Aplicaciones de los Anticuerpos Monoclonales La base de la utilidad de los Ac monoclonales como herramientas inmunoqumicas se debe a que presentan las

siguientes caractersticas: a. Especificidad de unin b. Homogeneidad c. Capacidad para ser producidos en cantidades ilimitadas Un Ac monoclonal se puede considerar como un reactivo qumico bien definido que puede reproducirse a voluntad en contraste con un antisuero convencional, que es una mezcla variable de especies qumicas y nunca se puede reproducir cuando se agota el material original. Los Ac monoclonales han ido sustituyendo los antisueros convencionales en ciertos mtodos (radioinmunoensayo) y muchas empresas los estn comercializando. La ventaja ms importante de la tcnica de hibridomas es que se pueden hacer Ac monoclonales contra molculas no purificadas que constituyen un componente menor de una mezcla compleja. Esta ventaja deriva del hecho que se pueden seleccionar clones* de hibridomas individuales que produzcan un Ac en particular en una gran mezcla de clulas hbridas diferentes que producen una variedad de Ac diferentes. Los Ac monoclonales son una valuable herramienta de investigacin, p.e. un Ac monoclonal que interacta con una protena puede usarse para marcar y as localizar esta protena en una clula especfica de un rgano o dentro de la clula en un compartimiento subcelular especfico. Una vez identificadas an las protenas pueden ser aisladas por columnas de afinidad a las que se unen los Ac monoclonales. Son tambin importantes en la clnica, en el diagnstico y la teraputica ya que por ejemplo se unen e inactivan protenas txicas (toxinas) secretadas por bacterias patgenas. Se est trabajando en la posible utilizacin de Ac monoclonales en la terapia directa, por ejemplo la inmunizacin pasiva (inyeccin de un Ac al paciente, a diferencia de la inmunizacin activa en que un Ag estimula la respuesta de Ac en el propio paciente). En terapia tumoral existen dos posibilidades de uso para los Ac monoclonales: 1. Relacionado con el mecanismo de drogas txicas: los Ac contra los tejidos de un rgano particular o contra Ag especficos del tumor podran unirse a las molculas de la droga para reforzar la accin de esta. 2. Podran fabricarse Ac anti-tumor que lo localizaran por s mismos y atacaran a las clulas malignas. Sin embargo, la preparacin de Ac monoclonales es ms costosa y consume ms tiempo que la obtencin de Ac policlonales, y no son siempre la mejor eleccin para ciertas tcnicas inmunoqumicas; entonces antes de decidir la preparacin de un hibridoma se debe evaluar la conveniencia de la utilizacin de monoclonales o policlonales.

El empleo de Ac monoclonales en la terapia mdica a fin de neutralizar infecciones virales, bacterianas, drogas y/o toxinas, requiere de la obtencin de Ac monoclonales humanos, puesto que los Ac monoclonales producidos en ratn inducen rechazo inmune. En consecuencia, es necesario generar hibridomas humanos que produzcan Ac monoclonales humanos. Para ello se requieren Lym B humanos sensibilizados. La imposibilidad de obtencin de Lym B humanos sensibilizados por inmunizacin, ha conducido al empleo de Lym B de sangre perifrica de pacientes con cncer (que producen Ac contra determinantes antignicos del tumor), o bien a la utilizacin de Lym B extrados del bazo mediante biopsia post-mrtem. Por otra parte, la produccin de Ac monoclonales humanos requiere tambin de la obtencin de mielomas humanos, que no produzcan Ac, sean capaces de crecer en forma aislada y continua, y deficientes en la enzima HGPRT. La dificultad de obtencin de dichos mielomas humanos ha conducido al empleo experimental de mielomas de ratn. Sin embargo, en la fusin Lym B humanos-mieloma de ratn, se observ la prdida selectiva de los cromosomas de la especie ms evolucionada, puesto que las clulas humanas se dividen ms lentamente. Actualmente, para la produccin de Ac monoclonales humanos, se est ensayando: a. La utilizacin de linfomas (linfocitos transformados neoplsicamente con el virus de EpsteinBarr, y por lo tanto capaces de crecer indefinidamente en cultivo*); b. La sensibilizacin de linfocitos humanos in vitro *Clon: colonia de clulas que derivan de un antecesor comn y son funcionalmente idnticas. *Un cultivo de clula es un mtodo mediante el cual se hacen crecer en medios lquidos clulas provenientes de organismos multicelulares. http://www.mancia.org/foro/biologia-anato-fisio/32704-aplicaciones-anticuerposmonoclonales.html Captulo 10. Los anticuerpos monoclonales Brevsima historia. En 1975 Georges Khler y el investigador argentino Csar Milstein fusionaron por primera vez linfocitos con clulas de un mieloma y obtuvieron un hibridoma: una lnea celular inmortal capaz de producir anticuerpos especficos (monoclonales). Por este trabajo, que no patentaron, recibieron el premio Nobel de Fisiologa y Medicina en 1984. La importancia de la produccin de anticuerpos monoclonales no se evidenci hasta 1987 cuando estos anticuerpos se produjeron en forma regular en ratones y fueron utilizados en el diagnstico ya que son anticuerpos de pureza excepcional capaces de reconocer y unirse a un antgeno especfico. Los anticuerpos monoclonales se utilizan de rutina en muchos procedimientos diagnsticos como por ejemplo: mediciones de niveles de protenas y drogas presentes en el suero

tipificacin de tejidos y de sangre

identificacin de agentes infecciosos

tipificacin de leucemias y linfomas

identificacin de antgenos tumorales

identificacin de clulas especficas involucradas en la respuesta inmune.

identificacin y cuantificacin de hormonas.

Cmo surgi la idea de obtener anticuerpos monoclonales? Qu mejor respuesta que recurrir a las palabras del Dr. Milstein1: Imaginemos una gran mezcla de sustancias qumicas entre las cuales nos interesa slo una de ellas. Una sustancia entre millones y millones. Es como una aguja en un pajar. Si tenemos un anticuerpo especfico contra una sustancia, ese anticuerpo puede funcionar como un imn capaz de ignorar la existencia del pajar y reconocer exclusivamente la aguja. A los ojos de un anticuerpo, el pajar no existe. Este simple concepto dio lugar a lo que se dio en llamar Inmunoensayos (ver captulo 9) que permitieron la medicin precisa de hormonas y otras muchas sustancias no slo en medicina sino en qumica analtica en general. Los inmunoensayos introdujeron los anticuerpos para su uso como herramienta analtica de importancia fundamental en reas que nada tenan que ver con la inmunologa. El problema era que para preparar un anticuerpo especfico era necesario utilizar agujas puras. Algo ms sobre los anticuerpos Vimos en el captulo 9 la estructura bsica de los anticuerpos, vamos a repasar y agregar aqu, una serie de conocimientos sobre esas molculas mgicas. Las inmunoglobulinas o anticuerpos o abreviados (Ab) son una mezcla heterognea de protenas que presentan dos tipos de variaciones estructurales. Cambios sutiles en la estructura de los sitios de combinacin al antgeno (regiones variables) que determinan la especificidad de unin al antgeno (reconocimiento de un antgeno entre varios parecidos) y diferencias estructurales fuera de la regin de unin al antgeno, en las llamadas regiones constantes que se relacionan con otras funciones del anticuerpo denominadas efectoras. Estas actividades efectoras son por ejemplo: activar al complemento o unirse a ms de un receptor conocido con el nombre de Fc que estn presentes en las membranas de los monocitos y granulocitos (ver captulo 7). Existen cinco clases de inmunoglobulinas que adems de las IgG incluyen a las IgA, IgD, IgE, e IgM. Cada clase de anticuerpos se distinguen entre s por

algunas de sus funciones efectoras y constitucin estructural. No vamos a complicar las explicaciones pero para dar una idea concreta diremos que el primer tipo de anticuerpos que aparece en una persona infectada con un virus es del tipo IgM y que recin pasado cierto tiempo aparecen las IgG que son ms duraderas. Como las molculas son estructuralmente diferentes se pueden distinguir fcilmente mediante procedimientos de rutina en el laboratorio clnico. Esta situacin es vital para el diagnstico clnico. Volviendo al virus de la rubola si una mujer embarazada tiene un contacto con un enfermo de rubola es importante averiguar si ya est protegida o no. Si se le detectan anticuerpos IgM se trata de una infeccin reciente y hay que preocuparse por el porvenir del beb ya que el virus de rubola es teratognico (puede producir malformaciones en el embrin). Si la mujer tiene anticuerpos IgG la infeccin fue anterior y no hay de qu preocuparse. Modo de obtencin de los anticuerpos monoclonales. Problemas que hubo que resolver: Pasaje de la heterogeneidad a la homogeneidad o del anticuerpo policlonal al anticuerpo monoclonal. Mientras algo de la heterogeneidad de los anticuerpos deriva de la existencia de clases y subclases de Ig lo ms importante radica en la naturaleza polimrfica de sus regiones variables. Se han hecho estimaciones del nmero de anticuerpos diferentes que pueden producir las clulas B del organismo y se llega al fantstico nmero de ms de 10 millones. En resumen: la respuesta del sistema inmune a cualquier antgeno por ms simple que sea ste, es una respuesta policlonal. Lo que quiere decir que el sistema fabrica anticuerpos contra un rango amplio de estructuras presentes en el antgeno que involucran tanto a la regin de unin al antgeno como a las zonas efectoras. Por otro lado, MacFarland Burnet (premio Nobel 1960) postul la teora clonal de la generacin de anticuerpos es decir la generacin de molculas idnticas en su estructura y en su capacidad de reconocer a un antgeno (qu alivio!, gracias a Dolly todos saben qu es un clon). Cada clula plasmtica B (clon B) fabrica un solo tipo de anticuerpo. Este hecho vino en ayuda de Milstein y Khler que pensaron que si aislaban clones de clulas B y las cultivaban en placas de plstico de cubetas mltiples, el anticuerpo que produciran las clulas sera monoclonal. Pero... haba un gran inconveniente, las clulas B mueren a los pocos das de ser cultivadas in-vitro. Entonces, se les ocurri que si las fusionaban con una clula con potencial de inmortalidad, los hbridos de ambas clulas podran fabricar anticuerpos monoclonales casi indefinidamente. Efectivamente fue as, obtuvieron hibridomas la clave para producir anticuerpos monoclonales. Fusin celular La fusin celular es un procedimiento que permite que dos clulas se fusionen entre s al poner en contacto sus membranas externas citoplasmticas. En el esquema que sigue se muestra el caso de la fusin celular mediada por un virus, pero tambin se puede producir la fusin por otros mtodos utilizando algunos reactivos qumicos. A los efectos de entender el procedimiento vale tanto un virus como una sustancia qumica. Como vemos hay dos clulas cuyos diferentes ADN nucleares se pintaron en amarillo y rojo para diferenciarlos. La fusin de las membranas permite la

obtencin de una clula con dos ncleos. Cuando se produce la mitosis algunas de las clulas hijas van a heredar los cromosomas de ambos padres, estos son los hibridomas.

Clulas de mieloma. Una clula B, como cualquier clula del organismo, puede convertirse en cancerosa, cuando esto ocurre la proliferacin de un cultivo de estas clulas in-vitro se mantiene por perodos prolongados, casi para siempre, a menos que alguna razn accidental lo impida. Khler y Milstein para salvar el escollo de la vida efmera de las clulas B en cultivo tuvieron la idea de fusionarlas con clulas de un mieloma. De este modo combinaron el potencial de crecimiento ilimitado con la especificidad de un anticuerpo producido por clulas normales B presentes en el bazo de un ratn inmunizado. Esta tcnica se conoce con el nombre de hibridizacin de clulas somticas que da lugar a un hibridoma. El procedimiento se detalla en el dibujo siguiente. Se inmuniza un ratn con un antgeno, al cabo de un tiempo se sacrifica, se extrae el bazo, se separan las clulas y se cultivan in-vitro en placas de plstico u otro material apropiado (circulitos rojos). Se dispone de un cultivo de clulas de un mieloma (circulitos azules) y se procede a fusionar ambos cultivos.

