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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAITAJA- UNIVALI CURSO DE FARMCIA/CCS NCLEO DE INVESTIGAES QUMICOQUMICO-FARMACUTICAS NIQFAR PROGRAMA DE MESTRADO EM CINCIAS FARMACUTICAS - PMCF
Mtodos cromatogrficos
A cromatografia: cromatografia: um mtodo fsicofsico-qumico de separao dos componentes de uma mistura, realizada atravs da distribuio destes componentes entre duas fases, que esto em contato ntimo. ntimo. 1903 - Botnico russo, Mikhail Semyonovich Tswet - Separao de pigmentos de plantas em zonas de cores distintas. - (Cromatografia no ficou limitada a compostos coloridos, mas o termo original foi mantido)
FASE ESTACIONRIA Camada de alta rea superficial FASE MVEL Solvente ou Mistura que passa atravs, sobre ou ao longo da fase estacionria. estacionria. A SEPARAO BASEADA EM: Velocidades diferenciais de movimento na FM de diferentes espcies (macromolculas ou ons)
Cromatografia
Planar
Coluna
F.M. Lquida
F.M. Gasosa
F.M. Lquida
C.Papel
C.Centrifuga
C.Camada Delgada
C. Gasosa
CC
CLAE
Spots
bandas
retngulos
4) Seleo da Fase Mvel O Solvente utilizado possui papel fundamental na separao dos componentes. componentes. Existe uma competio entre as molculas da amostra e da fase mvel, pela superfcie adsorvente, portanto consideraconsidera-se a natureza qumica da amostra e a polaridade da fase mvel mvel. .
4 REVELAO Pode ser por mtodos fsicos ou qumicos. Compostos UV-ativos, que aparecem como manchas escuras em fundo fluorescente, se a placa for iluminada com lmapada de luz ultravioleta (Mtodo fsico) Quase todas as classes de substncias orgnicas (exceto alcanos e haletos alifticos) reagem com iodo formando complexos. A formao desses complexos reversvel. As placas tambm podem ser borrifadas com outros reveladores (cido sulfrico/metanol, vanilina sulfrica, tricloreto de antimnio, permanganato de potssio/cido sulfrico, etc.). (Mtodo qumico)
Reveladores Biolgicos Biolgicos: : Utiliza-se reaes enzimticas ou bacterianas para tornar a mancha visvel.
Placa de slica, eluda com diclorometano:metanol (97:3). A placa foi borrifada com soluo esporos de fungos e, onde apareceram manchas brancas porque houve inibio dos fungos pelas substncias contidas nos extratos de uma planta.
Anlise Qualitativa
A anlise qualitativa com CCD, consiste na determinao do Rf e sua comparao com Rf de padres padres. .
CH3 O OH
OH
Amostra: 10l a 3mg/mL Revelador: anisaldedo sulfrico. Padro: Mirigalona G Cortesia (IC): Paola Leoni
Anlise Quantitativa
A CCD pode ser utilizada para quantificao quantificao. . RetiraRetira-se da cromatoplaca a rea que contenha a substncia desejada que extrada e quantificada quantificada. . Freqentemente, utiliza utiliza-se a densitometria, medidas de fluorescncia e radioatividade radioatividade. .
HPTLC High Performance Thin Layer chromatography uma tcnica moderna, instrumental e de alta performance, onde a avaliao feita atravs de equipamentos e software
TLC Scanner 3: Todas as funes so controladas pelo computador. A nica operao manual a insero
do objeto a ser escaneado
Reich E, and Widmer V. Planta Med .75: 711718, 2009. Srinivas, et. al., J. Planar Chrom. 20 (1), 7374, 2007.
CAMAG TLC-MS Interface: The versatile instrument to extract compounds from a TLC/HPTLC plate and feed into a mass spectrometer for substance identification or structure elucidation. CAMAG TLC-MS Interface can be connected to any brand of LC-coupled mass spectrometer
http://www.patentstorm.us/patents/6156196/description.html H. Luftmann, M. Aranda, G. Morlock, Rapid Commun Mass Spectrom 21 (2007) 3772 M. Aranda, G. Morlock, Rapid Commun Mass Spectrom 21 (2007) 1297 M. Aranda, G. Morlock, J Chromatogr A 1131 (2006) 253 M. Aranda, G. Morlock, J Chromatogr Sci 45 (2007) 251 U. Jautz, G. Morlock, Anal Bioanal Chem 387 (2007) 1083
COLUNA Tubo cilndrico com estrangulamento numa das extremidades. Geralmente de vidro. O tamanho vai depender da quantidade de material a ser separado. CARACTERSTICAS Tcnica simples, no exige instrumentao sofisticada, boa para fins preparativos. USOS - Utilizada em laboratrios para separar e purificar reagentes e materiais obtidos por snteses. - Em lab. de produtos naturais em escala preparativa e analtica TCNICAS GERAIS 1 ESCOLHA DO ADSORVENTE (Depende da caracterstica da amostra) 2 ESCOLHA DO ELUENTE (Atravs da CCD) 3 EMPACOTAMENTO DA COLUNA (FE na forma de soluo com vibrao) 4 ELUIO (por gotejamento pela fora da gravidade)
Sistemas pressurizados
Low-pressure LC (ca. 5 bar/75 psi/0.5 MPa); Medium-pressure LC (ca. 520 bar/75300 psi/0.22.0 MPa); High-pressure HPLC (>20 bar/300 psi/2.0 MPa).
