CAPITULO 18

TECNICAS ESPECTROPOLARIMETRICAS: ROTACION OPTICA Y DICROISMO CIRCULAR

Dr. Joan Estelrich

TECNICAS ESPECTROPOLARIMETRICAS: ROTACION OPTICA Y DICROISMO CIRCULAR

18.1. ACTIVIDAD OPTICA

La dispersin rotatoria ptica y el dicroismo circular son dos tcnicas espectropolarimtricas basadas en dos fenmenos, la rotacin ptica y la elipticidad, que no son sino dos formas de manifestacin de una misma propiedad fsica que presentan algunas sustancias: la actividad ptica. En trminos generales se dice que la actividad ptica es un fenmeno fsico por el que una sustancia hace rotar el plano de polarizacin de un haz de luz plano-polarizada que pasa a su travs. La propiedad que determina si una sustancia es pticamente activa es su asimetra. Una molcula tiene actividad ptica si no puede superponerse a su imagen especular. Las molculas que tienen esta propiedad son las que no poseen ninguna rotacin impropia entre sus elementos de simetra. Una rotacin impropia es una rotacin compuesta: un objeto la posee si es indistinguible despus de una rotacin n-ple seguida de una reflexin horizontal. Esta operacin compuesta se representa por S n (por ejemplo la posee el metano). Cuando se determinan los elementos de simetra de una molcula es preciso tener en cuenta los ejes de rotacin impropia que puedan hallarse implcitos, ms que explcitos, en el grupo. Por ejemplo, los grupos C nn incluyen oculto a Sn porque incluyen a Cn y Fn. Cualquier grupo que incluya la inversin como elemento, tambin posee, al menos, el elemento S2, porque una inversin es equivalente a una rotacin de 180 seguida de una reflexin Fn. Por tanto, se deduce que las molculas con centros de inversin no pueden ser pticamente activas. La actividad ptica es una propiedad de algunas sustancias orgnicas y de casi todas las molculas biolgicas. La actividad ptica es una propiedad tan relacionada con la vida (nuestro concepto de vida) que su presencia es uno de los principales criterios empleados para dilucidar, por ejemplo, si los meteoritos contienen evidencia de vida de alguna parte del universo. La actividad ptica, por otra parte, puede ser inducida por un campo magntico externo ( efecto Faraday). En este caso, la longitud de onda en donde aparece el mximo o el mnimo en las curvas DRO y DC depende de la sustancia, si bien la magnitud del efecto Faraday depende tanto de la sustancia que atraviesa la radiacin como de la intensidad del campo magntico aplicado. Tal como se ha indicado anteriormente la luz es una onda electromagntica consistente en un campo elctrico (E) y un campo magntico (B ) oscilantes. Ambos son perpendiculares entre si y perpendiculares a la direccin de propagacin. El plano que contiene el vector E se conoce como plano de polarizacin . La luz plano-polarizada es aquella que se transmite y oscila con un nico plano de polarizacin y sigue la ecuacin: E = E0 sin t i donde i es un vector unitario en la direccin x y = 2 es la frecuencia circular de la luz. Si en el espacio coinciden dos rayos luminosos polarizados, de igual frecuencia y velocidad, es decir dos rayos coherentes, se produce la interferencia entre ellos. El vector elctrico de la radiacin resultante se obtendr sumando vectorialmente las componentes elctricas, en cada instante, de las dos radiaciones. El desfase existente entre los rayos que interfieren condiciona la forma del rayo resultante. A continuacin se van a determinar cuatro tipos de interferencias en funcin del desfase. En la figura 18.1. se muestra la interferencia entre dos rayos en igualdad de fase que estn polarizados en planos perpendiculares entre si. Los vectores resultantes estn situados en un plano que forma un ngulo de 45 respecto a los planos originales. En la figura 18.2. se muestra el caso en que las dos radiaciones estn en oposicin de fase, es decir, que difieren entre si, media longitud de onda. La resultante es un rayo polarizado, de plano perpendicular al del caso anterior. En estos casos en los que la luz no vara de plano de polarizacin a lo largo del tiempo se dice que la luz es plano-polarizada.