Anticuerpos monoclonales Ahora hay que seleccionar los clones que sean hibridomas (1) y esto no es tan simple como hacer pur de papas. Las clulas de mieloma que eligieron los investigadores perdieron la capacidad para sintetizar la enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferasa. (HGPRT). Por eso son HGPRT- (negativas para HGPRT) (ver dibujo) y a raz de ello se cultivan en un medio especial llamado HAT ( contiene hipoxantina/ aminopterina/ timidina) porque la enzima de la que carecen las clulas sintetiza purinas utilizando como fuente precursora a la hipoxantina. La ausencia de la enzima no perjudica el crecimiento de estas clulas de mieloma ya que en ausencia de la enzima utilizan un camino metablico alternativo para sintetizar purinas. Sin embargo, la presencia de aminopterina en el medio HAT anula la posibilidad de sobrevida y hay una total dependencia del compuesto (HGPRT). Qu va a ocurrir despus de la fusin y cultivo en medio carente de HGPRT? Las clulas de mieloma no fusionadas no pueden crecer porque carecen de la enzima HGPRT, las clulas provenientes del bazo no pueden multiplicar porque tienen una vida corta en cultivo. Slo van a persistir los hibridomas porque tienen la enzima HGPRT heredada de las clulas del bazo y las de mieloma aportan la inmortalidad. En el paso 2 se prueban los sobrenadantes por la presencia de los anticuerpos deseados. Debido a que los cultivos iniciales de hibridomas se pudieron haber iniciado con ms de un clon es necesario clonar nuevamente los cultivos productores de anticuerpos y subcultivarlos (paso 3). En el paso (4) se testean los cultivos por la presencia de anticuerpos y dado que las clulas productoras constituyen un clon los anticuerpos son monoclonales lo que significa que cada cultivo secreta una sola clase de molcula de anticuerpo dirigida a un solo determinante antgnico de un antgeno preseleccionado. A continuacin (paso 5) se realiza un escalamiento (cultivo mayor) de los hibridomas, que cultivados apropiadamente, se mantendrn para siempre ya sea in-vitro con un rendimiento de 10-60 mg/ml o in-vivo en un ratn en el que la

concentracin de anticuerpo en el suero puede alcanzar valores de 1-10 mg /ml. Sin embargo, hay que tener en cuenta que hay un movimiento mundial tendiente a no utilizar animales en investigacin que combate activamente el uso de ratones. Tecnologa de la produccin de anticuerpos monoclonales (AbM) y aplicaciones. Como vimos el primer paso para producir AbM es inmunizar a un ratn con un antgeno. Cuando el ratn comienza a producir anticuerpos contra el antgeno se le remueve el bazo. Luego se fusionan las clulas del bazo con clulas de una lnea de mieloma que no sea productora de anticuerpos y que se mantenga en cultivo. La nueva lnea celular proveniente de la fusin que s produce anticuerpos se inyecta en el peritoneo de otro ratn y el fluido asctico que contiene los anticuerpos se cosecha. Entre los factores que afectan la pureza del antgeno se encuentran la edad, el sexo del ratn y la tolerancia inmunolgica de cada animal y otros factores que afectan la produccin, por eso se estila utilizar adyuvantes para estimular la respuesta inflamatoria. Test de ELISA y aplicaciones. Este ensayo biolgico descripto en el captulo 9 fue desarrollado por Engvall y Perlman en 1971. En este ensayo con anticuerpos monoclonales stos se pegan a la superficie de la placa plstica. La presencia de este anticuerpo se detecta mediante el uso de un anticuerpo policlonal unido a un producto coloreado, si el test es positivo para el monoclonal aparece el color. Los usos comerciales de estos ELISA son de gran demanda as por ejemplo: el test o prueba de embarazo consiste en un anticuerpo monoclonal preparado contra una protena presente en la orina de mujeres embarazadas. A esto podemos agregar tests para diabetes, para la presencia de antibiticos residuales en la leche y otros. Otras aplicaciones, no tan universales como las que se han descripto, es utilizar los anticuerpos monoclonales como proyectiles dirigidos a los receptores de la membrana de las clulas cancergenos, asociados a sustancias radiactivas para matar las clulas. Nos queda recorrer un solo tema, la humanizacin de los anticuerpos monoclonales, como estos anticuerpos se producen en el ratn puede que administrados al hombre con fines teraputicos, su organismo los rechace, para eso se ha aplicado ingeniera gentica y se han unido regiones de los genes que codifican por la protena de mieloma humano con regiones de un anticuerpo de ratn. Pero la explicacin detallada de estas tcnicas no las consideraremos aqu. La tecnologa del ADN amerita la escritura de nuevos captulos. Glosario. adjuvante: una sustancia que ayuda a aumentar la respuesta antignica produciendo una inflamacin que retiene al antgeno en el sitio de inoculacin

fluido asctico: lquido de caractersticas similares al suero que se acumula por extravasacin en la cavidad peritoneal del abdomen. hipoxantina: derivado natural de una purina raramente se la puede encontrar formando parte de la cadena de ADN.

mieloma: tumor de clulas B que se origina en la mdula sea. purina: compuestos orgnicos aromticos heterocclicos que forman los cidos nucleicos. En el ADN existen dos bases purnicas que son la adenina y la guanina. secretar: segregar. 1. Csar Milstein. Los anticuerpos monoclonales. La curiosidad como fuente de riqueza. Conferencia dictada en la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 15 de diciembre de 1999. http:// www.educ.ar * Este curso es una contribucin de Qumica Viva educativa (e-Lab) a la propagacin del conocimiento cientfico entre los estudiantes de la escuela secundaria. Departamento de Qumica Biolgica. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/contratapa/aprendiendo/capitulo10.htm Copyright 1995. Depsito legal pp. 76-0010 ISSN 0378-1844. INTERCIENCIA 20(4): 194-203 Forma correcta de citar este articulo: RAMON F. MONTAO y EGIDIO L. ROMANO. 1995. ANTICUERPOS MONOCLONALES Y SU APLICACION EN HEMATOLOGIA.. INTERCIENCIA 20(4): 194203. URL: http://www.interciencia.org.ve ANTICUERPOS MONOCLONALES Y SU APLICACION EN HEMATOLOGIA. RAMON F. MONTAO y EGIDIO L. ROMANO. Ramn Montao, bilogo venezolano con postgrado en Inmunologa. Profesional de Investigacin del IVIC, en el Centro de Medicina Experimental. Actualmente finaliza estudios a nivel de Doctorado en Inmunologa en el IVIC y su ms reciente rea de trabajo ha sido el desarrollo, la produccin y caracterizacin de anticuerpos monoclonales humanos. Direccin: Centro de Medicina Experimental, IVIC, Apartado 21827, Caracas 1020-A, Venezuela. Egidio Romano: Mdico venezolano con postgrado en Bioqumica e Inmunologa. Investigador Titular del IVIC, en el Centro de Medicina Experimental Sus campos principales de trabajo son la Inmunohematologa y la Inmunoqumica aplicadas fundamentalmente a enfermedades de la sangre. Direccin: Laboratorio de Fisiopatologa, Centro de Medicina Experimental, IVIC, Apartado 21827, Caracas 1020-A. RESUMEN Desde su descubrimiento hacia finales del siglo pasado, los anticuerpos han sido considerados molculas con una enorme potencialidad analtica debido a su exquisita especificidad. Pero fue solo despus de la introduccin por Khler y Milstein en 1975 de la tcnica para producir in vitro anticuerpos con una especificidad predeterminada, que estos reactivos pusieron de manifiesto su tremenda versatilidad prctica. La posibilidad de producirlos en grandes cantidades y en forma pura y adems el estar bien caracterizados qumicamente ha permitido que los anticuerpos monoclonales (as se llama al producto obtenido de la aplicacin de la mencionada tcnica) sean objeto de mltiples aplicaciones. Las ms tempranas, afines de los aos setenta y principios de los ochenta, se relacionaron con pruebas de histocompalibilidad y reconocimiento de molculas de

diferenciacin en clulas normales o tumorales y con el reconocimiento de eptopos especficos en virus, bacterias y otros microorganismos, o en molculas individuales de protenas, carbohidratos, cidos nucleicos, etc. Ello redund en un conocimiento ms detallado de distintas subpoblaciones celulares, de los diferentes estadios de diferenciacin celular en diversos tejidos, en un mejor tipeaje celular, en una mejor identificacin de microorganismos y de sus variedades tanto para diagnstico como para epidemiologa y en una gran cantidad de pruebas diagnsticas tipo ELISA y radioinmunoensayo. En su versin original la tcnica descrita por Khler y Milstein permite la produccin de anticuerpos monoclonales de origen mrido, los cuales han sido y son actualmente de gran utilidad dentro del campo de la hematologa y medicina en general. Desgraciadamente, su uso en aplicaciones teraputicas y en el diagnstico in vivo de enfermedades humanas se ha visto limitado. La presencia de anticuerpos "naturales" anti-inmunoglobulina de ratn y la aparicin de una respuesta inmune humoral secundaria a la administracin de estos reactivos en el ser humano parecen ser los principales responsables de esta limitacin. Lo anterior se ha constituido en la motivacin fundamental que ha impulsado el desarrollo de tcnicas para la produccin de anticuerpos monoclonales de origen humano, con la fundada esperanza de que stos, al ser administrados en protocolos de profilaxia, terapia o en aplicaciones diagnsticas, sean mucho menos inmunognicos que los de ratn . El alcance potencial de utilizacin de los anticuerpos monoclonales es tremendamente amplio e incluye campos como el tratamiento del cncer, facilitamiento de transplantes de rganos, imagenologa de tumores, entre otros. Desafortunadamente, la aplicacin de esquemas anlogos a los utilizados en el modelo del ratn para la generacin de anticuerpos monoclonales humanos no ha rendido los frutos anticipados; un sinnmero de dificultades tcnicas han tenido que ser enfrentadas y la literatura en el rea est llena de diferentes mtodos de produccin y de "mejoras" a los procedimientos. De forma general, dos caminos principales se utilizan actualmente para la produccin de anticuerpos monoclonales humanos. Uno es la inmortalizacin de las clulas productoras de anticuerpos, lo cual se logra mediante la transformacin con el virus de Epstein-Barr y/o la generacin de hibridomas y, ms recientemente, por medio del uso de tcnicas A Ingeniera Gentica, las cuales se han revelado como una herramienta tremendamente poderosa y promisoria para la preparacin, modificacin y mejoramiento de los anticuerpos monoclonales, tanto de origen mrido como humano. Estas dos aproximaciones, independientemente o en forma combinada, son utilizadas en numerosos laboratorios en el mundo para producir reactivos monoclonales humanos que eventualmente puedan ayudar de manera efectiva a la prevencin, el tratamiento y diagnstico de las enfermedades humanas. / PALABRAS CLAVE /Anticuerpos monoclonales/ hematologa / El trabajo pionero de Landsteiner a principios de siglo, que desemboc en el descubrimiento de los grupos sanguneos y fue la base de lo que hoy conocemos como "Bancos de Sangre", ilustr el potencial de los anticuerpos como herramientas analticas. Pero fue solamente hacia la mitad de este siglo que estas molculas comenzaron a ser utilizadas eficientemente para la identificacin de subpoblaciones celulares. Esta aplicacin analtica de los anticuerpos, es decir, el poder distinguir poblaciones de clulas funcionalmente distintas pero morfolgicamente similares, de tanta importancia en hematologa, experiment un avance sustancial con el advenimiento de la metodologa que permiti el cultivo continuo, en condiciones de laboratorio, de las clulas productoras de los anticuerpos. La clula responsable de la produccin de los anticuerpos es un tipo particular de glbulo blanco denominado "linfocito B". Un principio esencial en inmunologa es que cada linfocito B es capaz de producir anticuerpos con una especificidad nica (Burnet 19591 As mismo, toda la descendencia

