UNIVERSIDAD MICHOACANA DE SAN NICOLAS DE HIDALGO

FACULTAD DE BIOLOGA

MANUAL DEL LABORATORIO DE

BIOQUMICA
ACTUALIZADO POR QFB. Jaime Chvez Torres Dra. Patricia Ros Chvez Q.F.B. Rita Sandra Mendoza Olivares Agosto 2011

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PRACTICA No. 3 CROMATOGRAFA EN PAPEL DE CARBOHIDRATOS

INTRODUCCIN
La cromatografa fue inventada y nominada por el botnico ruso Mijal Tswett a principios del siglo pasado. La aplicacin de la cromatografa se ha incrementado en forma explosiva en los ltimos cuatro decenios debido no slo al desarrollo de varios tipos diferentes de tcnicas cromatogrficas, sino tambin en la necesidad creciente de los cientficos de disponer de mejores mtodos para separar mezclas complejas. La separacin de compuestos que son fcilmente solubles en lquidos orgnicos y solo ligeramente solubles en agua se efecta por CROMATOGRAFIA DE ADSORCION, mientras que los compuestos ionizables hidrosolubles se separan mejor por CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO IONICO. La CROMATOGRAFA DE PARTICIN es intermedia entre cromatografa de adsorcin y de intercambio inico y los compuestos que son a la vez hidrosolubles y solubles en solventes orgnicos, se separan fcilmente por mtodos de particin. La eficiencia de la separacin depende de factores como la naturaleza qumica de los componentes a separar, del disolvente y del adsobente, la geometra de la columna, la velocidad y el flujo de la disolucin y del disolvente utilizado en el desarrollo del cromatogrma. Los mtodos cromatogrficos pueden aplicarse no solamente a la separacin, identificacin y anlisis cuantitativo de aminocidos, sino tambin de pptidos, protenas, nucleotidos, cidos nucleicos, lpidos e hidratos de carbono.

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Cuando se agita un compuesto con dos disolventes que no se mezclan, este se distribuye en las dos fases en equilibrio, la razn de la concentracin del compuesto en los dos solventes es constante y se conoce como el coeficiente de particin ( ).

Concentracin de X en el sol. 1. Concentracin de X en el sol. 2.

En la cromatografa de particin uno de los solventes, usualmente el agua, permanece en la fase estacionaria que consiste en una columna pelcula de material inerte. La otra fase consiste en un lquido orgnico mvil, saturado con agua, que fluye en relacin con la fase estacionaria. Los componentes de una mezcla se separan si los coeficientes de particin entre los solventes son suficientemente diferentes. Gordon, Martn y Synge han propuesto una modificacin de la cromatografa por particin que utiliza tiras de papel como adsorbente. La celulosa en forma de hojas de papel constituye un medio de soporte muy til, donde el agua es adsorbida entre las fibras de celulosa y forma la fase hidroflica estacionaria. La relacin entre la distancia recorrida por el solvente, se conoce como el valor Rf y es ms o menos constante para compuestos, sistemas de solventes y clase de papel determinados bajo condiciones cuidadosamente controladas de concentracin de soluto, temperatura y pH. La utilizacin del mtodo de separacin de compuestos, por cromatografa sobre papel presenta muchas ventajas sobre los mtodos tradicionales de separacin como la destilacin, la cristalizacin, la extraccin con disolventes, precipitacin qumica electrnica.

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OBJETIVO
Desarrollar un procedimiento de separacin de biomolculas, e identificarlas por un mtodo qumico.

MATERIAL
A.- POR EQUIPO
3 Capilares * 1 Par de guantes de hule * 1 Atomizador * 1 Regla * 1 Lpiz * 1 Cinta masking

NOTA. * Material que el equipo debe aportar.

B.- POR GRUPO DE TRABAJO

Papel aluminio 1 Tijeras 4 Tanques para cromatografa Papel para cromatografa 1 Horno

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REACTIVOS
Mezcla de solventes para la cromatografa: BUTANOL, AC. ACTICO, AGUA (4: 1: 2 v/v). ( 175 ml de la mezcla de solventes en cada tanque para cromatografa ).

SOLUCIN REVELADORA (1 litro ): NaOH al 1% en etanol al 60%. Disolver calentando a 105 C durante 2 minutos. GLUCOSA al 2% (500 ml). LACTOSA al 2% (500 ml). SOLUCIN PROBLEMA No. 1 y No. 2 .

PROCEDIMIENTO
Para llevar a cabo el experimento de cromatografa en papel de carbohidratos, se utiliza una tira de papel Whatman No. 1 de 25 X 6 cm. Verifique que el sentido de las fibras del papel correspondan al sentido en que se va a correr el disolvente. No toque el papel con los dedos, use guantes de hule o pinzas. Trace con lpiz una lnea, a tres centmetros de la base del rectngulo del papel. Sobre la lnea basal hay que marcar tres puntos. EL primero de ellos se coloca a una distancia de 1.5 cm. de uno de los bordes, los dos puntos siguientes se colocan a intervalos de 1.5 cm. a partir del primer punto. En el primer punto marcado se utiliza un capilar para aplicar 10 gotas pequeas de solucin de GLUCOSA al 2%. Entre cada gota aplicada debe existir un tiempo prudente que permita el secado de la gota. De igual manera se aplica en el segundo punto 10 gotas de LACTOSA al 2%. Y en el tercer punto 20 gotas de una de las soluciones problema.