Figura 18.1.- Interferencia entre dos rayos en igualdad de fase que estan polarizados en planos perpendiculares entre s.

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Figura 18.2.- Interferencia entre dos rayos en oposicin de fase.

Si la diferencia de fase es de 1/4 de longitud de onda (figura 18.3), el vector resultante sigue una trayectoria helicoidal que observada de frente presenta forma de circunferencia; en este caso se dice que la luz est polarizada circularmente , a la derecha, si el vector E rota como las agujas del reloj, y a la izquierda, si lo hace al contrario. Con otras diferencias de fase, o con composiciones de ondas de magnitudes variables, se obtienen vectores resultantes cuya trayectoria helicoidal, vista de frente, es una elipse, en este caso se tiene luz polarizada elpticamente (figura 18.4). De la misma manera que la luz polarizada circularmente se obtiene de la composicin de dos ondas de luz plano-polarizadas, si se superponen dos ondas polarizadas circularmente, una derecha y la otra izquierda, ambas de igual fase, el resultado es luz plano-polarizada, porque en cualquier punto del espacio el vector E ser la suma de los vectores que definen la velocidad angular de la luz polarizada circularmente a uno y otro lado. As la luz plano-polarizada puede considerarse como el resultado de la superposicin de dos componentes, derecha e izquierda, de dos ondas igualmente polarizadas circularmente y que tienen el siguiente valor: ER = 2 (E0 sin t i + E0 cos t j) EL = 2 (E0 sin t i - E0 cos t j) donde i, y j son los vectores unitarios en las direcciones x e y respectivamente; = 2 es la frecuencia angular de la luz.

Figura 18.3.- Interferencia entre dos rayos desfasados 1/4 de longitud de onda.

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Figura 18.4.- Vectores resultantes de la interferencia de dos rayos segn la diferencia de fases.

18.2. ROTACION OPTICA Y ELIPTICIDAD

Cuando un haz de luz pasa a travs de la materia, el campo elctrico E de la onda interacciona con los electrones de los tomos que la componen. Tal interaccin se manifiesta en dos aspectos: en primer lugar la velocidad de propagacin de la luz se reduce, este hecho se conoce como refraccin y se mide mediante el ndice de refraccin , n (relacin entre la velocidad de la luz en el vaco y velocidad que presenta la luz cuando atraviesa una sustancia) (Apartado 2.4). Por otra parte, el rayo de luz puede experimentar una disminucin de intensidad a ciertas longitudes de onda, en este caso ha habido absorcin de la radiacin por parte de la materia (Apartado 2.3), y este tipo de interaccin se mide por el coeficiente de absorcin molar, , de la sustancia. Ambos parmetros n y , dependen de la longitud de onda de la radiacin. Si se ha empleado un haz de luz no polarizada, la simple refraccin y absorcin son los nicos efectos que se pueden detectar de la citada interaccin tanto si la molcula tiene como si no tiene actividad ptica. Si se emplea luz polarizada ya se puede distinguir entre molculas pticamente activas y las que no lo son. Cuando una radiacin plano polarizada interacciona con una sustancia sin actividad ptica, sta retarda por igual las dos componentes (R y L) de la luz polarizada, es decir, que los ndices de refraccin de las dos componentes tendrn el mismo valor (n L = n R). Por otra parte, si la longitud de onda de la radiacin es la apropiada, la substancia puede absorber parte de la radiacin y si no es una substancia pticamente activa, las dos componentes absorbern la misma cantidad ( R = L) y ahora la amplitud de la onda electromagntica polarizada tendr un tamao menor pero continuar oscilando en el mismo plano (figura 18.5.A). Sin embargo, si la substancia pticamente activa no retarda de la misma manera las componentes R y L de la onda polarizada, esto es, presenta diferentes valores de ndice de refraccin (n L n R), cuando la luz abandone la substancia presentar un desfase entre las dos ondas sinusoidales (figura 18.5.B). En consecuencia, el vector E del haz emergente formar un cierto ngulo respecto al que formaba antes de interaccionar con la materia. El ngulo que el vector E ha rotado se conoce como ngulo de rotacin ptica y es proporcional al nmero de molculas con las que la radiacin interacciona, por tanto, la rotacin ptica podr modificarse de dos maneras: a) Variando la trayectoria ptica a travs de la muestra. b) Variando la concentracin de la substancia pticamente activa. La rotacin ptica tambin depende de la longitud de onda de la radiacin incidente y de la temperatura. Al pasar a travs de un espesor d' de una substancia pticamente activa, uno de los componentes de la luz adquiere una ventaja sobre la otra, que expresada en tiempo valdr: t = e/v; e = d'; v = c/n