de ese linfocito B, es decir el "clon" que de l se derive, tambin producir exactamente el mismo anticuerpo. Por lo tanto, para producir anticuerpos idnticos unos a otros, "monoclonales", todo lo que hace falta es poder cultivar en forma continua, en condiciones de laboratorio, un clon de linfocitos B. En el sobrenadante de esos cultivos, se tendrn secretados los anticuerpos monoclonales deseados. Desgraciadamente, dada su naturaleza "mortal", los linfocitos B son incapaces de crecer en cultivo ms all de una semana. De esta manera, el obstculo fundamental para producir anticuerpos en el laboratorio reside en lograr cultivar en forma continua los linfocitos B. A principios de los aos setenta ya se dispona de la capacidad tcnica para el cultivo in vitro de ciertas clulas malignas, entre ellas los linfocitos B provenientes de un tipo de tumor llamado mieloma mltiple o plasmacitoma. Estas clulas tienen la capacidad de crecer continua y cionognicamente, es decir, de forma que una sola clula puede multiplicarse y originar muchas otras idnticas. En 1975, George Khler y Csar Milstein, en un trabajo seminal que les vali posteriormente el Premio Nobel, demostraron que es posible fusionar o hibridar clulas de mieloma con linfocitos B, que los hbridos resultantes heredan la capacidad para crecer indefinidamente en cultivo y para producir anticuerpos, y que adems es posible aislar del producto heterogneo de fusin. aquellos hbridos productores del anticuerpo en el que se est interesado (Khler y Milstein, 1975). En su forma inicial, la tcnica descrita por Khler y Milstein permite la obtencin de anticuerpos monoclonales de ratn. Mediante el uso de tcnicas similares se han preparado reactivos monoclonales provenientes de otras especies e incluso de origen humano (James y Bell, 1987; Glassy, 1993). La presente revisin pretende desarrollar, en una forma accesible al lector no especialista, los aspectos ms resaltantes de estas metodologas, haciendo nfasis en las tremendas posibilidades prcticas de estos reactivos y en los avances recientes para su produccin. El proceso de produccin de un anticuerpo monoclonal implica entonces la generacin de los hbridos o, ms apropiadamente, de los hibridomas productores del mismo y ello involucra una serie de pasos o etapas esenciales, las cuales se describen a continuacin. Produccin de Anticuerpos Monoclonales de origen Mrido Inmunizacin En teora, es factible producir anticuerpos monoclonales especficos para cualquier antgeno capaz de ser reconocido por los linfocitos B. Para la inmunizacin es conveniente el uso de preparaciones puras de antgeno en las cuales el peligro de competencia antignica, que pudiese desviar la respuesta inmune humoral hacia una molcula irrelevante, no existe. Pero en muchos casos el antgeno de inters se encuentra en una molcula de la superficie celular difcil de aislar, lo que obliga a la utilizacin de clulas Completas o extractos de membranas para la inmunizacin (Goding, 1980). En otros casos, por ejemplo cuando se trata de drogas o molculas pequeas, stas deben ser conjugadas a portadores, y son estos conjugados las preparaciones usadas para la inmunizacin (Hudson y Hay, 1989). A menos que se trate de molculas poco inmunognicas, la inmunizacin se realiza rutinariamente mediante la inyeccin M antgeno por va subcutnea o intraperitoneal y en la forma de una emulsin. Ello permite la liberacin lenta y constante del antgeno, asegurando una estimulacin

permanente. Esta inmunizacin se efecta en mltiples ocasiones, normalmente en intervalos de dos semanas, para asegurar una buena estimulacin y amplificacin de los clones de linfocitos B especficos para el antgeno de inters (Harlow y Lane, 1988). La ltima estimulacin usualmente se hace tres das antes de la fusin y por va intravenosa para as obtener, en el bazo del animal inmunizado, una mxima respuesta y una poblacin de clulas respondientes en fase de divisin. Fusin Luego de culminado el protocolo de inmunizacin y que se tiene la certeza de que el mismo ha sido efectivo, el animal experimental es sacrificado y se le extrae el bazo. Los linfocitos B, bien como parte del total de la suspensin de clulas esplnicas o previamente purificados, se mezclan con un nmero apropiado de clulas de mieloma que se mantienen creciendo exponencialmente in vitro. Lo que sigue a continuacin es el proceso de fusin en s, el cual debe realizarse a 37 y consiste en aadir a la mezcla de clulas un pequeo volumen de un agente fusgeno denominado polietilenglicol (PEG), mezclando suavemente por espacio de uno a tres minutos. En estas condiciones, las membranas de algunas de las clulas se fusionan, unindose los citoplasmas y formndose los hibridomas. El PEG luego se elimina por lavado y las clulas fusionadas se siembran en microplacas de cultivo (Yokoyama, 1992). El proceso de fusin es muy ineficiente: en general, menos del 1% de las clulas terminan fusionndose (Johnstone y Thorpe, 1987; Harlow y Lane, 1988). Esto trae como consecuencia que se requiera de un nmero de clulas relativamente alto para el proceso de fusin (un bazo de ratn contiene del orden de 101 clulas). En algunas circunstancias es posible enriquecer la poblacin de linfocitos B especficos para el antgeno, lo cual se logra asociando el antgeno a una fase slida y utilizando procedimientos de aislamiento como separacin inmunomagntica (Ossendorp et al., 1989 Lundkvist et al., 1993) o roseteo con glbulos rojos recubiertos con el antgeno de inters (Myers et al., 1986). De tenerse el equipo necesario, en los casos en los que se dispone de pocas clulas, es preferible realizar la fusin mediante el proceso denominado electrofusin, el cual resulta mucho ms eficiente (Foung, 1990). Seleccin Dado que la fusin es un evento completamente al azar, la mezcla de clulas obtenidas luego de la misma estar formada por esplenocitos, clulas de mieloma, esplenocitos fusionados entre s, clulas de mieloma fusionadas entre s y adems por los hibridomas linfocito B-clula de mieloma. En cultivo, los esplenocitos no fusionados mueren con el tiempo por ser clulas normales. Sin embargo, las mielomatosas al ser clulas tumorales pueden vivir indefinidamente y como se replican con mayor rapidez que los hibridomas, creceran en forma predominante, "ahogando" al resto de las clulas. De lo anterior se desprende la necesidad de disponer de un mecanismo de seleccin que permita solamente el crecimiento de los hibridomas, eliminando a las clulas mielomatosas. Esto se obtiene con el llamado medio HAT y el fundamento en que se basa es el siguiente: Las clulas eucariotas disponen de dos vas para la sntesis del ADN. Una es la llamada "va principal o de novo" y la otra es la "va de rescate", en la cual se requiere la enzima hipoxantina-guaninafosforibosil-transferasa (HGPRT) (Harlow y Lane, 1988). La clave de la seleccin est en que las clulas de mieloma que se utilizan para la fusin son deficientes en la enzima HGPRT, es decir, que sintetizan su ADN nicamente por la va principal. Esta va principal puede ser bloqueada por la

adicin de la droga aminopterina (Hudson y Hay, 1989). De manera que, si al medio de cultivo en el que crece el producto de fusin se aade aminopterina, las clulas mielomatosas no fusionadas o fusionadas entre s morirn, ya que sern incapaces de sintetizar ADN. Si consideramos ahora las clulas hbridas, stas tienen la capacidad de crecimiento tumoral heredada de las clulas mielomatosas, pero tambin tienen el gen que codifica la enzima HGPRT, heredado de los linfocitos normales, pudiendo sintetizar ADN por la va de rescate. De esta forma, en presencia de Hipoxantina-Aminopterina-Timidina (HAT) las nicas clulas con capacidad de crecimiento, "seleccionadas" gracias a un fenmeno de complementacin gnica, son las hbridas. Existe an otro evento de seleccin, el cual est destinado a identificar y aislar, del total de hbridos producidos, a los hibridomas productores de los anticuerpos de inters. La identificacin se logra con un mtodo apropiado para la evaluacin de los sobrenadantes de cultivo y el aislamiento se realiza mediante el clonamiento. Evaluacin de los sobrenadantes de cultivo Luego de unos siete a diez das post-fusin, en cada pozo de cultivo habr varios hbridos creciendo, cada uno produciendo un anticuerpo distinto y ser necesario aislarlos para obtener anticuerpos de una sola especificidad. Para determinar en cules cultivos se encuentran los anticuerpos con la especificidad deseada, y por ende las clulas productoras de los mismos, se realizan ensayos de evaluacin o "screening" en los sobrenadantes de cultivo. La forma que toman estos ensayos de identificacin es variada y depende en buena medida del antgeno emulado. Las ms usadas son pruebas tipo ELISA, "dot-blot" o radioinmunoensayo cuando se trata de antgenos solubles, y pruebas de inmunofluorescencia, inmunohistoqumica o de aglutinacin si el antgeno est asociado a la membrana celular. En todo caso, embarcarse en la tarea de producir anticuerpos monoclonales de una especificidad dada sin antes tener un procedimiento de prueba o screening para dicho anticuerpo que sea rpido, sencillo, especfico, sensible y aplicable a un nmero elevado de muestras, es una tarea destinada al fracaso. Clonamiento Para obtener una preparacin monoclonal de anticuerpos, es necesario aislar clones de clulas, en los que cada una es rplica exacta de la otra. El procedimiento mediante el cual se obtienen muchas clulas idnticas por replicacin a partir de una sola se denomina clonamiento. El mtodo ms comn consiste en sembrar suspensiones celulares a gran dilucin de manera que en un volumen dado pueda haber en promedio de ninguna a unas pocas clulas. Una dificultad de este mtodo llamado de dilucin al lmite (Harlow y Lane, 1988), es que las clulas no crecen bien cuando estn aisladas. La manera usual de resolver este problema es utilizar clulas nodrizas, generalmente fibroblastos o macrfagos, que proveen la ayuda necesaria para el crecimiento a baja densidad (James y Bell, 1987). Otro procedimiento menos empleado para el aislamiento de los hibridomas es la siembra en medios semislidos de cultivo, la posterior toma de las colonias y su siembra en medio lquido (Freshney, 1987). Escalamiento de la produccin de anticuerpos monoclonales Una vez que se han superado todos los inconvenientes y se ha logrado obtener el hibridoma productor del anticuerpo deseado, el prximo paso es su cultivo a escala para obtener el anticuerpo en las cantidades deseadas. La produccin a mediana escala de los anticuerpos se

puede efectuar inoculando el hibridoma correspondiente en la cavidad peritoneal de ratones singnicos a la lnea de mieloma utilizada para la fusin y hacindolo crecer como un tumor mielomatoso, obtenindose el anticuerpo en forma de lquido asctico (Gavilondo, 1990). A ora escala de produccin, el cultivo se puede hacer en botellas rotatorias, en fibras huecas o en fermentadores especiales diseados para tal fin (Freshney, 1987; Corrigan, 1988; Lubiniecki, 1990). Para aplicaciones clnicas el anticuerpo debe estar caracterizado tanto qumica como funcionalmente y con un alto grado de pureza (Sullman, 1989; Lucas, 1989; Ronneberger, 1989). Otro aspecto de importancia para la produccin es et almacenaje de los hibridomas. Esto se logra mediante congelamiento en tanques especiales de nitrgeno lquido, en los cuales las clulas son congeladas cuando se encuentran creciendo en fase exponencial y con un alto ponerle de viabilidad. (Daggett y Simione, 1987). Resumen del Proceso de Produccin de un Anticuerpo Monoclonal Mrido En la figura 1 se esquematizan los pasos necesarios para el desarrollo de hibridomas productores de anticuerpos monoclonales de ratn.