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Despus de la aplicacin de cada uno de los carbohidratos, introduzca la tira de papel en la cmara de cromatografa previamente preparada, saturndola con la mezcla de los disolventes, al menos durante dos horas antes de efectuar el experimento. Tenga especial cuidado en que la lnea basal donde se colocaron los carbohidratos est por encima del nivel de sistema de solventes. Utilice cintas masking para fijar el borde superior de la tira de papel a la cmara. Tape hermticamente la cmara con papel aluminio y tome nota del tiempo al cual inicio el corrimiento del cromatogrma, espere a que los disolventes asciendan hasta cerca de 2 3 cm. del borde superior del papel bien hasta una hora antes de que se d por concluida la sesin de laboratorio. Saque la tira de papel marcando la altura a donde llegaron los solventes anote el tiempo final del corrimiento del cromatogrma, y deje secar al aire. Cuando la hoja est perfectamente seca, roce con la solucin reveladora sin que sta escurra y homogneamente. Mantenga el cromatograma en posicin horizontal y deje que seque al aire el exceso de revelador y luego coloque el cromatogrma sobre una hoja de papel, dentro de una charola metlica. Introduzca la charola en un horno a 100C hasta que aparezcan las manchas bien delineadas. Utilice un lpiz para marcar las manchas y determine los valores de Rf de cada una de ellas.

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RESULTADOS
1. Reportar el color de las manchas reveladas y el tiempo que tard en correr el cromatogrma. 2. Calcular el valor Rf para la glucosa, lactosa y solucin problema. 3. En base a los valores de Rf determinados, identificar la solucin problema utilizada.

CUESTIONARIO
1. S usamos papel filtro en sta prctica, explica cual es su funcin en el mtodo cromatogrfico. 2. Qu es el coeficiente de particin de una sustancia, y que aplicacin tiene en la cromatografa? 3. Describa en detalle la tcnica de cromatografa por intercambio inico, e ilustre con una aplicacin de importancia biolgica.

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INDICE

Pag.

INTRODUCCIN........................................................................ 1 1. DETERMINACIN DE CARBOHIDRATOS POR UN MTODO FOTOMTRICO..................................... 3 2. HIDRLISIS DE POLISACRIDOS....................................... 9 3. CROMATOGRAFA EN PAPEL DE CARBOHIDRATOS....... 18 4. OBTENCIN DE LPIDOS Y DISTINCIN DE ALGUNAS DE SUS PROPIEDADES....................................................... 25 5. CUANTIFICACIN ESPECTROFOTOMTRICA DE PROTENAS.......................................................................... 32 6. SEPARACIN DE PROTENAS............................................. 38 7. BIBLIOGRAFA....................................................................... 44

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INTRODUCCIN
EL TRABAJO EN EL LABORATORIO
Durante el trabajo en el laboratorio de Bioqumica realizar experimentos que deber llevar a cabo con cuidado si quiere obtener resultados satisfactorios. Se recomienda que lea las prcticas antes de presentarse al laboratorio, para conocer que material deber aportar a la sesin y de esta manera poder organizar el trabajo a realizar. En el manual de prcticas es conveniente anotar en las hojas en blanco, datos, resultados, etc. que servirn para la elaboracin de su reporte.

Recuerde que el uso de bata es obligatorio.

Los lineamientos que a continuacin se enumeran debern observarse en todas las sesiones: 1. Sea puntual en la entrada a la sesin de laboratorio, pues se pasar lista de asistencia dentro de los primeros 15 minutos. Despus de esa hora, aunque el alumno se presente se contar falta. 2. Mantenga su lugar limpio, depositando los desechos en los cestos de basura y no en el suelo. Lave su material de vidrio antes y despus de usarlo. La limpieza es un ndice del cuidado en su trabajo. 3. Trabaje en orden, evitando distraer a sus compaeros con plticas o bromas. El alumno desordenado ser suspendido de la sesin en curso.

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SOBRE EL REPORTE
1. Deber revisarse en la siguiente sesin del laboratorio. 2. El reporte debe contener los siguientes datos: a) b) c) d) e) f) Resultados. Grficas. Clculos. Cuestionario. Conclusiones. Bibliografa.

EVALUACIN
1. Se requiere el 75% de asistencia a las sesiones de laboratorio. 2. Se calificar de 0 a 10 cada informe de prctica, de acuerdo a la calidad del mismo. 3. El total de las calificaciones de los reportes y los exmenes de laboratorio tendrn un puntaje mximo de 3, que ser sumado a la calificacin terica final de la materia. 4. La calificacin de laboratorio y de la teora deben ser aprobatorias. 5. S una de las dos calificaciones, de laboratorio o teora es reprobatoria, sta se asentar como calificacin final. 6. La calificacin aprobatoria del examen extraordinario o extraordinario de regularizacin se sumar con la calificacin aprobatoria ordinaria.

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PRCTICA No.1

DETERMINACIN DE CARBOHIDRATOS POR UN MTODO FOTOMTRICO INTRODUCCIN

Los hidratos de carbono, sacridos o glcidos se definen como polihidroxiacetonas o polihidroxialdehidos y sus derivados. La frmula emprica de los monosacridos es: (CH2O)n, en la que n =3 un nmero mayor. Un carbohidrato que no es hidrolizable a compuestos ms simples se denomina monosacrido; mientras aquel que por hidrlisis nos da dos molculas de monosacridos se llama disacrido, en tanto el que nos da muchas molculas de monosacridos por hidrlisis se conoce como polisacridos. Los monosacridos monmeros se nombran de acuerdo al nmero de tomos de carbono que poseen en la cadena: as las triosas contienen 3, tetrosas 4, pentosas 5, hexosas 6, heptosas 7 y las octosas 8. Estos monosacridos son slidos, blancos, cristalinos, muy solubles en agua e insolubles en disolventes no polares. La mayor parte de ellos son dulces. El monosacrido ms abundante es la D-glucosa de 6 tomos de carbono; es el combustible principal para la mayor parte de los organismos, y es tambin la unidad estructural bsica de los polisacridos ms abundantes, tales como el almidn y la celulosa.

