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Boletim Informativo da SBCS | janeiro - abril | 2009

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BIOLOGIA DO SOLO

A nova cincia da metagenmica: revelando os segredos do planeta microbiano

Elisngela Soares Gomes Accio A. Navarrete Eliana Gertrudes de Macedo Lemos Siu Mui Tsai Ftima Maria de Souza Moreira

Os microrganismos esto por toda parte e, apesar de normalmente no serem vistos, so essenciais para todos os aspectos da vida na Terra. Muitos processos na biosfera so conduzidos pela capacidade praticamente infinita dos microrganismos de transformar o mundo a seu redor. Eles tornam disponveis para os demais seres vivos os elementos-chave da vida, como carbono, nitrognio, oxignio e enxofre. Outro aspecto de interesse a capacidade de biorremediao de reas poludas utilizando microrganismos. As comunidades microbianas so entidades complexas, equilibradas e integradas, que se adaptam de forma rpida e flexvel s mudanas ambientais. Algumas dessas comunidades podem conter milhares de grupos de microrganismos interdependentes, que tm desenvolvido inumerveis estratgias de sobrevivncia, adquiridas ao longo de milhares de geraes individuais e bilhes de anos de mudanas ambientais, acumulando inumerveis variaes bioqumicas. Embora o entendimento de como o mundo funciona em nvel molecular esteja longe de ser completo, a descoberta de novas molculas traz importantes aplicaes na conservao e remediao ambiental, alm de sua aplicabilidade na agricultura, medicina e indstria. A descoberta de novos microrganismos e caracterizao de suas funes so os maiores objetivos do estudo da diversidade microbiana. Historicamente, foi obtido por meio do cultivo de linhagens seguido de sua caracterizao por testes nutricionais, bioqumicos e fisiolgicos Decorrente dessa abordagem, o entendimento das comunidades microbianas como um

todo ficou atrs do conhecimento de seus membros individuais, o que limitou a avaliao taxonmica e filogentica e a estimativa da diversidade microbiana do ambiente. Progressos na ecologia molecular microbiana tm revelado que os mtodos tradicionais de cultivo so falhos ao representar a diversidade m i c r o b i a n a , u m a ve z q u e n o representam as condies encontradas em ambientes naturais, e tendem a selecionar microrganismos de crescimento rpido e adaptado ao meio de cultivo utilizado. Assim, a maioria dos microrganismos permanece no cultivveis pelas tcnicas laboratoriais disponveis e as estimativas apontam que de 0,1% a 1% das bactrias presentes no solo so passiveis de cultivo. Recentemente, novas metodologias comearam a possibilitar o estudo de microrganismos em comunidades complexas, permitido a percepo do que eles so capazes e como trabalham, por meio de mtodos independentes da prtica de cultivo, fornecendo uma nova abordagem para o estudo do mundo microbiano. O conjunto dessas metodologias conhecido como metagenmica. O termo, cunhado em 1989 por Handelsman et al (1998), descreve os campos de pesquisas tambm conhecidos por comunidade genmica, ecogenmica ou genmica ambiental. As abordagens tradicionais de microbiologia j tm mostrado o quanto teis podem ser os microrganismos. No entanto, a abordagem metagenmica ir estender amplamente a habilidade dos pesquisadores em descobrir microrganismos e se beneficiar de suas capacidades.

Os novos mtodos
O estudo da estrutura da comunidade permite conhecer quem so os microrganismos de certos ambientes. As ferramentas desenvolvidas para esse fim so os arranjos filogenticos (arrays); sequenciamento de regies gnicas conservadas que podem possibilitar a identificao dos gneros estudados, como o sequenciamento do 16S rRNA e a anlise de imagens da comunidade.

Estudos em ecologia microbiana tm enfatizado as medidas de diversidade biolgica para mensurar as mudanas na variedade e nas estruturas de comunidades microbianas. O mtodo empregado para expressar as estimativas de riqueza de Unidades Taxonmicas Operacionais (UTOs) em uma comunidade microbiana capaz de considerar o nmero de amplicons de rDNA separados pela tcnica de Eletroforese em Gel com Gradiente

Desnaturante (DGGE) e o nmero de picos correspondentes a fragmentos de DNA detectados por Anlise Automatizada do Espao Intergnico Ribossomal (ARISA). Os produtos de PCR obtidos com vrios conjuntos de primers que se anelam a regies conservadas do gene rRNA 16S e abrangem uma ou at trs regies variveis tm sido separados por DGGE, gerando fingerprinting dos constituintes mais dominantes de uma

comunidade microbiana (MUYZER et al., 1993). Entretanto, muitas vezes, a molcula de rRNA no oferece variao suficiente para diferenciar linhagens dentro de espcies. A anlise de sequncias intergnicas espaadoras entre o rDNA 16S e 23S em procariotos e o rDNA 18S e 28S em eucariotos pode gerar maior variabilidade, a fim de investigar organismos em nvel intraespecfico (GRTLER & STANISICH, 1996; FISHER & TRIPLETT, 1999).

Figura 1 - Riqueza de Unidades Taxonmicas Operacionais (UTOs) detectada com base na separao de amplicons de rDNA 16S de Archaea e Bacteria e rDNA 18S de fungos por DGGE e na variabilidade no comprimento do espao intergnico 16S-23S (Bacteria e Archaea) e 18S-28S (Fungi) do gene rRNA pela tcnica de ARISA.