FIGURA 1. PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCION DE ANTICUERPOS MONOCLONALES DE RATON. TOMADO DE MILSTEIN (1980) Aplicaciones de los Anticuerpos Monoclonales de origen Mrido Generalidades Debido a que los anticuerpos monoclonales son reactivos qumicamente bien definidos, susceptibles de ser producidos en forma pura y en grandes cantidades, su uso potencial es muy extenso. Las aplicaciones ms tempranas, a fines de los aos setenta y principios de los ochenta, se relacionaron con pruebas de histocompatibilidad y reconocimiento de molculas de diferenciacin en clulas normales o tumorales, con el reconocimiento de eptopos especficos en virus, bacterias y otros microorganismos, o en molculas individuales de protenas, carbohidratos, cidos nucleicos, etc. Esto redund en un conocimiento ms detallado de distintas subpoblaciones celulares, de los diferentes estadios de diferenciacin celular en diversos tejidos, en una mejor tipificacin celular, en una mejor identificacin de microorganismos y de sus variedades tanto para diagnstico como para epidemiologa y en una gran cantidad de pruebas diagnsticas tipo radioinmunoensayo y ELISA. En esta revisin slo se detallarn algunas aplicaciones en el campo de la hematologa y de ndole general en medicina. Anticuerpos monoclonales como reactivos de identificacin eritrocitaria Desde principios de siglo se han utilizado sueros tipificadores para el sistema sanguneo ABO que contienen una mezcla policlonal de anticuerpos especficos para los antgenos A y B. A principios de los aos ochenta, tanto en Inglaterra como en Canad, se produjeron anticuerpos monoclonales Igm-Anti-A y Anti-B con las caractersticas adecuadas para ser buenos reactivos de identificacin eritrocitaria (Voak et al., 19821 Su posterior produccin en escala industrial con la

consiguiente disminucin en los costos ha hecho que hoy en da sean de uso casi universal (Rouger y Anstee, 1918). En aos ms recientes, tambin se 'han producido -reactivos monoclonales que reconocen los grupos sanguneos A1, A2, H, Le(a) y Le(b),P y P1, M, N, Kell y Lutheran (Hughes-Jones y Parsons, 1992). Curiosamente, para el sistema Rh no se ha logrado obtener hasta el presente anticuerpos monoclonales mridos. Por razones desconocidas, ratones y ratas no reconocen adecuadamente las distintas especificidades dentro de este sistema. No obstante, s se dispone de reactivos monoclonales Anti-Rh de origen humano, aspecto ste sobre el cual volveremos ms adelante. Reactivos para la prueba de Coomhs o anti-globulina Reactivos monoclonales especficos para el fragmento Fc de la IgG humana (anti-IgG), bien sea solos o en mezcla con monoclonales anti-complemento (anti-C3d y anti-C3c), tambin han sido producidos y son de uso extendido por ser ms econmicos que los reactivos policlonales, aunque no necesariamente de mejor calidad (Engelfriet y Voak, 1987). Reactivos para tipificacin de histocompatibilidad Reactivos monoclonales especficos para formas allicas del complejo principal de histocompatibilidad humano HLA Clase I y Clase II se encuentran comercialmente disponibles y han reemplazado en muchos casos a sueros policlonales y a clulas homocigotas (Pistillo et al., 1988). No obstante, es bueno sealar que ms recientemente la tipificacin HLA-Clase II ha evolucionado hacia el uso de sondas de ADN y amplificacin por reaccin en cadena de polimerasa (PCR) (Oka et al., 1994; Versluis et al., 1994). Inmunofenotipificacin Anticuerpos monoclonales contra molculas de la superficie de clulas de numerosos tejidos han sido preparados. Muchas de estas molculas de superficie son utilizadas como marcadores especficos, bien sea de la naturaleza de la clula o del estado de diferenciacin en el que se encuentra. Corno ejemplo citaremos anticuerpos monoclonales especficos para un complejo molecular llamado CD3 que se encuentra en todos los linfocitos T pero no en los linfocitos B, contra las molculas CD4 y CD8 que son marcadores especficos para linfocitos T cooperadores y T citotxicos respectivamente y contra la molcula llamada CD34, presente en clulas pluripotenciales hematopoyticas (Horejsi, 1991; LDAD, 1993). Mediante el uso de anticuerpos monoclonales tambin se han podido identificar molculas asociadas a ciertos tumores, por ejemplo variantes mutantes del oncogen P53 en tumores del tracto gastrointestinal (Odgen et al., 1994) y de la mama (Jacquemier et al., 1994) y algunos carbohidratos asociados a tumores linfohematopoyticos (de Vries y van den Eijnden, 1992; Sell, 1993). La identificacin de estos marcadores en biopsias y en aspirados de tejidos tumorales, secreciones, etc., permite la tipificacin del tumor. Muchas veces esto es de gran inters porque no slo ayuda al diagnstico sino que tambin la presencia o no de ciertas molculas de diferenciacin puede estar asociada a un mejor o peor pronstico (Geisler et al., 1991; PorterJordan y Lippman, 1994). Usualmente la identificacin se realiza empleando los anticuerpos monoclonales especficos, seguido de anticuerpos anti-ratn conjugados a fluorescena y usando

luego microscopa de fluorescencia o ms modernamente con los aparatos llamados citofluormetros (Drouet y Lees, 1993; Macey, 1993). Algunos ejemplos recientes de este tipo de aplicaciones se esbozan a continuacin. Inmunofenotipijicacin de leucemias Anticuerpos monoclonales son utilizados para la caracterizacin del fenotipo del blasto leucmico (De Waele et al., 1991; Traweek, 1993). Algunos de los marcadores ms utilizados son: CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD 11, CD13, CD14, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD30, CD33, CD34, CD45, CALLA, la enzima TdT, inmunoglobulinas de superficie, RABI, diversos eptopos del TCR, FcR, CR1, y en general, los marcadores relacionados a clulas primitivas indiferenciadas, linfoblastos, blastos relacionados a linfocitos T y linfocitos B, clulas mielomatosas, blastos relacionados a la serie granuloctica, blastos relacionados a monocitos, blastos indiferenciados de tipo mielomonocticos, etc. La caracterizacin por la presencia o no de determinados marcadores, como se dijo antes no slo permite un diagnstico ms preciso del tipo de malignidad sino que tambin ayuda a establecer parmetros pronsticos (Mirro 1992) Adicionalmente, puede obtenerse informacin acerca del grado de eficacia de un tratamiento determinado y del grado de enfermedad residual mediante la estimacin del porcentaje de blastos leucmicos remanentes (De Rossi et al., 1993). Estudios similares a los anteriores tambin se efectan en el caso de linfomas (Perkins y Kjeldsberg, 1993). Diagnstico e Inmunotipificacin de Cncer La deteccin de cncer es quizs una de las aplicaciones ms importantes y de mayor potencial de los anticuerpos monoclonales. Estos pueden ser usados in Ovo para la localizacin de tumores o de sus metstasis cuando se dispone de reactivos especficos para antgenos presentes en la membrana de la clula tumoral (Goldenberg y Schlom, 1993), o in vitro utilizndolos en ensayos tipo ELISA para la deteccin, en muestras de suero u otros fluidos biolgicos, de molculas como la gonadotropina corinica (Yoshimura et al., 1994), la alfafetoprotena (Sell, 1993) o el antgeno prosttico especfico (Sell, 1993; Ploch y Brawer, 19941 En el caso de antgenos asociados a membrana, los anticuerpos monoclonales son conjugados a elementos trazadores radioactivos tales como radioistopos del indio, tecnecio, iodo o bismuto, son administrados en el paciente y luego se procede a tomar gammagrafas permitiendo la localizacin y adems dando una idea de la masa tumoral. El campo de esta aplicacin incluye multitud de tumores entre los cuales se destacan: el de la mama, el uterino, el ovrico, el del colon, el del recto, el prosttico, el del pulmn, el del hgado, y muchos otros ms (Goldenberg y Schlom, 1993). Diagnstico de trombosis Una aplicacin potencial parecida a la anterior es la del diagnstico de trombosis usando anticuerpos monoclonales con especificidad por molculas asociadas al proceso de coagulacin, los cuales han sido previamente radiomarcados (Wu et al., 1992). Estos anticuerpos, mediante tcnicas de radioinmunoensayo e incluso ELISA, tambin permiten el diagnstico de procesos patolgicos como por ejemplo la coagulacin intravascular diseminada (Lill et al. 1993). Aplicaciones teraputicas

Para ser utilizado como tratamiento, un anticuerpo monoclonal debe combinarse directamente a un antgeno dado y causar la destruccin de la clula portadora de dicho antgeno o ser conjugado a un compuesto teraputico el cual es dirigido por el anticuerpo a un sitio especfico. En este segundo caso, el anticuerpo puede ser conjugado a una droga, un agente quimioteraputico, a un compuesto radioactivo, a una toxina, o ser asociado genticamente a una toxina, formando las as llamadas inmunotoxinas. Algunos ejemplos importantes de este grupo de aplicaciones son los conjugados de anticuerpos monoclonales con la cadena alta del ricino y con la toxina diftrica (LeMaistre et al., 1993; Li y Ramakrishnan, 1994) y la utilizacin de inmunoliposomas llenos con drogas como metotrexato y adriamicina (Jones y Hudson, 1993; Uyama et al., 1994). Este tipo de conjugados ha sido usado para dirigir la droga o la toxina al sitio propicio en pacientes con tumores de mama, de ovario, de pulmn, colorectal y melanomas, entre otros (Skolnick, 1993; Vitetta, 1994). Anticuerpos monoclonales especficos para linfocitos T, B, para linfocitos de leucemias linfoides crnicas de clulas T y de linfomas han sido y son evaluados actualmente para el tratamiento de estas enfermedades (Faguet y Agee, 1993; Grossbard y Nadler, 1994). Anticuerpos similares son usados en procedimientos in vitro para la eliminacin de clulas tumorales y de clulas Tcitotxicas. La eliminacin de stas ltimas se ha asociado con una menor frecuencia de reaccin injerto contra husped en casos de trasplantes de mdula sea (Champlin et al., 1990). El problema de la enfermedad injerto-contra husped es quizs la complicacin ms seria de los trasplantes de mdula sea. En este sentido, anticuerpos monoclonales especficos para el receptor, de la IL-2 han sido usados con xito en aquellos casos en los cuales la terapia con corticosteroides ha fallado (Sykes, 1993). Estas preparaciones tambin han sido empleadas con xito en algunos casos de anemia aplsica (Schinger et al., 1993). Otras aplicaciones En el campo de la industria farmacolgica los anticuerpos monoclonales tambin han sido de gran utilidad. Por ejemplo, empleando procedimientos de cromatografa de afinidad, estos reactivos se usan ampliamente en la purificacin de hormonas, citocinas y de otros productos biolgicos destacndose el interferon alfa, beta y gamma, los factores VIL VIII, IX y von Willebrandt de la coagulacin la uroquinasa, las interleucinas IL-2 e IL-3, la gonadotropina corinica y algunas betaglicoprotenas especficas del embarazo. As mismo, anticuerpos monoclonales dirigidos contra agentes patgenos tales como bacterias gram-negativo, Hemophilus influenza, virus de la hepatitis A y B, o contra productos bacterianos como el lipopolisacrido de la pared de bacterias gramnegativo y toxinas como la diftrica o tetnica pueden su usados en protocolos de inmunizacin pasiva (Ziegler et al, 1991; Lang et al., 1993; Gustafsson et al., 1993). Anticuerpos Monoclonales Humanos Generalidades como hemos podido apreciar, los anticuerpos monoclonales de origen mrido han sido y son actualmente de gran utilidad dentro del campo de la hematologa y medicina en general. Desgraciadamente, su uso en aplicaciones teraputicas y de diagnstico in vivo se ha visto limitado por una serie de obstculos. En primer lugar y como era de esperarse, la administracin de inmunoglobulinas (Igs) de ratn al humano induce una respuesta inmune en contar de estas protenas (la llamada respuesta HAMA: "Human Anti-Murine Antibodies") que limita por una parte