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Figura 18.5.- Diferencias entre rayo emergente que pasa por un medio que retarda por igual ambos componentes (A) y el que pasa por un medio que los retarda de forma desigual (B).

La diferencia de tiempos ser: t - t' = (n L - n R) d'/c Esta diferencia de tiempos equivale a una diferencia de fase = (t - t') = 2 (n L - nR) d'/c = 2/ vac (n L - n R) d' {rad} la diferencia n L - nR recibe el nombre de birrefringencia circular . Como se observa, el resultado es una diferencia de fase que es proporcional a la birrefringencia circular. La diferencia de fase permanece fija despus de que la luz ha abandonado el medio pticamente activo. As, la luz continua siendo linealmente polarizada, pero ahora el plano de polarizacin ha rotado un ngulo (ngulo de rotacin): = /2 = 180/ vac (n L - nR) d' {rad} respecto a la direccin previa a la entrada del medio pticamente activo. vac es la longitud de onda de la radiacin en el vaco. A partir del valor de rotacin ptica puede deducirse la rotacin ptica especfica que es una propiedad caracterstica de la materia. A una temperatura y determinadas puede definirse como: []T = /cd {grd cm3/g dm} donde, c es la concentracin en g/cm 3 y d la longitud, expresada generalmente en dm -actualmente tambin se expresa en cm-, que el haz de luz debe atravesar de muestra. Si se expresa en base molar se tiene la rotacin molar []T = M/100 []T = (M/100) /c d {grd cm2/decimol} Con polmeros, la referencia a la masa molecular de la molcula entera es inadecuada. La comparacin se hace sobre la base del peso molecular de la unidad repetitiva, que en el caso de heteropolmeros, como las

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protenas, es un valor promedio, por ejemplo el peso del residuo medio de las protenas (M 0). La rotacin molar del peso del residuo medio [m] es: [m]T = (M0/100) /cd La rotacin ptica es tambin dependiente del ndice de refraccin del solvente a la longitud de onda . Las rotaciones observadas en una variedad de solventes se reducen a un valor comn por medio del factor de Lorentz. As, la rotacin molar reducida [m'] ser: [m']T = 3/(n 2 + 2) (M0/100) /cd El otro aspecto de la interaccin entre la luz plano polarizada con un medio pticamente activo es la diferencia de intensidad de luz absorbida por una componente respecto a la otra ( L R). Ahora, el vector E de cada componente no slo difiere en velocidad angular sino tambin en tamao (figura 18.6.).

Figura 18.6.- Polarizacin elptica resultante de la diferente absorcin de las dos componentes de la luz (RH y LH).