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El mtodo de Nelson-Somogy para la determinacin de carbohidratos, es un anlisis cuantitativo; para la realizacin de ste, se calienta el azcar con una solucin alcalina de tartrato de cobre podruciendose as xido cuproso, que reacciona con arsenomolibdato; el color azul intenso originado se mide en un Espectrofotmetro (se mide la Absorbancia de la solucin). En la mezcla de reaccin se incluye sulfato de sodio para minimizar la entrada de oxgeno atmosfrico a la solucin lo cual podra causar reoxidacin del xido cuproso. La curva de calibracin obtenida depende en cierto grado del azcar determinado, as que el mtodo no es apropiado para la determinacin de una mezcla compleja de azcares reductores.

OBJETIVO
Aprender un mtodo fotomtrico para determinacin de carbohidratos, elaborar una curva estndar y conocer su manejo.

MATERIAL
A.- POR EQUIPO
1 Mechero Bunsen 1 Tripie 1 Tela de asbesto 1 Recipiente para Bao Mara 1 Gradilla 12 Tubos de ensaye de 15 x 150 mm 1 Hojas de papel aluminio 1 Pipeta de 1 ml 1 Pipeta de 10 ml

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1 Pinzas 1Piceta para agua destilada

B.- POR GRUPO DE TRABAJO

Espectrofotmetros 2 Celdas para el Espectrofotmetro

REACTIVOS
Reactivo de Nelson-Somogy Reactivo de Arsenomolibdato Glucosa 0.0032 M Sacarosa 0.0032 M

PROCEDIMIENTO
Para hacer su curva estndar de glucosa se utilizan las siguientes concentraciones:

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6

0.0032 M. 0.0016 M. 0.0008 M. 0.0004 M. 0.0002 M. 0 M (Tubo blanco).

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Se preparan las diferentes concentraciones de glucosa de la siguiente manera: Tubo 1 0.5 ml de glucosa 0.0032 M. Tubo 2 o.5 ml de glucosa 0.0032 M. + 0.5 ml de agua destilada, agitar bien. Tubo 3 0.5 ml de glucosa 0.0016 M. Del tubo 2 + 0.5 ml de agua destilada, agitar bien. Tubo 4 0.5 ml de glucosa 0.0008 M. Del tubo 3 + 0.5 ml de agua destilada, agitar bien. Tubo 5 0.5 ml de glucosa 0.0004 M. De tubo 4 + 0.5 ml de agua destilada, agitar bien. Tubo 6 0.5 ml de agua destilada.

Despus de preparar las diferentes concentraciones de glucosa, se procede con el mtodo de Nelson-Somogy. Se aade a los 6 tubos 0.5 ml de agua destilada y 1 ml del Reactivo de Somogy. Se tapan los tubos con papel aluminio y luego se colocan en Bao Maria hirviendo durante 15 minutos. Enseguida se enfra completamente y se adiciona 1 ml del Reactivo de Arsenomolibdato a cada tubo (PRECAUCIN es sumamente TXICO). Se agita bien y cuando la efervescencia haya cesado, completar a 10 ml con agua destilada (7 ml). Con el tubo blanco se calibra el Espectrofotmetro a 0 de Absorbancia a una longitud de onda de 525 nm. Enseguida se mide la Absorbancia de los tubos 5, 4, 3, 2 y 1. Una vez que se haya completado de manera satisfactoria la determinacin de glucosa de repite todo el procedimiento utilizando ahora la solucin de sacarosa. La curva estndar del azcar se obtiene graficando Absorbancia a 525 nm contra la concentracin.

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CUESTIONARIO
1. Explique porqu la determinacin de carbohidratos es un anlisis cuantitativo, y en qu propiedad qumica de los azcares est fundamentada su determinacin colorimtrica. 2. - Discuta los resultados obtenidos con la sacarosa y, describa en detalle el proceso que utilizaras para cuantificarla. 3. - Por el mtodo de Nelson-Somogy una solucin de glucosa tiene una Absorbancia a 525 nm de 1.0. Utilice su curva estndar para calcular la concentracin de sta solucin. 4. - Qu importancia biolgica poseen los carbohidratos?

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PRCTICA No. 2

HIDRLISIS DE POLISACRIDOS

INTRODUCCIN
Los polisacridos son molculas naturales constituidas por un gran nmero de unidades de monosacridos, unidos mediante enlace glucosdico. Por hidrlisis de los polisacridos se obtienen molculas de monosacrido. La hidrlisis la podemos llevar a cabo de forma cida, cida catalizada y, por enzimas hidrolticas. Las enzimas hidrolticas son especficas en su modo de reaccin, tienen la particularidad de acelerar el desdoblamiento de diversas molculas, entre ellas polisacridos como el glucgeno, introduciendo una molcula de agua entre las uniones glucosdicas. Estos polisacridos producen monosacridos. La D-glucosa es la unidad monosacardica predominante en los polisacridos, pero tambin podemos obtener polisacridos de la Dmanosa, la D-fructosa, la D- y L-galactosa, la D-xilosa y la D-arabinosa. En la saliva poseemos este tipo de enzimas hidrolticas, especficamente la amilasa o ptialina, que se encuentra tambin en el jugo pancretico, por ser especialmente digestiva. Esta enzima rompe las uniones glucosdicas, al introducir una molcula de agua entre los enlaces alfa-1,4 de la alfaamilasa y entre los enlaces alfa-1,6 lo hace la enzima desramificante alfa 1,6 glucosidasa, donde como producto final el disacrido maltosa. Los tres polisacridos ms importantes para el hombre son: El almidn, la celulosa y el glucgeno, los cuales podemos encontrar en forma natural en plantas y animales.