Riqueza de UTO sem 250 mg de solo

Investigar o potencial gentico de uma comunidade microbiana fornece um indicativo sobre o que eles podem fazer, sobretudo sob a tica do seu potencial biotecnolgico. As estratgias para esse tipo de investigao abrangem a metagenmica, arranjos gnicos funcionais, bem como as denominadas Neural gene networks.

Archaea

Bacteria

Fungi

1 - DGGE

2 - ARISA

123.5

58.0

71.0

73.92

23.08 10.1 24.08 51.08 24.91 1 2 1 9.92 22.08 40.25 18.5 2 24.66 15.17 17.66 42.33 23.83 1 Pastagem 2 19.75

10.67 26.0

25.83

O estudo de quais so os papis exercidos por esses microrganismos em uma comunidade feito por meio de uma investigao sobre o que eles esto produzindo. Isso possvel por meio do acesso expresso gnica dessa comunidade, por meio da metatranscritoma e da metaprotemica.

42.16 23.13 1 2

Floresta primria

Sistema agrcola tradicional

Floresta secundria

As amostras de solo foram coletadas em triplicatas a 0-20 cm de profundidade, sob floresta primria tropical, sistema agrcola tradicional baseado em cultura anual (roa de mandioca), pastagem homognea implantada em 1970 e dominada (> 90% da cobertura basal) por grama batatais (Paspalum notatum flugge) e floresta secundria em estgio avanado de regenerao (10 anos ou mais de abandono da rea) na regio do Alto Solimes (4o 21' e 4o 26' Sul e 69o 36' e 70o 1' Oeste), municpio de Benjamin Constant, noroeste do estado do Amazonas. Todos os sistemas de uso da terra amostrados neste estudo eram isentos de corretivos, fertilizantes e controle de pragas (Projeto BioBrasil).

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BIOLOGIA DO SOLO

A abordagem metagenmica ir estender amplamente a habilidade dos pesquisadores em descobrir microrganismos e se beneficiar de suas capacidades.
No estudo referenciado pela Figura 1, as tcnicas de DGGE e ARISA foram empregadas a fim de testar a hiptese de que o efeito antropognico de desmatamento e uso da terra com cultivo agrcola tradicional e pastagem na regio do Alto Solimes, Amaznia Ocidental, tem implicao nas estruturas de comunidades de Archaea, Bacteria e Fungi presentes no solo. O estudo demonstrou a maior riqueza de UTOs na deteco feita com ARISA. Isto se deve capacidade da tcnica de DGGE revelar apenas os membros dominantes de populaes microbianas mistas. Devido maior variabilidade do espao intergnico rDNA 18S e 28S, os maiores valores de riqueza foram observados em ARISA, usando primers especficos para as comunidades fngicas do solo. Proporcionalmente, as duas tcnicas moleculares empregadas responderam hiptese da mesma maneira, revelando que a retirada da cobertura florestal original no foi caracterizada por uma simplificao das comunidades microbianas em termo da riqueza de UTOs em solos sob sistemas agrcolas tradicionais e pastagem na regio do Alto Solimes. Entretanto, ao considerar os agrupamentos hierrquicos definidos com base na separao de amplicons de rDNA por DGGE e os padres de pico gerados em ARISA, as estruturas de comunidades microbianas dos solos sob sistema agrcola tradicional e pastagem ordenaram-se espacialmente distante daquelas presentes em solos sob floresta primria, quando analisadas por mtodos de ordenao (Anlise de Componentes Principais PCA (Figura 2). Dessa forma, as tcnicas de DGGE e ARISA foram capazes de detectar alteraes nas estruturas de comunidades microbianas de solos sob sistema agrcola tradicional e pastagem em c o m p a ra o o r g a n i z a o d a s populaes microbianas de reas sob formao florestal original na regio do Alto Solimes, em que se desconhece a ocorrncia de desmatamento.

Figura 2 - Anlise de Componentes Principais (PCA) feita com a plataforma de software BioNumerics (Applied Maths).

(a)

LINGUETA

(b)

(c)

Floresta primria

Sistema agrcola tradicional

Pastagem

Floresta secundria

A ordenao considerou a presena e a ausncia de amplicons rDNA de Archaea (A), Fungi (B) e Bacteria (C) separados em gis de DGGE (Projeto BioBrasil).

Eliana Gertrudes de Macedo Lemos professora da Faculdade de Cincias Agrrias e Veterinrias - UNESP - Jaboticabal e bolsista de produtividade do CNPq. | egerle@fcav.unesp.br | Elisngela Soares Gomes professora da Faculdade de Cincias Agrrias e Veterinrias - UNESP - Jaboticabal e bolsista de produtividade do CNPq. | trinkabio2005@yahoo.com.br | Siu Mui Tsai professora do CENA/USP e bolsista de produtividade do CNPq. | tsai@cena.usp.br | Ftima Maria de Souza Moreira professora da UFLA e bolsista de produtividade do CNPq. | fmoreira@ufla.br | Accio A. Navarrete mestrando do Programa de Ps-Graduao no CENA/USP. | navarrete@cena.usp.br