La polarizacin de la luz que abandona la materia es elptica. Un parmetro que define este tipo de polarizacin es la elipticidad , que se define como el arco de la tangente de la relacin entre los semiejes de la elipse (figura 18.7.). = arctg b/a siendo b, el semieje menor de la elipse i a el mayor. Segn la figura: b = |ER| - |EL| a = |ER| + |EL| Segn la ley de Lambert-Beer, la transmisin es proporcional a1 cuadrado de la longitud del vector elctrico: A() = () cl = log (E0()2/E'()2) A = absorbancia a una determinada = coeficiente de absorcin molar c = concentracin en moles/litro l = longitud del paso de luz a travs de la muestra en cm E0 = longitud del vector elctrico de la luz incidente E' = longitud del vector elctrico de la luz emergente

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Figura 18.7.- Representacin geomtrica de la elipticidad ( ).

-A = log (E'2/E02) A = - log T; -A = log T igualando (Ec. 18.1.) y (Ec. 18.2.): log T = log (E'2/E02) log T = (log E'2/E02) segn esto, se puede deducir que
T = K' E 2 ; T = KE'

(Ec. 18.1.) (Ec. 18.2.)

(K =

K'

)
TL TR

tg = b / a = K TL K TR

) / (K

= arctg b/a
TL + K TR

) =(
TL

)/(

TL + TR

multiplicando numerador y denominador por ( TL + TR ), queda

tg = ( TL TR ) / TL + TR + 2

TR

como las diferencias entre TL y TR son muy pequeas (TL TR T )

tg = (TL - TR ) / 4T = T / 4T

y como el ngulo es pequeo, si se expresa en radianes tg

= T / 4T

(Ec. 18.3.)

y por otra parte,

log T = 2 - A

log(T + T) = 2 - A

Empleando la expansin para una serie de Taylor, se obtiene para los primeros trminos de la expansin:

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ln (T + T) = ln T + T/T

Pasando a logaritmos decimales

log(T + T ) = log T + ( T / T ) 2,303

Calculando la diferencia
log(T + T) - log T = (2 - A ) - (2 - A) = A - A = log T + ( T / T) 2,303 - log T
A - A= T/T 2,303

(Ec. 18.4.)

reordenando (18.3.) y (18.4.):

T / T = (A A ' ) 2,303

A 2,303 = 4

T/T = 4

= 2,303 A / 4 {rad}
Pasando de radianes a grados = 2,303 (AL - AR) 180/4 = 33,00 (AL - AR) La diferencia de absorbancias (AL - AR) se conoce como dicroismo circular. Para la elipticidad se ha introducido un formalismo semejante al realizado para la rotacin ptica. Las expresiones resultantes para la elipticidad especfica, la elipticidad molar, y, en el caso de los polmeros, la elipticidad del peso del residuo medio, tienen la misma simbologa: [ ]T T = /cd = (M/100) /cd T = (M0/100) /cd
T

Los parmetros de elipticidad generalmente no se corrigen con el factor de Lorentz.

18.3. DISPERSION ROTATORIA OPTICA I DICROISMO CIRCULAR

Los valores de elipticidad y de rotacin ptica dependen de la longitud de onda de la radiacin que interacciona con la materia. Un grfico que muestre la variacin de la rotacin ptica de una sustancia con la se conoce como dispersin rotatoria ptica , y el que muestra la variacin de la elipticidad con la es un espectro de dicroismo circular. Para un compuesto que es pticamente activo pero que no contiene ningn cromforo, esto es, no absorbe luz a la longitud de onda empleada en la determinacin, la rotacin ptica decrece en valor absoluto cuando aumenta la longitud de onda. De esta manera se obtienen las curvas plano-positivas o plano-negativas. Una curva plana es positiva si la rotacin ptica aumenta al disminuir la . En el caso contrario es negativa. (En la figura 18.8. se observan ejemplos de curvas tpicas de DRO).

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Si una sustancia adems de ser pticamente activa presenta absorcin en la zona de longitudes de onda empleada, se obtienen curvas con efecto Cotton. Un efecto Cotton es positivo (figura 18.9) si al ir hacia ms pequeas, los valores de rotacin ptica toman primero valores positivos y luego negativos.