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El almidn desempea la funcin de almacenamiento energtico en las plantas, lo encontramos en forma de grnulos, mientras que la celulosa es el polisacrido que da rigidez a la pared celular de las plantas, desempea una funcin de estructura. El glucgeno es la fuente de almacenamiento energtico en los animales, se almacena en el hgado y msculos de estos.

OBJETIVO
En esta prctica se ilustran algunos de estos mtodos, verificando la produccin de la reaccin mediante determinaciones cualitativas. Podrn compararse no solo la diferencia de tiempos requerido en cada mtodo, sino tambin la gran diferencia en las condiciones requeridas para que se verifique la hidrlisis.

MATERIAL
A.- POR EQUIPO
1 Mechero Bunsen 1 Tripie 1 Tela de asbesto 1 Recipiente para Bao Mara 2 Tubos de ensaye de 15 X 150 mm 1 Vaso de precipitados 1 Gradilla 1 Pipeta de 1 ml 1 Pipeta de 10 ml 1 Pipeta Pasteur con goma 1 Agitador de vidrio 1 Placa de porcelana

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B.- POR GRUPO DE TRABAJO

2 Baos Mara 2 Termmetros Papel pH Papel aluminio

MATERIAL BIOLGICO
Saliva (amilasa salival). Recolectar unos 5 ml de saliva, evitando la espuma.

REACTIVOS
1. - Solucin de Almidn Soluble al 2% (preparar 500 ml). Para preparar 100 ml, pese 20 gramos de almidn, mzclelos bien con un poco de agua destilada, mientras hace hervir 900 ml de agua aproximadamente. Cuando haya formado una pasta con el almidn humedecido, agregue a dicha pasta el agua hirviendo, agitando intensamente. Deje enfriar un poco y complete a 1000 ml filtre si es necesario. 2. - HCl concentrado (50 ml) 3. - NaOH al 20% (preparar 500 ml) 4. - Solucin indicadora de Lugol (preparar 50 ml en dos vasos de 100 ml). Mezcle bien 2 gr. de KI y 1 gr. de Yodo; disuelva esta mezcla en agua destilada, calentando ligeramente si es necesario. Completa a 100 ml. 5. - Reactivo de Lucas. Disuelva 136 gr de ZnCl2 en 89 ml. de HCl concentrado.

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6. - Reactivo de Benedict (200 ml). Disuelva 173 gr de Citrato de Sodio 100 gr de Carbonato de Sodio en aproximadamente 800 ml de agua caliente. Filtre a travs de papel filtro en una probeta de 100 ml y complete con agua hasta 850 ml, mientras tanto disuelva 8.65 gr de Sulfato de Cobre en aproximadamente 50 ml de agua destilada y complete hasta 75 ml Vierta la primera solucin en un vaso de precipitados de 2 lts. Y aada lentamente la solucin de Sulfato de Cobre agitando continuamente.

PROCEDIMIENTO
1. - Hidrlisis cida del almidn. En un vaso de 100 ml coloque 20 ml de disolucin de almidn al 2%. Agregue 20 gotas de HCl concentrado y caliente de modo que hierva suavemente. Agite continuamente. Cada 5 minutos tome con una pipeta Pasteur una gota y depostela sobre una excavacin en una placa de porcelana. Agrguele una gota de Lugol y anote el color que se produce. Contine calentando hasta que ya no se produzca color azul con la solucin indicadora de Lugol y, hasta que aparezca un color amarillo, lo cual indica que la hidrlisis se ha completado es total. Pase a un tubo de ensaye 1 ml de la disolucin hidrolizada que queda en el vaso, ajuste el pH a neutralidad con NaOH y verifique la reaccin de Benedict, en la cual se debe observar un color rojo lo que nos indica la presencia de AZUCARES REDUCTORES y por tanto corroborar la hidrlisis del polisacrido. 2. - Hidrlisis cida catalizada del almidn. En un vaso de precipitados coloque 10 ml de almidn agregue 3 ml de reactivo de Lucas (CUIDADO causa quemaduras graves), caliente durante 3 minutos de modo que la mezcla hierva suavemente, deje enfriar, tome una muestra y lleve a cabo la prueba de lugol. Enseguida neutralice con 8 ml de NaOH al 20% la solucin que queda en el vaso. De esta muestra neutralizada tome un mililitro y efecte la prueba de Benedict.

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3. - Hidrlisis enzimtica del almidn. En un vaso de precipitados coloque 5 ml aproximadamente de saliva SIN ESPUMA. Introduzca 3 ml de saliva en un tubo mantenido en bao de agua a 35-35 C y agregue rpidamente 2 ml de disolucin de almidn al 2 %. Cada 30 segundos tome del tubo una muestra de 0.5 ml, una gota utilsela para llevar a cabo la prueba de Lugol, y la cantidad que queda en la pipeta colquela en un tubo de ensaye para efectuar la prueba de Benedict, hasta terminar con la mezcla.