su eficacia y utilidad, y por la otra la posibilidad de incrementar la dosis y/o extender o repetir el tratamiento (Schroff et al., 1985; Larrick y Gavilondo, 1989). A eco se suma el descubrimiento reciente de que los seres humanos poseen en abundancia y de forma "natural" ciertos anticuerpos llamados anti-Gal que son especficos para el azcar "galactosa (alfa 1-3) galactosa" (Galili et al., 1984). El problema con los anticuerpos anti-Gal es que el azcar galactosa (alfa 1-3) galactosa se encuentra presente en el componente glicosdico de las Igs de ratn (Thall y Galili, 1990; Borrebaeck et al., 1993; Lund et al., 1993). En consecuencia, se ha postulado que las Igs de ratn, al ser administradas pasivamente en un ser humano, seran rpidamente reconocidas por los anticuerpos anti-Gal, pudiendo neutralizarse los efectos teraputicos buscados, incluso antes de la aparicin de la mencionada respuesta HAMA (Borrebaeck et al., 1993). Estudios recientes indican que la enzima responsable de la incorporacin del azcar Gal (alfa 1-3) Gal en glicoprotenas y otras biomolculas no es activa en los seres humanos y en consecuencia las Igs humanas no poseen esta estructura (Galili y Swanson, 1991). Ahora bien, las diferencias en el patrn de glicosilacin de las Igs entre el humano y el ratn pudieran ser importantes en otro contexto, el de la fisiologa y las funciones efectoras de estas molculas. Un nmero considerable de evidencias indica que el componente glicosdico de los anticuerpos es un elemento modulador de su capacidad para mediar la activacin de la cascada del Complemento, la actividad citotxica dependiente de anticuerpos (ADCC), y parmetros como la vida media biolgica en tejidos y en la sangre (Koide et al., 1977; Walker et al., 1989; Tao y Morrison, 1989; Wright et al., 1990; Lund et al., 1990; Dorai et al., 1991; Morrison, 1992; Wawrzynczak et al., 1992; Hand et al., 1992). Por esta razn los anticuerpos de ratn pudieran resultar ineficientes para mediar, en el cuerpo humano, las mencionadas funciones efectoras y/o verse alterada su fisiologa. Otro obstculo lo constituye la forma cmo el sistema inmune del ratn "reconoce" a los antgenos. Cuando un ratn es inmunizado con una molcula, su sistema inmune reconoce ciertas regiones llamadas eptopos, hacia las cuales va dirigida la respuesta de anticuerpos. Ahora bien, para una molcula dada estos eptopos no necesariamente son los mimos que reconoce el sistema inmune humano y por tanto no siempre es posible obtener anticuerpos de ratn con la especificidad requerida. Es as como por ejemplo, hasta los momentos nadie ha logrado obtener anticuerpos monoclonales de ratn anti-Rh (bien sea anti-D u ola especificidad dentro del sistema) (Thompson y Hughes-Jones, 1990). Otra consecuencia de lo mencionado anteriormente se ilustra con los anticuerpos monoclonales murinos dirigidos a especificidades dentro del complejo principal de histocompatibilidad humano, HLA. Con frecuencia stos carecen de la especificidad fina, restringida, que se observa con los reactivos humanos (Pistillo et al., 1988). Estas dificultades se han constituido en las motivaciones principales para el desarrollo de los anticuerpos monoclonales humanos ya que, en principio, stos deben ser mucho menos inmunognicos que los de origen mrido y adems estarn exentos de los problemas funcionales antes mencionados. El alcance potencial de utilizacin de estos reactivos es tremendamente amplio e incluye campos como el tratamiento del cncer, facilitamiento de trasplantes de rganos, imagenologa de tumores, entre otros. Adems, como ya se mencion, los anticuerpos monoclonales humanos seran herramientas tiles para la identificacin de antigenos que el sistema inmune del ratn reconoce en forma diferente del sistema inmune humano, como es el caso del grupo sanguneo Rh y los antgenos del complejo principal de histocompatibilidad HLA. Produccin de anticuerpos monoclonales humanos

La produccin de anticuerpos monoclonales humanos ha sido abordada desde dos frentes principales. Uno es a travs de la inmortalizacin de las clulas productoras de anticuerpos, aspecto que detallaremos a continuacin, y el otro mediante el uso de tcnicas de biologa molecular y ADN recombinante, el cual se describe ms adelante, en la seccin que hemos titulado "Anticuerpo de segunda generacin" Inmortalizacin de las clulas productoras de anticuerpos La preparacin de anticuerpos monoclonales humanos mediante la inmortalizacin de las clulas productoras de stos ha tenido que enfrentar dos escollos importantes que vale la pena mencionar antes de detallar las tcnicas por las cuales se ha abordado este objetivo. Uno es la fuente de donde obtener los linfocitos B humanos. En la mayora de los casos, la sangre perifrica ha sido la fuente prcticamente obligada (James y Bell, 1987). Desgraciadamente, en la sangre perifrica la proporcin relativa de linfocitos B es baja si se compara con rganos linfoides como el bazo y los ganglios. Adems, se cree que en la sangre perifrica son pocos los linfocitos B que se encuentran en el estadio adecuado de diferenciacin para rendir hbridos productores de inmunoglobulinas (Schwaber et al., 1984). El otro aspecto es la inmunizacin. A menos que uno cuente con la suerte de tener individuos inmunizados de forma "natural", son pocos los casos en los que deliberadamente se puede inmunizar a un ser humano para luego obtener una muestra de sus linfocitos B inmunes y utilizarlos para la produccin de anticuerpos monoclonales. Resultados obtenidos por Melamed en 1987 realizando estudios para la produccin de anticuerpos monoclonales humanos con especificidad por el grupo sanguneo Rh ilustran la importancia que la inmunizacin tiene para la generacin de un anticuerpo monoclonal. En estos estudios se encontr que el tiempo para la obtencin de los linfocitos desde el momento M ltimo "contacto con el antgeno" resulta crtico para el xito o fracaso (Melamed et al, 1987). La utilizacin de esquemas de inmunizacin in vitro se mantiene como una alternativa promisoria para la resolucin de este problema. Haciendo uso de los avances en el conocimiento de los mecanismos y seales solubles que se ponen en juego durante la aparicin de la respuesta inmune humoral, como por ejemplo la interaccin de linfocitos B con linfocitos T cooperadores activados que expresan el ligando para CD40 (Banchereau et al., 1991) y con clulas dendrticas foliculares, el efecto de ciertas interleucinas como las IL-2, IL-4, IL-5 (Phillips y Klaus, 1992; Morikawa et al., 1993), la IL-6 (Hirano y col., 1987; Tosato et al., 1988), la IL-10 (De Waal et al., 1992; Briere et al., 1993; Burdin et al., 1993) y la forma soluble de CD23 (Thorley-Lawson, 1988), en conjunto con los avances en el desarrollo de nuevos agentes adyuvantes tipo P3C-X (Hoffman et al., 1990) y muramil-dipptido (Carrol et al., 1990) y la caracterizacin de las influencias que ejercen in vitro las poblaciones celulares presentes en la sangre perifrica que, como se mencion, es la fuente principal para la obtencin de los linfocitos B en la mayora de los casos (eliminacin de la poblacin de linfocitos T CD8+) (Borrebaeck, 1988), es probable que pronto se disponga de una manera confiable de inmunizar linfocitos B humanos in vitro. La inmortalizacin de las clulas humanas productoras de anticuerpos se ha hecho bsicamente por tres vas. Una es la transformacin de los linfocitos B humanos con el virus de Epstein-Barr (VEB); otra la fusin de clulas somticas para generar horno o heterohibridomas y una ltima que combina las dos primeras; es decir, transformacin con el VEB seguido de fusin celular.

Inmortalizacin por transformacin con el VEB Desde 1968 se conoce que la infeccin de linfocitos B humanos con el VEB induce en ellos un proceso de transformacin que les faculta para crecer por perodos prolongados en cultivo, generndose las, as llamadas lneas linfoblastoides (Pope et al., 1968). El primer reporte de tina lnea linfoblastoide productora de anticuerpos de especificidad conocida fue hecho por Steinitz en 1977, quien obtuvo anticuerpos monoclonales humanos especficos para el hapteno NNP (Steinitz et al., 1977). La tcnica es relativamente sencilla: consiste en aislar la fraccin de clulas mononucleares (CMN) a partir del "buffy coat" de una muestra de sangre, obtenida de un donante en cuyo suero se hayan detectado los anticuerpos deseados. Estas CMN son luego incubadas con una fuente de VEB, lo cual permite que ocurra la infeccin viral con la subsecuente multiplicacin celular y produccin de anticuerpos. Dado que las clulas B infectadas expresan antgenos virales en su superficie (Thorley-Lawson, 1988) y ms del 95% de los seres humanos posee inmunidad contra el VEB (es el agente causal de la mononucleosis infecciosa o enfermedad del beso) (Henle et al, 1968), es necesario eliminar o inactivar los linfocitos T citotxicos especficos presentes en las CMN. Esto se logra comnmente aadiendo a los cultivos fitohemaglutinina o ciclosporina A. Al cabo de unos 7-10 das se examina el sobrenadante de los cultivos en busca de aquellos que contengan los anticuerpos deseados y se procede a aislar o clonar las clulas linfoblastoides productoras de stos. Dicho aislamiento se ha realizado mediante tcnicas de roseteo, "panning" o "FAC-sorting" (Kozbor y Roder, 1983) y es necesario debido a que las clulas linfoblastoides obtenidas constituyen una poblacin heterognea en la cual, por lo general, terminan predominando las clulas B no productoras de las inmunoglobulinas de inters. A pesar de su simplicidad, muchos investigadores han encontrado numerosos inconvenientes al tratar de producir anticuerpos monoclonales mediante la transformacin con VEB. Quizs el ms importante de estos inconvenientes es la manifiesta incapacidad que exhiben las clulas linfoblastoides para clonarse a baja densidad celular (James y Bell, 1987). Como mencionamos, este clonamiento es fundamental para minimizar el riesgo de sobrecrecimiento de las clulas en las que no estamos interesados por encima de las que s, pero adems es importante para garantizar la clonalidad de una preparacin dada de anticuerpos. De manera que, aun teniendo xito en la fase de aislamiento o seleccin, en muchos casos el producto obtenido es oligoclonal, no monoclonal. Adems, la experiencia acumulada indica que las clulas linfoblastoides tienden con el tiempo a disminuir e incluso a detener la produccin de anticuerpos y a dejar de crecer (Thompson, 1988). Preparacin de hibridomas Otra manera de inmortalizar las clulas productoras de anticuerpos ha sido mediante la fusin de clulas somticas para generar hibridomas humanos (Abrams et al., 1986). Por diversas razones, algunas de ellas no del todo entendidas, la produccin de hibridomas humanos ha resultado bastante ms dificultosa que la obtencin de los homlogos hibridomas de ratn. Entre estas razones se encuentra la no disponibilidad de una pareja (o parejas) de fusin adecuada. La obtencin de lneas mielomatosas humanas equiparables a las existentes en el modelo murino ha resultado difcil. Las clulas de mieloma humano se adaptan pobremente a crecer en cultivo y adems exhiben baja fusogenicidad y eficiencia de clonamiento. As mismo, las pocas lneas que se han generado son productoras, ya sea de cadenas livianas o pesadas (Kozbor y Roder, 1983: James y Bell, 1987; Thompson, 1988; Larrick y Gavilondo, 1989).