Figura 18.8.- Ejemplos de curvas tpicas de dispersin ptica rotatoria: Curva A, curva plana positiva; Curva B, curva plana negativa.

En la curva con efecto Cotton (figura 18.9) debe distinguirse, la longitud de onda del pico o valor mximo positivo que la curva presenta, la longitud de onda a la que se presenta el valle o mximo valor negativo, la longitud de onda en la que la curva invierte su signo ( o) y la amplitud molecular (a en la figura) que es la distancia existente entre el pico y el valle, y la factor de amortiguacin (Gi ), que es la diferencia en longitud de onda entre el mximo y el mnimo.

Figura 18.9.- Curvas DRO, DC y UV de un derivado de la gitingensina.

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La magnitud del efecto Cotton en los espectros DRO o de las bandas en los espectros de DC viene definida por el parmetro llamado fuerza rotacional , R, que en un efecto Cotton vale: R = (h c/96 N) (a Gi/i) h = constante de Planck c = velocidad de la luz N = Nmero de Avogadro a = amplitud del efecto Gi= factor de amortiguacin (distancia entre la longitud de onda en donde se encuentra el mximo y la que presenta el mnimo) i =longitud de onda en donde se produce la inflexin Si se determina la variacin de elipticidad en una zona en la que no hay absorcin, no se obtiene ningn valor de elipticidad. Por contra, cuando la determinacin se hace en un intervalo de longitud de onda en donde se produce absorcin de la radiacin, se obtiene una variacin de la elipticidad en funcin de la , lo cual constituye el espectro de dicroismo circular (figura 18.10).

[ ] o

Figura 18.10.- Espectro de dicroismo circular .

En un espectro de DC deben distinguirse: - la longitud de onda (o) donde aparece el mximo o el mnimo de la curva. - el valor de mxima o mnima elipticidad [0] - la semianchura de la banda ( )cuando el valor de la elipticidad es igual a [0]/2 En un espectro DC y para banda gaussiana, la fuerza rotacional es

R = 4,118 10-57 []

[] = elipticidad molar en el mximo de la banda centrada en la longitud de onda 0 = intervalo de longitudes de onda entre 0 y la longitud de onda a la que el valor de [] ha descendido hasta [0]/2 La fuerza rotacional describe la intensidad de una banda DC y, en parte, informa fsicamente acerca del movimiento de los electrones cuando un centro absorbente es elevado desde el estado fundamental hasta un estado excitado por la absorcin de la luz. Por otra parte, la fuerza rotacional mide el rea bajo la curva de la banda DC. Relacionada con la fuerza rotacional hay un regla fundamental: el valor de R no es nulo en una sustancia pticamente activa. Tanto el espectro DC como el de DRO estn ntimamente relacionados con el espectro de absorcin de la molcula a estudio. Esto se debe a que las transiciones electrnicas implicadas en los tres fenmenos son las mismas. Algunas de las transiciones electrnicas interaccionan con el entorno local y cada una de ellas tiene una componente DRO y DC en el espectro. La relacin entre el espectro DRO y el DC se observa en la figura 18.11. que muestra ambos espectros en una zona del espectro en donde existe una banda de absorcin aislada (por ejemplo una transicin * ). En la parte superior se muestra el espectro de absorcin en esta zona. A continuacin est el posible espectro DC que puede presentar una curva positiva o negativa, pero que su mximo ms o menos coincide con el de absorcin. Fuera de las regiones de absorcin el valor de la elipticidad es nulo, esto es razonable puesto que [] es proporcional a L - R y, tanto L como R son nulos. En la regin de absorcin, [ ] tiene la misma forma que el espectro de absorcin aunque puede tener signo positivo o negativo. Tanto el signo como la intensidad de cada banda DC son funciones sensibles a la estructura molecular.