Um qumico na dcada de 1950
CROMATOGRAFIA FLASH FLASH: : baixa presso (30-75 psi) til para uma separao preparativa rpida com boa resoluo. Tradicionalmente era realizada com slica gel mas atualmente, o uso de cartuchos de fase reversa tornou-se bastante comum. Vantagens: Baixo custo Fcil montagem Fcil empacotamento Rapidez de eluio Boa resoluo
HO
OH
Vantagens: Simples operao rpida separao Baixo consumo de solvente Placa pode ser reutilizada Gradiente se Eluio Desvantagens: Fase estacionria restrita Resoluo limitada Placas comerciais no viveis economicamente www.tsqtech.com
Kolak, U. Turk J. Chem. 31,363 369, 2007.
Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE) High Performance Liquid Chromatography (HPLC) um tipo de cromatografia lquida que emprega pequenas colunas, recheadas de materiais especialmente preparados e uma fase mvel que eluda sob altas presses. (>20 bar/300 psi/2.0 MPa).
Requer que a amostra seja solvel na fase mvel. USOS: - Na separao de espcies inicas ou macromolculas de interesse biolgico e produtos naturais. - Imensa variedade de outros compostos de alta massa molecular e/ou baixa estabilidade trmica. Ex.: aminocidos, explosivos, lipdeos polares, metablicos de animais e plantas, pigmentos de plantas, polmeros sintticos polissacardeos, produtos farmacuticos, protenas e tintas. - Os mtodos de deteco utilizados em CG so mais rpidos e sensveis, a aparelhagem mais fcil de ser manipulada e em geral mais barata. - no existem competies entre a CLAE e a CG, so tcnicas que se complementam e geralmente analisam diferentes tipos de amostras.
10-deacetylbaccatin III Baccatin III 7-xylosyl-10-deacetyltaxol B Taxinine M 7-xylosyl-10-deacetyltaxol 7-xylosyl-10-deacetyltaxol C 10-deacetyltaxol 7-xylosyltaxol Cephalomannine (Taxol B) 7-epi-10-deacetyltaxol Paclitaxel Taxol C 7-epitaxol
Analticas
Column: Alltima CN, 3m*, 250 x 4.6mm (Part No. C-6000B) Mobile Phase: Methanol:Acetonitrile:Water (25:22:53) Flowrate:0.8mL/min Detector:UV at 227nm
Preparativas
Semi-preparativas
FASES ESTACIONRIAS: ESTACIONRIAS: Cromatografia lquidolquido-lquido e com fase ligada (CLFL) A superfcie da slica o suporte mais popular, que pode ser modificado por uma dessas reaes: Fase Reversa formao do ster silicato (Si-O-R) por reao do grupo silanol com um lcool: Si-OH + ROH Si-O-R + H2O formao da ligao siloxano (Si-O-SiR) por reao do grupo silanol com um organoclorosilano: Si-OH + R3SiCl ----> Si-O-Si-R3 + HCl formao da ligao silcio-carbono pelo tratamento do grupo silanol com cloreto de tionila e, em seguida, com um composto organometlico: Si-OH + SOCl2 ----Si-Cl + RLi ----Si-Cl + HCl + SO2 Si-R + LiCl
rea a = y/ x
Concentrao Determinaes quantitativas - Curvas de calibrao - Integral da rea - Equao da reta >>>>
y = ax + b
atenolol
16 min
19 min
16 min
Grfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA Idealmente: cada substncia separada aparece como um PICO no cromatograma.
Determinaes qualitativas:
Utilizao de padres para comparao mesmas condies uso de padres internos
10
Area mean
1 2
Concentration (mg/100g)
120 100 80 60 40 20 0
Figure 2: Concentrations of 1 in different parts and seasons of E. mosenii (mg/100 g dried plant)
A cromatografia contracorrente de gotas (DCCC: (DCCC: droplet countercurrent chromatography chromatography) ): uma
forma de cromatografia de partio lquido-lquido sem o uso de adsorvente. Esta tcnica consiste na utilizao de duas fases lquidas imiscveis, onde uma a fase mvel e a outra, a fase estacionria. A distribuio do soluto em cada uma das fases determinada atravs de seus respectivos coeficientes de partio.
Foucault and Chevolot . Journal of Chromatography A, 808, 322, 1998. Hostettmann and Marston . Phytochemistry Reviews. 1: 275285, 2002. Sticher, O. Nat. Prod. Rep., 25, 517554, 2008.
LC-MS-MS: Cromatografia lquida acoplada a espectrometria de massas em seqncias (MS/MS ou Tandem Mass Spectrometry) Introduo da amostra diretamente, com fluxo (1 mL/min. A 1 mL/min.) LC-NMR: Cromatografia lquida acoplada a Ressonncia Magntica Nuclear
Lanas et al., Quim. Nova, Vol. 27, No. 5, 747-753, 2004 Chiaradia et al., Quim. Nova, Vol. 31, No. 3, 623-636, 2008
Wolfender J. et al., Planta Med. 75, 719-734, 2009. Marston et al., Planta Med . 75: 672682, 2009.
LC-MS-MS: Cromatografia lquida acoplada a espectrometria de massas em seqncias (MS/MS ou Tandem Mass Spectrometry)
Kooy F. et al., Planta Med. 5, 763775, 2009. Wolfender J. et al., Planta Med. 75, 719-734, 2009.
PERCEPO
DECISO
Persistncia
Criatividade
2007
2009
2010
Farmcia
Niero 02/03/07
Itaja
Balnerio Cambori