Estos inconvenientes han provocado la utilizacin de las lneas mielomatosas mridas en la construccin de "heterohibridomas" humano-ratn. Sin embargo, con este sistema se ha presentado el problema de la inestabilidad de los hbridos. Esta inestabilidad radica, fundamentalmente, en la ocurrencia de un fenmeno denominado segregacin (prdida preferencial de los cromosomas de una especie que ocurre cuando se hibridizan clulas somticas de diferentes especies). Desafortunadamente, en el caso de los heterohibridomas humano-ratn los cromosomas que se segregan son los humanos (James y Bell, 1987). Tratando de disminuir este problema se ha optado por preparar hbridos humano-ratn (los llamados "heteromielomas") para usarlos como pareja de fusin, con la esperanza de que al tener un componente humano previo, el nuevo hbrido no segregue tan vigorosamente los cromosomas humanos (Foung et al., 1986; Grunow et al., 1988; Jahn et al., 1990). Transformacin con el VEB + fusin celular. La otra forma cmo se ha abordado el problema de producir anticuerpos de manera continua en el laboratorio es mediante la combinacin de las dos tcnicas antes mencionadas, es decir transformacin con VEB y posterior fusin con mieloma o heteromieloma. Este enfoque ha resultado ms exitoso que cualquiera de las dos tcnicas por separado. En esencia, el esquema bsico de ambas tcnicas es respetado: luego de la transformacin y enriquecimiento de las clulas transformadas productoras del anticuerpo, stas se fusionan con una poblacin de clulas de mieloma o heteromieloma. El producto de fusin es ahora sometido a un proceso de doble seleccin negativa en un medio que contiene una droga para eliminar las clulas mielomatosas (por lo general aminopterina, ya que ordinariamente las clulas de mieloma utilizadas son deficientes en la enzima HGPRT) y una droga para eliminar las clulas linfoblastoides humanas no fusionadas (se emplea Ouabaina, un inhibidor de la ATP-asa Na-K de la membrana celular, para el cual las clulas humanas exhiben una mayor susceptibilidad que las de ratn). Esta variante fue introducida en 1982 (Kozbor et al., 1982) y ha sido ampliamente utilizada para la produccin de anticuerpos monoclonales humanos contra distintos antgenos. Mediante el uso de estas tcnicas varios laboratorios en el mundo, incluyendo el nuestro ubicado en el Instituto Venezolano de Investigaciones Cientficas, han producido anticuerpos monoclonales humanos anti-Rh. El inters fundamental en esta rea reside en su posible utilidad como reactivos de clasificacin eritrocitaria y en su potencial uso como sustitutos de la preparacin policlonal anti-Rh que actualmente se utiliza para prevenir la inmunizacin materno-fetal en los casos de incompatibilidad Rh. No obstante, estos anticuerpos tambin han ayudado enormemente a definir los detalles finos de la antigenicidad del antgeno D y a la identificacin y caracterizacin de la(s) molcula(s) en la(s) que reside el factor Rh. Resumen del Proceso de Produccin de un Anticuerpo Monoclonal Humano En la figura 2 se esquematizan los pasos necesarios para el desarrollo de hibridomas productores de anticuerpos monoclonales humanos.

FIGURA 2. ESQUEMA PARA LA PRODUCCIN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES HUMANOS TOMADO Y MODIFICADO DE KOZBOR Y RODER, 1983.

Anticuerpos monoclonales de segunda generacin En esta seccin se tratar lo relativo a dos modalidades de produccin de anticuerpos monoclonales que tienen una perspectiva tremenda en el campo de la teraputica y el diagnstico in vivo. Son stas la produccin de anticuerpos biespecficos y de anticuerpos recombinantes. Anticuerpos biespecficos Es bien sabido que una molcula de inmunoglobulina reconoce dos determinantes antignicos iguales, gracias a la existencia en su estructura de dos puntos de combinacin idnticos. Pero sera muy til disponer de inmunoglobulinas en las cuales cada sitio de unin (o punto de combinacin) reaccione con un determinante antignico diferente, permitindoles as interactuar simultneamente con dos antgenos distintos. Son estas molculas las que han sido llamadas anticuerpos biespecficos. Su preparacin se ha logrado mediante la fusin de, ya sea un hibridoma especfico para uno de los antgenos con linfocitos de un animal inmunizado contra el otro antgeno (generndose clulas hbridas llamadas triomas), o de dos hibridomas cada uno con especificidad por un antgeno distinto (dando lugar a los llamados cuadromas). Tanto los triomas como los cuadromas expresan los genes de las inmunoglobulinas provenientes de ambas clulas progenitoras y en ambos ocurre la combinacin aleatoria de los productos proticos de estos genes. Por lo tanto, estas clulas producen anticuerpos monoespecficos para cada antgeno pero adems producen molculas de anticuerpos especficas para ambos antgenos (Gavilondo, 1990), A ttulo de ejemplo, en 1993 Kaneko y col. publicaron en la revista "Blood" la generacin de un anticuerpo biespecfico de uso potencial en el tratamiento en humanos de la leucemia mieloide aguda. Este anticuerpo es especfico para la molcula CD3 presente en los linfocitos T humanos y para la molcula CD13, la cual se expresa abundantemente en las clulas leucmicas. In vitro, este monoclonal hbrido fue capaz de estimular la lsis de clulas leucmicas provenientes de pacientes con leucemia mieloide aguda, por parte de clulas mononucleares de sangre perifrica autlogas, estimuladas con interleucina 2 o interleucina 7. Los autores proponen a este monoclonal como una herramienta para la eliminacin de clulas CD13+ en trasplantes de mdula sea autloga en pacientes con este tipo de leucemia (Kaneko et al., 1993). Anticuerpos recombinantes Las tecnologas de ADN recombinante se han revelado como una herramienta tremendamente poderosa y promisoria para la preparacin, modificacin y mejoramiento de los anticuerpos monoclonales, tanto de origen mrido como humano. Esto ha sido posible gracias al conocimiento detallado que se tiene en la actualidad sobre la estructura y organizacin de los genes que codifican a las molculas de inmunoglobulina (Max, 1993). La combinacin de este conocimiento y estas tecnologas ha permitido hacer verdadera ingeniera molecular para preparar molculas de inmunoglobulina en las que las regiones que determinan la especificidad por el antgeno provienen de genes de ratn y el resto de la molcula es codificado por genes humanos. Virtualmente todo el trabajo de ingeniera molecular, cuyos detalles escapan de los alcances de esta revisin, se realiza a nivel del ADN. El producto de este trabajo son genes hbridos o, ms apropiadamente, recombinantes que ahora pueden ser insertados en vectores adecuados los cuales permiten su expresin (transcripcin a ARN mensajero y traduccin a protena) en bacterias o en clulas eucariotas como ciertos hongos unicelulares o lneas celulares de mamferos. Han surgido as los llamados anticuerpos "quimricos" y "humanizados" como una alternativa

tecnolgica en los intentos de evitar o disminuir la respuesta inmune humana antiinmunoglobulina de ratn, que se genera cuando inyectamos un anticuerpo murino, pero sin perder la especificidad que ste nos brinda (Winter y Milstein, 1991 ). A ttulo de ejemplo se puede mencionar el trabajo de Hale y col., publicado en 1988 por a revista "Lancet" donde se seala la utilizacin de ese tipo de reactivos humanizados en el tratamiento de pacientes con linfomas, obtenindose mejores resultados que con el uso de los monoclonales murinos (Hale et al., 1988). Estas tecnologas tambin han permitido la preparacin de genes que codifican molculas hbridas en las que el fragmento Fc del anticuerpo ha sido sustituido por una enzima, una toxina o una droga. Estos genes recombinantes pueden tambin ser expresados apropiadamente, obtenindose molculas con la capacidad de reconocer especficamente a un antgeno (mediante el fragmento de inmunoglobulina) y con una propiedad funcional nueva, distinta de la del anticuerpo "natural", conferida por la actividad enzimtica, de toxina o de droga que le ha sido artificialmente incorporada. Un ejemplo interesante y con una enorme potencialidad prctica lo constituye un gen recombinante preparado por Schnee en 1987, en el cual se combinaron los segmentos gnicos que codifican la cadena beta del activador tisular del plasmingeno y la regin de combinacin de la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal con especificidad por la fibrina. Al ser expresado este gen, se obtuvo una protena recombinante capaz de reconocer especficamente cogulos de fibrina y participar en su disolucin (Schnee et al., 1987). As mismo, una serie de inmunotoxinas (as se llaman las protenas recombinantes anticuerpo-toxina) han sido preparadas y estn siendo evaluadas para su uso como agentes profilcticos en la enfermedad injerto contra husped que aparece con frecuencia luego de un transplante de mdula sea (Antin et al, 1990), en la eliminacin de clulas leucmicas u en el tratamiento de linfomas (Amlot et al., 1993; Grossbard y Nadler, 1994). Conclusin El advenimiento de los anticuerpos monoclonales ha sido, en el mbito de las ciencias biomdicas, uno de los desarrollos metodolgicos ms importantes de los ltimos 20 aos. Su utilizacin parece no tener ms lmites que aquellos que se imponga el usuario, como bien lo ha ilustrado la generacin de los llamados anticuerpos monoclonales catalticos (Danishefsky, 1993; Janda et al., 1993). El detallado conocimiento de la organizacin de los genes que codifican estas protenas, en conjunto con las avanzadas tecnologas para la manipulacin gentica de las que se dispone en la actualidad, ha permitido el desarrollo de tcnicas para la elaboracin de genotecas combinatorias tanto de origen humano como mrido (Winter y Milstein, 1991), las cuales se anticipa sean de gran unidad en el entendimiento de enfermedades autoinmunes relacionadas con la respuesta inmune humoral (Rapoport et al., 1995) y en la elaboracin de reactivos teraputicos aplicables a una variedad de patologas (Glassy, 1993). REFERENCIAS: Abrams P.G., G.L. Rossio, H.C. Stevenson y K.A. Foon (1986): Optimal strategies for developing human-human monoclonal antibodies. Meth. Enzymol. 121:107. Amlot P.L. et al. (1993): A phase study of an anti-CD22 deglycosylated ricin A chain immunotoxin in the treatment of B cell lymphomas resistant to conventional therapy. Blood 82:2624.