PRUEBAS CUALITATIVAS
1. - Prueba de Lugol. Color producido en la reaccin Presencia de almidn Significado en trminos de hidrlisis No hay hidrlisis Hidrlisis parcial Hidrlisis total

AZUL

ROJO

AMARILLO

2. - Prueba de Benedict Colocar en un tubo de ensaye volmenes iguales tanto de solucin problema como de Reactivo de Benedict. Tapar el tubo con papel aluminio y colocarlo en Bao Mara con agua hirviendo. La aparicin de un color ROJO indica la presencia de AZUCARES REDUCTORES SENCILLOS. Si a los 15 minutos no ha aparecido el color, significa que no hay azcares reductores en la solucin problema.

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PRESENTACIN DE RESULTADOS
Experimento nmero uno.- Hidrlisis cida del almidn
TIEMPO PRUEBA DE LUGOL (color producido) _________________ _________________ _________________ SIGNIFICADO EN TRMINOS DE HIDRLISIS ________________________ ________________________ ________________________

5 Min. 10 Min. Etc. ...

Resultados prueba de Benedict. __________________________________________ Tiempo requerido para la hidrlisis total del almidn. __________________________

Experimento nmero dos.- Hidrlisis cida catalizada del Almidn

Resultados prueba de lugol. _____________________________________________ Resultados prueba de Benedict. __________________________________________ En base a los resultados de sus pruebas, Indique el grado de hidrlisis del almidn. __________________________________ Tiempo requerido para la hidrlisis cida catalizada del Almidn. ________________

Experimento nmero tres.- Hidrlisis enzimtica del Almidn

TIEMPO PRUEBA DE LUGOL (color producido) ________________ ________________ ________________ ________________ PRUEBA DE BENEDICT (color producido) ____________________ ____________________ ____________________ ____________________ SIGNIFICADO EN TERMINOS DE HIDROLISIS _______________ _______________ _______________ _______________

30 Seg. 60 Seg. 90 Seg. Etc. ...

Tiempo requerido para la hidrlisis anzimtica del Almidn. ______________________ NOTA: Para detectar la presencia de azcares reductores se puede utilizar el reactivo de Benedict el reactivo de Nelson-Somogy.

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CUESTIONARIO
1. - Qu obtenemos como producto en la hidrlisis parcial y total del Almidn y de la Celulosa?

2. - Diga en forma clara, que diferencia presentan entre ellos los polisacridos abajo enlistados, adems de esquematizar y explicar su estructura y tipo de enlace que presentan. Celulosa Almidn Glucgeno 3. - Cul es el modo de accin de un catalizador ?. Explique.

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PRCTICA No 4

OBTENCIN DE LPIDOS Y DISTINCIN DE ALGUNAS DE SUS PROPIEDADES

INTRODUCCIN
Los lpidos son un grupo de sustancias que se definen en trminos de sus caractersticas de solubilidad. Son solubles en solventes orgnicos como: benzol, ter, acetona, tetracloruro de carbono, cloroformo y otros ms, son insolubles en agua, aunque algunos compuestos como los jabones, las sales biliares se dispersan coloidalmente en ella. Otros en cambio apenas son solubles en ter, entre ellos sobresalen los cerebrsidos, las esfingomielinas y las saponinas. Generalmente los lpidos se encuentran distribuidos en la naturaleza como steres de cidos grasos de cadena larga. Su hidrlisis alcalina(conocida como saponificacin) origina un alcohol y la sal de sodio o potasio de los cidos grasos constituyentes; estos productos de la hidrlisis pueden ser solubles en agua. Estos compuestos los podemos dividir en tres grandes grupos: 1. Lpidos simples. Comprenden los lpidos ms abundantes, grasas, triglicridos y las ceras, menos abundante. 2. Lpidos compuestos. Comprenden los fosfolpidos que contienen fosforo, y los galactolpidos que contienen galactosa. 3. Lpidos derivados. Comprenden productos de la hidrlisis de las dos primeras clases y otros compuestos, como estridos, aldehdos grasos, cetonas, alcoholes hidrocarburos, aceites esenciales, vitaminas liposolubles, etc., que son producidas por las clulas vivas. Desde el punto de vista cuantitativo, cabe sealar que el papel ms importante de los lpidos sea funcionar como combustibles aunque tambin ciertas clases de estos tienen funciones primordiales de estructura; en cierto sentido, los lpidos son superiores incluso a los carbohidratos como materia bruta para la combustin, pues durante sta proporcionan ms calor por gramo de substancia y, adems, puede almacenarse en el organismo en cantidades casi ilimitadas a diferencia e los carbohidratos.

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Tienen funciones de gran importancia como son: a) Como componentes estructurales de la membrana. b) Como formas de transporte y almacenamiento de combustible catablico. c) Como cubierta protectora sobre la superficie de muchos organismos. d) Como componente de la superficie celular relacionada con el reconocimiento de las clulas, la especificidad de especie y la inmunidad de los tejidos. Los grupos principales de los lpidos tienen caractersticas de solubilidad diferentes y sta propiedad se usa en su extraccin y purificacin a partir de materiales biolgicos.

OBJETIVO
Iniciar al alumno en las tcnicas de aislamiento de lpidos a partir de materiales biolgicos y separar dos grupos de lpidos importantes: Lecitina y Cefalina.

