb., 62, 3, 1116-1119. 16.Alexandru T.Bogdan, Iulian ogoe, Gheorghe Cmpeanu .a, Microbiologia alimentelor-volumul I- Patogeni alimentari, Editura Ascelepius, Bucuresti, 2011. 17. Brzoi D., Apostu S. Microbiologia produselor alimentare, Ed. Risoprint, ClujNapoca, 2002, p. 150-155. 18. Bourgeois CM., Mescle J.F., Zucca J. - Microbiologie alimentaire, Aspect microbiologique de la scurit et de la qualit des aliments, Tec et Doc Lavoisier, Paris, 1996. 19. Bradshaw J.G., Peeler J.T., Twedt R.M. - Thermal resistance of Listeria sp.in milk, I. Food Prot., 54, 1991, p. 12-14.

21