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Los anticuerpos monoclonales han producido desde su descubrimiento una revolucin de gran calado en el diagnstico y el tratamiento de numerosas enfermedades. La utilizacin de anticuerpos monoclonales humanizados y humanos ha mejorado notablemente su tolerancia. La tecnologa actual de fabricacin de estos anticuerpos permite nuevos diseos que pueden ampliar sus posibles aplicaciones en medicina. Artculo Introduccin El descubrimiento y caracterizacin de los anticuerpos tiene una larga historia, que es la de la propia inmunologa, y se remonta a finales del siglo xix . En esa poca, los microbilogos estudiaban los mecanismos de defensa del organismo contra los agentes microbianos, en particular contra las toxinas bacterianas. Von Behring y Kitasato sentaron en los aos noventa del siglo xix las bases de la inmunidad humoral al descubrir que el suero produca sustancias que antagonizaban toxinas como la diftrica o la tetnica. Ehrlich, a finales de siglo, consolid la idea de que las toxinas generaban antitoxinas sricas que se comportaban segn las leyes de la qumica; las clulas de la sangre eran capaces de producir unas cadenas laterales que reaccionaban frente a las toxinas de manera especfica como una llave con su cerradura1. Por las distintas propiedades de reaccionar las antitoxinas se denominaban de varias maneras: aglutininas, opsoninas, etc. En los aos treinta del siglo xx Landsteiner, el descubridor del sistema ABO, identifica todas esas funciones y las centra en una sola molcula, los anticuerpos, y al tiempo va sustituyndose el nombre de toxina por el de antgeno. Aos ms tarde, este mismo autor, junto con Pauling, desarrolla la teora instruccionista de formacin de los anticuerpos, segn la cual los antgenos determinaran la conformacin de los anticuerpos acomodndola a su estructura. A finales de los cuarenta se descubre el origen celular de los anticuerpos en las clulas B y plasmticas. Aos ms tarde se describen las cadenas ligeras y se identifican las inmunoglobulinas A, D y E. Frente a la teora instruccionista, Jerne propuso en los aos cincuenta que los anticuerpos preexistan en el organismo y que la funcin de los antgenos sera la seleccin de los ms adecuados2. Poco despus, Burnett y Talmage adelantan la teora de la seleccin clonal3 que completa y expande las ideas de Jerne, y que presupone que cada clula B produce un solo tipo de anticuerpo con una especificidad concreta, el cual se genera por mutaciones somticas al azar durante el proceso de maduracin celular; ms adelante, la exposicin a los antgenos hace que esas clulas B proliferen. En los aos sesenta se describe el concepto de idiotipo y en los setenta se acua la teora de las redes de idiotipos/antiidiotipos, pero la revolucin en el mundo de los anticuerpos ocurre en 1975 cuando Milstein y Khler decubren en Cambridge los anticuerpos monoclonales. En 1976 Tonegawa describe la recombinacin somtica de los genes de inmunoglobulinas4. Desde entonces la investigacin completa el conocimiento de la gentica molecular de los anticuerpos y los mecanismos de generacin de su diversidad. Estructura y caractersticas bsicas de los anticuerpos Cada molcula de anticuerpo est formada por 4 cadenas, 2 ligeras y 2 pesadas, cada una de ellas idntica, unidas por puentes disulfuro que forman una estructura espacial similar a una Y. Los anticuerpos tienen 2 funciones fundamentales, de reconocimiento y unin a antgenos, que llevan

a cabo mediante los extremos aminoterminales de las cadenas, y una funcin efectora, realizada por el extremo carboxiterminal de las cadenas pesadas (Figura 1). Esquema de la estructura de una molcula de inmunoglobulina. Las cadenas pesadas aparecen en negro y las ligeras en gris claro. CH: dominios de la regin constante de la cadena pesada; CL: dominio constante de la cadena ligera; COOH: extremo carboxiterminal; Fab y Fc: fragmentos resultantes de protelisis; NH: extremo aminoterminal; VH: dominio variable de la cadena pesada; VL: dominio variable de la cadena ligera; - - -: puentes disulfuro. Figura 1. Esquema de la estructura de una molcula de inmunoglobulina. Las cadenas pesadas aparecen en negro y las ligeras en gris claro. CH: dominios de la regin constante de la cadena pesada; CL: dominio constante de la cadena ligera; COOH: extremo carboxiterminal; Fab y Fc: fragmentos resultantes de protelisis; NH: extremo aminoterminal; VH: dominio variable de la cadena pesada; VL: dominio variable de la cadena ligera; - - -: puentes disulfuro. Las cadenas ligeras tienen una porcin variable, de la que depende la especificidad, y una regin constante que difiere segn se trate de cadenas ligeras o . Las cadenas pesadas poseen, asimismo, una regin variable y una constante, la cual determinar las clases o isotipos principales de inmunoglobulina (Ig): , , . y , que formarn, respectivamente, la IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Adems, la IgA tiene 2 subclases, IgA1 e IgA2, y la IgG se divide en 4 subclases: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Las propiedades de las Ig dependen de cada clase y subclase. Una vez secretadas, las Ig son monomricas, con excepcin de la IgA, que forma dmeros, y de la IgM, pentmeros. Las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas estn yuxtapuestas para formar el sitio de unin al antgeno; por consiguiente, en cada molcula de anticuerpo hay 2 sitios de unin antignica. Dentro de la estructura de las cadenas de las Ig se denominan dominios a estructuras repetidas de 110 aminocidos (AA) con un pliegue beta. Las cadenas ligeras tienen 1 dominio en la regin variable (VL) y 1 en la constante (CL). Las cadenas pesadas tienen, a su vez, 1 dominio en la regin variable (VH) y 3 o 4 en la regin constante (CH) segn la clase de Ig. Entre los dominios CH1 y CH2 se encuentra un rea denominada bisagra de la cadena constante que le da flexibilidad y permite un acoplamiento espacial adaptable. En las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas hay 3 segmentos hipervariables de 10 AA yuxtapuestos que forman el sitio de unin al antgeno, que por ser complementarios a su secuencia se denominan CDR 1, 2 y 3, de los cuales el ms variable es CDR3. Estas estructuras forman bucles en la superficie de los anticuerpos mediante los que interactan con los antgenos. El resto del dominio variable se llama FR. La protelisis de las molculas de Ig da lugar a distintos fragmentos segn la sustancia empleada; el fragmento F(Ab)2 se genera tras tratamiento con pepsina que corta la molcula a la altura de la bisagra dejando la parte superior de la Y con 2 fragmentos F(Ab) unidos entre s. La papana digiere la molcula ms arriba y deja 3 fragmentos, 2 F(Ab) y un fragmento constante, Fc. Se habla de fragmento F(Ab) cuando incluye la regin de la bisagra de la cadena pesada.

Los anticuerpos son capaces de generar numerosas respuestas tras su unin a los antgenos. Esas respuestas efectoras dependen del extremo carboxiterminal de cada isotipo que determina el tipo de unin a determinados receptores de membrana de las clulas y la capacidad de fijar complemento. Sntesis de inmunoglobulinas. Generacin de diversidad. Activacin y maduracin de los linfocitos B La produccin de las Ig corre a cargo de las clulas B que en su etapa madura expresan en la membrana molculas de IgM e IgD. Cuando se activan, comienza una produccin de Ig de baja tasa, cambia el isotipo y comienza la maduracin por afinidad. En la etapa de clula plasmtica hay una alta secrecin de Ig de alta afinidad con escasa presencia de Ig de membrana. Los mecanismos que controlan la diversidad de los anticuerpos5 son altamente complejos y han ocupado la actividad de los investigadores durante dcadas. Resumiendo mucho, podemos decir que existen 2 etapas bsicas en este proceso: una recombinacin somtica, en la que se produce la combinacin de distintos segmentos gnicos presentes en las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas que terminan formando un gen funcional responsable de la secuencia de AA de la porcin variable de la molcula de Ig, que da lugar a una muy elevada diversidad de molculas en lo que se llama repertorio primario de anticuerpos, y una hipermutacin somtica durante la respuesta a antgenos, que corresponde a mutaciones puntuales de la secuencia variable una vez formada sta y que terminan permitiendo una mayor afinidad de unin. Adems, a medida que madura la respuesta inmune tiene lugar un cambio de isotipo mediante el cual el segmento variable reordenado puede combinarse con cualquiera de los segmentos constantes de las Ig y de ello dependern las caractersticas efectoras finales de la molcula de Ig secretada. Los genes de las cadenas ligeras se agrupan en 2 segmentos gnicos de la regin variable, V (variable) y J (unin) y un segmento constante (C) distinto segn se trate de cadenas o . Las cadenas pesadas tienen 3 segmentos en las regiones variables: V, D (diversidad) y J, y un segmento C distinto segn el isotipo de cada Ig. En los seres humanos la cadena ligera depende de una regin en el cromosoma 2 que agrupa los segmentos V, J y C. Los mismos segmentos gnicos responsables de la cadena estn en el cromosoma 22. Los segmentos V, D, J y C de las cadenas pesadas se sitan en un rea del cromosoma 14. El nmero de segmentos V, D, J y C de las cadenas y la probabilidad de combinacin se detallan en la Tabla 1. Tabla 1. Combinaciones posibles en el repertorio primario de anticuerpos Cadenas Cadenas Cadenas pesadas Segmentos V 40 31 51 Segmentos D 0 0 27 Segmentos J 5 4 6 Posibilidades de combinacin 200 124 8.262 Posibilidades de combinacin total: (200+124) x 8.262=2.676.888. Tomado de lvarez-Vallina et al, 2004. Para que las clulas B se activen se necesita el contacto con los antgenos. Es importante resaltar que a diferencia de lo que ocurre con las clulas T, las clulas B reconocen una amplia variedad de

antgenos proteicos y no proteicos. Las macromolculas estimulan a los anticuerpos mediante determinantes antignicos o eptopos que pueden ser lineales o conformacionales, esto es, yuxtapuestos en un pliegue de la protena. Si la protena se transforma puede originar nuevos determinantes antignicos. La unin con el antgeno es reversible y la fuerza de su unin se llama afinidad. La fuerza global de unin al antgeno se conoce como avidez, que depende del nmero de puntos de unin disponibles. La especificidad es la capacidad de reconocer en un anticuerpo pequeas diferencias antignicas. Las molculas de IgM e IgD ancladas en la membrana de las clulas B actan como receptores de antgeno. En el caso de los antgenos proteicos, se requiere la ayuda de las clulas T para activar a las B, lo cual implica el desencadenamiento de seales intracelulares con activacin de factores de transcripcin y expresin de genes, cambio de isotipo y diferenciacin hacia clula productora de anticuerpos. En el caso de los antgenos no proteicos, no dependientes del timo, no se requiere la cooperacin de las clulas T. La activacin cesa a travs de seales inhibitorias complejas cuando la cantidad de anticuerpo producida es suficiente. Durante la activacin y maduracin las clulas B migran a los folculos de ganglios linfticos y del bazo, donde maduran mediante hipermutacin somtica con aumento creciente de afinidad por el antgeno. Al final sobreviven solamente las ms afines al antgeno presentado por clulas dendrticas y, finalmente, migran hacia rganos linfticos secundarios, aunque una pequea parte permanece como clulas B de memoria que recirculan entre ganglios linfticos y del bazo. Cada clon de clulas plasmticas produce un solo tipo de anticuerpo. Produccin de anticuerpos monoclonales Los anticuerpos monoclonales se descubrieron en la primera mitad de los aos setenta por Milstein y Khler en el laboratorio de biologa molecular de Cambridge (Reino Unido). Estos autores investigaban los mecanismos moleculares de la generacin de diversidad de los anticuerpos y necesitaban producir una clula B inmortal con especificidad conocida, para as poder analizar en detalle las mutaciones de los genes de las Ig. Para ello fusionaron una lnea de clulas de mieloma murino, sensible a ciertos frmacos, con clulas de bazo de un animal inmunizado. Mediante este procedimiento consiguieron seleccionar solamente las clulas hbridas y los clones con especificidad conocida. Su trabajo fue publicado en Nature en 19756 y 9 aos ms tarde recibieron el premio Nobel por este descubrimiento. Su trascendencia fue enorme, ya que por primera vez era posible disponer de cantidades ilimitadas de anticuerpos con especificidades precisas. Las clulas tumorales de mieloma de ratn procedan todas ellas de una lnea creada por Michael Potter en los aos sesenta denominada MOPC21, deficitarias en enzimas clave para la sntesis de oligonucletidos por la va de rescate. El agente fusionante inicial era el virus Sendai, pero pronto se sustituy por polietilenglicol. Las clulas B provenan de ganglios linfticos o del bazo de ratones inmunizados repetida y eficazmente con el antgeno deseado. Estas clulas se cultivaban con las de mieloma y el agente fusionante en un medio de cultivo de composicin especial (HAT) que no permite la supervivencia de las de mieloma no hibridadas; los linfocitos B no fusionados moran tambin y quedaban las clulas fusionadas. La especificidad se analizaba en los sobrenadantes de los pocillos de las placas de cultivo, seleccionando slo los deseados y al final se llevaba a cabo la clonacin por dilucin lmite u otros medios7, 8.