MATERIAL
A.- POR EQUIPO
6 Tubos de ensaye de 15 X 150 mm. 1 Pipeta Pasteur con goma 2 Vasos de precipitado 1 Agitador de vidrio 1 Gradilla 1 Embudo 1 Mechero Bunsen 1 Tripie 1 Tela de asbesto 1 Recipiente para baa maria 1 Piceta para agua destilada 1 Pinzas

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B.- POR GRUPO DE TRABAJO

1 Horno 1 Balanza analtica o granataria Papel filtro Hielo

REACTIVOS
Acetona Etanol Eter etlico Cloroformo Estos reactivos deben mantenerse perfectamente tapados y en recipientes secos.

MATERIAL BIOLGICO
A.- POR EQUIPO
* 1 Yema de huevo * 10 gr. de mantequilla ( margarina) * 10 gr. de aceite de olivo ( manteca de cerdo)

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PROCEDIMIENTO
1. EXTRACCIN Y SEPARACIN DE CEFALINA Y LECITINA DE HUEVO.
Separar la yema de huevo y colquela en un vaso de precipitados de 100 ml. Agregue al vaso de 15 a 20 ml de ter y agite suavemente con una varilla de vidrio para homogeneizar bien la mezcla. Aada lentamente sin dejar de agitar un volumen de acetona igual al de ter. Observar que la acetona provoca la precipitacin de los fosfolpidos, en tanto que las grasas y el colesterol permanecen disueltos. Despus de dejar la mezcla en reposo unos minutos, filtre a travs de papel filtro previamente pesado. El precipitado (que contiene cefalina y lecitina) se lava con 15 a 20 ml de alcohol fro, recibiendo el filtrado en un vaso seco y limpio previamente pesado. La lecitina es ms soluble en el alcohol fro, por lo tanto queda en el papel filtro nicamente cefalina. Extienda la cefalina obtenida con la varilla de vidrio sobre el papel filtro, luego colquelo sobre una hoja de papel dentro de una charola metlica. Introduzca en un horno a 50oC hasta que la cefalina est completamente seca. Se deja enfriar y se pesa. Para obtener la lecitina se coloca el vaso con el filtrado en un bao maria evaporando lentamente el alcohol. Luego se deja enfriar el vaso con la lecitina y se pesa.

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2. SOLUBILIDAD DE LOS LPIDOS.

a) Examine la solubilidad de los lpidos en agua y en los solventes orgnicos dados en el laboratorio; anote cuidadosamente las diferencias entre los grupos principales de lpidos. Use 2 ml de solventes en un tubo de ensaye para cada prueba de solubilidad. b) En base a las pruebas de solubilidad, coloque algunas gotas de uno de los lpidos ms solubles en un solvente dado, en un papel filtro y djelas secar. Observe el resultado colocando el papel filtro frente a una fuente de luz. c) Se separa una mezcla de aceite de olivo y lecitina (obtenida del experimento 1) de la siguiente manera: NOTA: Utilice la lecitina despus de pesarla. Aada al vaso, que contiene la lecitina 2 ml de aceite de olivo y agite vigorosamente. El experimento se lleva a cabo de la siguiente manera: En dos tubos de ensaye coloque 3 ml. de agua, agregue 10 gotas de aceite de oliva a uno de los tubos y al otro 10 gotas de la solucin de la lecitina disuelta en aceite de oliva previamente preparada. Mezcle vigorosamente cada tubo y compare la solubilidad.

RESULTADOS
Experimento 1. Reportar todos los datos de los pesos y en base a estos, calcular los rendimientos para cada uno de los fosfolpidos. Experimento 2. a) En forma de una tabla presente los resultados de las pruebas de solubilidad de los lpidos.

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CUESTIONARIO
1. Escribe la frmula de la Lecitina y la Cefalina. 2. Describe que efecto tiene la lecitina en la solubilidad del aceite de oliva y porqu. 3. Escribe la frmula estructural completa de un fosfolpido que posee una carga neta negativa, otro de carga positiva y otro de carga neutra a pH 7. Explique el porqu de su carga en cada caso.

4. Explica en detalle porqu al colocar una gota de solucin de lpidos en papel filtro queda una mancha al secarse.

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PRCTICA No. 5

CUANTIFICACIN ESPECTROFOTOMTRICA DE PROTENAS

INTRODUCCIN
Las Protenas son sustancias cuaternarias, sus unidades fundamentales son los aminocidos, los cuales pueden ser polares o no polares. Las protenas se dividen en simples, que se componen slo de aminocidos y conjugadas, que adems de aminocidos llevan un grupo prosttico que puede ser: metales, cidos nucleicos, carbohidratos o lpidos. En las protenas, cada aminocido est unido a los contiguos por un enlace peptdico de modo que el grupo amino de un aminocido se une con el grupo carboxlo de otro aminocido. Este enlace se efecta con la eliminacin de una molcula de agua. El producto de la condensacin constituye un pptido. Puesto que una protena est formada por la unin de numerosos aminocidos, ordenados segn todas las formas posibles, se deduce que el nmero de protenas que puede sintetizarse es muy grande, sabiendo que son veinte los aminocidos que podemos conjugar. Estas importantes macromolculas, son de sumo inters en el estudio y comprensin de la vida, desempean papeles fundamentales en las paredes celulares, membranas, parte lquida de las clulas y otras partculas y estructuras celulares as como en la sangre, tejido conectivo y msculos; adems actan como catalizadores enzimticos y hormonas que regulan muchos fenmenos que ocurren en el organismo.

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Usando el mtodo de Folin-Lowry las protenas reaccionan con el reactivo de Folin-Ciocalteu para dar un complejo coloreado. El color que se forma es debido a la reaccin del cobre alcalino con la protena, tal como sucede en el ensayo de Biuret y la reaccin del fosfomolibdato por la tirosina y el triptfano presentes en la protena. La intensidad depende del nmero de aminocidos aromticos presentes y cambiar segn la clase de protenas. La capacidad de un compuesto para absorber fotones depende de su estructura atmica, y en particular de la ordenacin de sus electrones que rodean el ncleo. El espectro de absorcin de un compuesto indica su capacidad para absorber la luz en funcin de la longitud de onda. En este caso la intensidad del color en la solucin va a determinar la cantidad de protenas. A mayor absorbancia, mayor intensidad del color y por lo tanto mayor cantidad de protenas.

OBJETIVO
Ensayar el desarrollo de una curva estndar con un mtodo indirecto para medir protenas.

MATERIAL
A.- POR EQUIPO
1 Pipeta de 1ml 1 Pipeta e 10 ml 1 Gradilla * 6 Tubos de ensayo de 15 X 150 mm. 1 Piceta para agua destilada

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B.- POR GRUPO DE TRABAJO

2 Espectrofotmetros 4 Celdas para espectrofotmetro

REACTIVOS
1. - Solucin alcalina de carbonato de sodio (Na2 CO3 20 g/lt en NaOH 0.1 mol/lt (2.5 litros). 2. - Solucin de sulfato de cobre -tartrato sodio potasio- (5 g/lt CuSO4 . 5 H2O en tartrato de sodio y potasio 10 g/lt). Preprese fresco, mezclando las dos soluciones preparadas por separado ( 100 ml). 3. - Solucin alcalina: Prepararse el mismo da de la prctica, mezclando 50 ml. de sol. 1 y 1 ml. de sol. 2. 4. - Reactivo de Folin-Ciocalteu. (Diluya el reactivo comercial 1:2 con agua destilada, el mismo da que se va a utilizar. Esta es una solucin de tungstato de sodio y molibdato de sodio en ac. Fosfrico y ac. Clorhdrico.).

MATERIAL BIOLGICO
Solucin de albmina 0.4 mg/ml.

PROCEDIMIENTO
Para hacer su curva estndar de protenas, se utilizan las siguientes concentraciones de albmina: Tubo 1 400 ug/ml (microgramos por mililitro) Tubo 2 200 ug/ml Tubo 3 100 ug/ml Tubo 4 50 ug/ml Tubo 5 CERO (tubo blanco)

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Se preparan las diferentes concentraciones de albmina de la siguiente manera. 1 ml. de albmina 400 ug/ml 1 ml de albmina 400 ug/ml + 1 ml de agua destilada, se agita bien. Tubo 3 1 ml de albmina 200 ug/ml del tubo 2 + 1 de agua destilada, se agita bien. Tubo 4 1 ml de albmina 100 ug/ml del tubo 3 + 1 ml de agua destilada, agitar. Luego se retira 1 ml. de albmina 50 ug/ml. del tubo cuatro. Tubo 5 1 ml de agua destilada. Despus de preparar las diferentes concentraciones de albmina, se procede con el mtodo de Folin-Ciocalteu. Se aade a los 5 tubos 5 ml de solucin alcalina. Se mezcla vigorosamente cada uno de los tubos y se dejan reposar a temperatura ambiente por un mnimo de 10 min. Agregue a cada tubo 0.5 ml. de reactivo diluido de Folin-Ciocalteu en forma rpida y agitando de inmediato. Despus de 30 minutos de reposo, con el tubo blanco se calibra el espectrofotmetro a "0" de absorbancia a una longitud de onda de 580 nm. Enseguida se mide la absorbancia d los tubos 4, 3, 2, 1. Tubo 1 Tubo 2

RESULTADOS
Reporte sus resultados en forma de una grfica, correctamente trazada, de la curva de protenas.

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CUESTIONARIO
1. En forma clara y detallada explique porqu se usa una longitud de onda de 580 nm para leer estas soluciones. 2. La cuantificacin de protenas puede llevarse a cabo por la absorbancia de luz UV?, Porqu?. 3. Por el mtodo de Folin-Ciocalteu una solucin de protenas tiene una absorbancia a 580 nm. Igual a 0.57. Utilice su curva estndar para calcular la concentracin de sta solucin. 4. Explique a detalle, porque a esa longitud de onda, la absorbancia del compuesto colorido es la mxima.

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PRCTICA No. 6

SEPARACIN DE PROTENAS
INTRODUCCIN
El que las protenas son sustancias bien definidas no fue completamente aceptado hasta despus de 1926, cuando James Sumner cristaliz por primera vez un enzima, la ureasa de la soja. Con anterioridad se crea que las elevadas masas moleculares de las protenas procedan de una agregacin coloidal o ms bien de sustancias misteriosas mal definidas de masas moleculares bajas. Una vez que se comprob que era posible, en principio, el purificar las protenas comenz seriamente el trabajo para conseguirlo. La separacin de protenas se fundamenta en su carga elctrica y sta depende directamente de sus propiedades cido-bsicas, las cuales estn determinadas por el nmero y los tipos de grupos R ionizables de sus cadenas polipeptdicas. Las protenas son portadoras, en general, de numerosos grupos ionizables que exhiben una variedad de valores de pK. Cada protena muestra un valor de pH caracterstico en el que las cargas positivas de la molcula se contrarrestan exactamente con las cargas negativas. A este valor de pH, que es el punto isoelctrico, la molcula no es portadora de carga neta. Este es el punto en donde presenta su menor solubilidad, aunque bien podemos precipitarla y separarla en las proximidades de su pI. En el caso de la casena o protena de la leche, el principio de la separacin est dado por la precipitacin que sufre la mayora de las protenas en su punto isoelctrico. En este caso el pH al cual se precipitan la casena es de 4.8. Adems, la casena es insoluble en el alcohol, lo que facilita su separacin de las grasas lcticas. En cuanto a la clara de huevo, las protenas pueden ser separadas en base al mismo principio utilizando (NH4)2SO4 a saturacin.