Los hibridomas creados pueden conservarse indefinidamente en dimetil sulfxido y los anticuerpos monoclonales se purifican a partir de los sobrenadantes. El rendimiento en cultivo no es muy alto y por ello se ha desarrollado la tcnica de produccin de ascitis en ratones mediante la inyeccin intraperitoneal de los hibridomas, mtodo no aceptado en todos los pases, o procedimientos in vitro mediante la fermentacin de cultivos de clulas de mamfero utilizando biorreactores y sistemas de cultivo de perfusin continua. El primer uso en terapia humana fue en 1982 para el tratamiento de un linfoma9. Pronto se vio que el uso de monoclonales murinos arrastraba el problema de la tolerancia con produccin de anticuerpos humanos antimurinos que disminuan su eficacia. Para solventar estas dificultades se exploraron diversas alternativas, de las que las ms importantes son la quimerizacin y la humanizacin. La quimerizacin se desarroll en 198410. Por quimerizacin se entiende la produccin de anticuerpos monoclonales en los que solamente la regin variable es de origen murino, y el resto de las cadenas pesadas y ligeras es de origen humano. En los anticuerpos humanizados slo son murinas las regiones hipervariables de las cadenas ligeras y pesadas11, 12. La mitad de los monoclonales utilizados en terapia humana son quimricos o humanizados (Figura 2). Quimerizacin y humanizacin de anticuerpos monoclonalesA) Monoclonal murino. B) Monoclonal quimrico, en el que las regiones variables son de origen murino siendo humano el resto de las cadenas.C) Monoclonal humanizado: slo incluye los segmentos hipervariables de origen murino. D) Monoclonal humano. Figura 2. Quimerizacin y humanizacin de anticuerpos monoclonalesA) Monoclonal murino. B) Monoclonal quimrico, en el que las regiones variables son de origen murino siendo humano el resto de las cadenas.C) Monoclonal humanizado: slo incluye los segmentos hipervariables de origen murino. D) Monoclonal humano. Otra alternativa son los monoclonales humanos que se producen en animales transgnicos portadores de genes de Ig humanas; los transgenes incluyen fragmentos de las regiones variables en lnea germinal, lo que les facilita la capacidad recombinatoria de los anticuerpos humanos. Las vas de introduccin de esos segmentos son los miniloci, los cromosomas artificiales de levadura o humanos, y los vectores P1. Los animales pueden tener inactivados los genes de sus Ig endgenas13, 14. Los monoclonales humanos son ms ventajosos por su menor antigenicidad y mejor tolerancia, y por su mayor tiempo en circulacin en relacin con los quimricos. La tecnologa de fragmentos de bibliotecas de anticuerpo desplegados en protenas de la superficie de fagos filamentosos, introducida en la ltima dcada del pasado siglo, es otra posibilidad de producir grandes repertorios de genes de las regiones variables de las Ig humanas15. Es importante sealar que la tecnologa recombinante disponible permite adems la fabricacin de varios tipos de fragmentos derivados de anticuerpos, entre ellos los F(ab)2 sin regin Fc, los fragmentos Fab, los bivalentes o diabodies, o incluso trmeros o tetrmeros llamados triabodies y tetrabodies. Estos fragmentos permiten solventar algunos de los problemas relacionados con la molcula completa del anticuerpo, mejorar la avidez y facilitar la unin a determinadas dianas. Utilidad y aplicacin en patologa humana de los anticuerpos monoclonales

Independientemente de su uso en tcnicas de diagnstico, que han supuesto una revolucin en el campo de la histopatologa o permitido el desarrollo de tcnicas de laboratorio como la citometra de flujo, las posibilidades de aplicacin para tratar enfermedades humanas son amplsimas16. Dependiendo de la regin Fc, la unin del anticuerpo monoclonal al antgeno contra el que est diseado puede facilitar la produccin de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad por la activacin del sistema de complemento. La propia unin al antgeno puede bloquear receptores de la membrana celular, unirse a factores presentes en el suero y evitar su unin a receptores, o inducir seales intracelulares. Las consecuencias finales de estas interacciones son numerosas y han encontrado aplicacin en reas muy diversas. Una manera de modificar la capacidad efectora de los anticuerpos monoclonales es la conjugacin con molculas citotxicas con toxinas, con radiofrmacos o con citocinas; esta ltima ha sido una estrategia utilizada en oncologa mediante la creacin de protenas de fusin que incorporaban genes de IL-2, IL-12 o GM-CSF, entre otras. La conjugacin de enzimas capaces de convertir un profrmaco en frmaco con anticuerpos monoclonales dirigidos a clulas tumorales ha permitido una accin muy selectiva en el tejido tumoral del frmaco en cuestin. La oncologa es, sin duda, el rea de aplicacin teraputica ms importante. Son de amplia utilizacin los anticuerpos dirigidos contra HER2 en cncer de mama, o contra el factor de crecimiento epidrmico (EGF) o el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) en varios tipos de tumores, o los anti CD20 o anti CD52 para linfomas/leucemias. Las enfermedades autoinmunes son el grupo siguiente de patologa humana en el que ms se han empleado estos productos y, fundamentalmente, en artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis mltiple, lupus eritematoso, as como en el rechazo de trasplantes y enfermedad de injerto contra el husped. Los ms utilizados han sido anticuerpos contra citocinas, sobre todo TNF- y anti VLA4, pero tambin anti CD20 y anti CD25, entre otros. Los anticuerpos monoclonales se han empleado tambin con otras finalidades, como el tratamiento de la septicemia, la prevencin de complicaciones de enfermedades virales o el tratamiento de intoxicaciones por frmacos. No es el propsito de este artculo una revisin detallada de las aplicaciones actuales de los anticuerpos monoclonales actualmente aprobados y de muchos ms en distintas etapas de desarrollo teraputico. Sin ninguna duda, la disponibilidad de estos anticuerpos y de la tecnologa para su refinamiento constituye ahora y ms an en el futuro una parte fundamental de nuestra teraputica. Conclusiones Ms all del impacto en el diagnstico de laboratorio, los anticuerpos monoclonales son una herramienta teraputica poderossima. Su alta especificidad permite el abordaje de dianas muy precisas que pueden determinar cambios celulares muy variados; adems, dependiendo de la regin Fc pueden disearse para facilitar distintos tipos de respuestas efectoras. El empleo de anticuerpos humanizados y humanos ha mejorado notablemente su tolerancia clnica. La manipulacin de los anticuerpos mediante la unin a otras molculas o el diseo de nuevas fragmentos de anticuerpos abren un gran abanico de posibles aplicaciones en medicina. Conflicto de intereses El autor declara no tener ningn conflicto de intereses.

Recibido 14 Abril 2010 Aceptado 16 Junio 2010 Bibliografa 1.Ehrlich P. On immunity: with special reference to cell life. Proc R Soc Lond. 1900;66:424-48. 2.Jerne NK. The natural selection theory of antibody formation. Proc Natl Acad Sci USA. 1955;41:849-57. Medline 3.Burnet FMC. A modification of Jerne's theory of antibody production using the concept of clonal selection. Aust J Sci. 1957;20:67-9. 4.Tonegawa S. Somatic generation of antibody diversity. Nature. 1983;302:575-81. Medline 5.Abbas AK, Lichtman AH. Inmunologa celular y molecular. 2004. 6.Khler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975;256:495-7. Medline 7.Galfr G, Milstein C. Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures. Methods Enzymol. 1981;73:3-46. Medline 8.lvarez-Vallina L, Blanco B, Daz-Espada F, Gavilondo JV, Gonzlez Fernndez A, Macadn S, et-al. 9.Miller RA, Maloney DG, Warnke R, Levy R. Treatment of B-cell lymphoma with monoclonal antiidiotype antibody. N Engl J Med. 1982;306:517-22. Medline 10.Morrison SL, Johnson MJ, Herzenberg LA, Oi VT. Chimeric human antibody molecules: mouse antigen-binding domains with human constant region domains. Proc Natl Acad Sci USA. 1984;81:6851-5. Medline 11.Gorman SD, Clark MR. Humanisation of monoclonal antibodies for therapy. Semin Immunol. 1990;2:457-66. Medline 12.Mountain A, Adair JR. Engineering antibodies for therapy. Biotechnol Genet Eng Rev. 1992;10:1-142. Medline 13.Brggemann M, Neuberger MS. Strategies for expressing human antibody repertoires in transgenic mice. Immunol Today. 1996;17:391-7. Medline 14.Green LL. Antibody engineering via genetic engineering of the mouse: XenoMouse strains are a vehicle for the facile generation of therapeutic human monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 1999;23:11-23. 15.Hoogenboom HR, Chames P. Natural and designer binding sites made by phage display technology. Immunol Today. 2000;21:383-90. Medline 16.Berger M, Shankar V, Bafai A. Therapeutic applications of monoclonal antibodies. Am J Med Sci. 2002;324:14-30. http://zl.elsevier.es/es/revista/neurologia-295/articulo/anticuerpos-monoclonales-aspectosbasicos-90020346

Anticuerpo monoclonal FG-3019 para la Fibrosis Pulmonar recibe aprobacin como medicamento hurfano por la FDA El anticuerpo monoclonal humano FG-3019, desarrollado por la compaa FibroGen para el tratamiento de la fibrosis pulmonar, ha recibido la designacin de medicamento hurfano (designacin para medicamentos aprobados para enfermedades poco comunes) por la Food and Drug Administration (FDA) norteamericana para su uso en ese pas. FG-3019 ha sido desarrollado para actuar sobre el factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF), una molcula que suele aparecer aumentada en diferentes patologas asociadas a varios tipos de fibrosis, incluida la fibrosis pulmonar. La CTGF participa en procesos biolgicos, como la regulacin del ciclo celular, migracin, adhesin y angiognesis. Su expresin est regulada por diversos factores implicados en el dao pulmonar, entre los que destacan el factor de la angiotensina II (razn por la cual antagonistas como Losartn y Candesartn han mostrado resultados positivos), el factor de crecimiento transformante-beta, altas concentraciones de glucosa y situaciones de estrs celular. http://fibrosispulmonaridiopatica.blogspot.mx/2012/08/anticuerpo-monoclonal-fg-3019-parala.html