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OBJETIVO
Extraccin de las protenas de la leche y de la clara de huevo para su cuantificacin en gramos.

MATERIAL
A.- POR EQUIPO
1 Vaso de precipitados de 250 ml 1 Vaso de precipitados de 100 ml 1 Agitador de vidrio 1 Mechero de Bunsen 1 Tripie 1 Tela de asbesto 1 Embudo 1 Piceta para agua destilada 1 Pipeta de 10 ml 1 Pipeta Pasteur con goma 1 Tela magitel 1 Gradilla 1 Probeta de 100 ml

B.- POR EQUIPO DE TRABAJO

1 Centrfuga 2 Tubos para la centrfuga 1 Termmetro 1 Papel filtro 1 Horno 1 Balanza granatara o analtica

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REACTIVOS
Ac. Actico al 1% (1.5 litros) Solucin saturada de (NH4)2SO4 2 litros) Etanol al 95 % (600 ml) Eter etlico (600 ml)

MATERIAL BIOLGICO
A.- POR EQUIPO
* 100 ml de leche * 1 huevo

PROCEDIMIENTO
EXPERIMENTO No 1. SEPARACIN DE CASENA.
NOTA. Cada equipo de trabajo deber llevar a cabo el experimento usando leche de diferente procedencia. En un vaso de precipitados de 250 ml coloque 100 ml de leche y en otro vaso de 100 ml coloque 100 ml cido actico. Ambas soluciones se calientan hasta alcanzar una temperatura de 40o C. Despus aada lentamente el cido actico a la leche agitando continuamente. Verifique el pH, deje enfriar la mezcla para filtrarla a travs de la tela magitel. Lave el precipitado con agua destilada. Agregue el precipitado a un vaso conteniendo 20 ml de etanol. Filtre con papel filtro previamente pesado, y lave el precipitado con una mezcla de 10 ml de etanol y 10 ml de ter.

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Se lava por segunda vez el precipitado con 20 ml de ter. Al trmino de esto, extienda la protena obtenida sobre el papel filtro, luego colquelo sobre una hoja de papel dentro de una charola metlica. Introduzca la charola en un horno a 50o C hasta que la casena este completamente seca. Se deja secar y se pesa.

EXPERIMENTO No 2. SEPARACIN DE ALBMINA

Separe la clara de un huevo y mida su volumen en una probeta. Coloque la clara en un vaso de precipitados y adale un volumen igual de (NH4)2 SO4 saturado. Agite hasta que las protenas precipiten. Coloque en tubos de centrfuga a 3000 rpm. Por 10 minutos y descarte el sobrante. Lave el precipitado aadiendo a cada tubo 3 ml de (NH4)2 SO4 y centrifugue de nuevo. Deseche el sobrante. Pese el precipitado obtenido.

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RESULTADOS
EXPERIMENTO No 1
a) Reportar todos los datos de los pesos, y con base en estos, calcular el rendimiento de casena en g/lt b) Reportar el pH al cual se llev a cabo la precipitacin de casena.

EXPERIMENTO No 2
Reportar todos los datos de los pesos, y con base en stos, calcular el rendimiento de la albmina de clara de huevo en g/lt.

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CUESTIONARIO
1. En la separacin de protenas. Qu importancia tiene el pI(punto isoelctrico)? 2. Las sales de (NH4)2 SO4 precipitan las protenas. En forma clara y concisa explica porqu. 3. Qu protenas y en que porcentaje se encuentran en la clara de huevo? 4. De acuerdo a su funcin biolgica. Cuntos tipos de protenas existen, dnde y cmo actan?. Mustrelo en forma de tabla.

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BIBLIOGRAFIA
(Existente en la biblioteca de la Facultad de Biologa)

Harvey, Champe, Ferrier. 2006. Bioqumica. 3a ed. Mc Graw HillInteramericana. Mxico, D.F. (1 ejemplar). Laguna, Jos y Pia Zarza, Enrique. 2002. Bioqumica. Manual Moderno- UNAM. Mxico, D.F. (3 ejemplares). Lehninger. 1995. Bioqumica. 2a ed. Ediciones Omega. Barcelona, Espaa. (5 ejemplares). Mathews, Van Holde. 2002. Bioqumica. 3a ed. Pearson-Addison Wesley. Madrid, Espaa. (4 ejemplares). McKee, Trudy; McKee, James R. 2003. Bioqumica. 3a ed. Mc Graw Hill- Interamericana. Madrid, Espaa. (13 ejemplares). Stryer, Lubert. 1995. Bioqumica. Editorial Revert. Espaa. (7 ejemplares). Voet D. y Voet G. J. 2004. Bioqumica. 3a ed. Panamericana. Buenos Aires, Argentina. (1 ejemplar).

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