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Figura 18.11.- Relacin entre los espectros DRO y DC. a) Espectro de absorcin. b) y c) Lnea continua: espectro DC; lnea discontnua: espectro DRO.

La lnea discontnua de la figura central e inferior muestra el espectro DRO correspondiente. Es evidente que la curva DRO se asemeja a la primera derivada de la curva DC. Existe un punto de rotacin ptica cero (punto de inflexin de la curva) que es coincidente con un mximo o con un mnimo del espectro DC. Sin embargo, el espectro DRO va disminuyendo de forma bastante lenta a longitudes de onda fuera de la zona de absorcin. Fuera de la zona de absorcin, el espectro (o la curva) sigue lo que se conoce como ecuacin de Drude: () = AD/(2 - 02) donde AD es una constante relacionada con la intensidad del espectro DC correspondiente y 0 es la longitud de onda de la inflexin de la curva. La forma de la ecuacin de Drude explica porqu molculas como la sacarosa presentan una rotacin ptica importante con luz visible del espectro, zona donde no absorben este tipo de radiacin. Consecuentemente, como otros efectos de absorcin y dispersin, la rotacin ptica y el dicroismo circular son fenmenos relacionados que, en principio, son matemticamente conmutables. A partir de un espectro DRO, siempre y cuando no hayan demasiados efectos Cotton superpuestos, puede ser calculado el correspondiente espectro DC mediante las llamadas transformadas de Kronig-Kramer, y viceversa.
[ ( )] = 2

[ ( )] d 2 2

[ ( )] = -

[ ( )] 2 d 2- 2 0

Estas ecuaciones implican que si el espectro DRO es conocido a todas las puede calcularse la elipticidad, y viceversa. En la prctica aunque los datos disponibles se limiten slo a un margen de , es posible obtener las transformadas de Kronig-Kramer. Los datos obtenidos con las transformadas son tan precisos como los experimentales. As, la informacin disponible a partir de [ ] y [] de forma experimental es redundante. Como ya se ha dicho anteriormente, la rotacin ptica debido a su naturaleza dispersiva se observa incluso lejos de la posicin de una transicin ptica activa, mientras que el dicroismo circular est circunscrito

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a la zona de absorcin. Estas caractersticas son las que determinan las ventajas y las desventajas de una tcnica respecto a la otra. Actualmente se emplea preferentemente la espectroscopia de DC . Su superioridad se basa principalmente en el poder de resolucin sobre las bandas superpuestas (que comparadas con la absorcin isotrpica tiene la ventaja adicional de la distincin de signo). Sin embargo, hay aspectos especiales de la espectroscopia DRO que hacen que sta contine siendo una herramienta vlida; la DRO es un mtodo absoluto mientras que el DC requiere ser calibrado con estndars (generalmente con cido d-10-canfosulfnico). Adems, a partir de un espectro DRO, es posible deducir la existencia y el signo de un efecto Cotton, cuya posicin se encuentra en una zona de longitud de onda inaccesible a la medida directa por razones tcnicas o a causa de la gran absorcin del solvente. En estudios de desnaturalizacin de protenas, realizados con elevadas concentraciones de urea o clorhidrato de guanidina, por ejemplo, la transparencia del solvente en clulas de paso de luz pequeo es suficiente para registrar el valle a 233 nm caracterstico de la estructura -hlice. El centro de la banda correspondiente de la transicin n * es, sin embargo, inaccesible debido a la baja relacin seal / ruido. Es preciso volver a remarcar que la principal ventaja del DC sobre el DRO es la capacidad que presenta en la resolucin de bandas debidas a diferentes transiciones pticamente activas. Esto se observa claramente en la figura 18.12. en donde pueden observarse curvas consistentes en ms de una banda. La parte A de la figura 18.12. muestra los espectros DRO y DC que resultaran si la molcula contuviera dos centros pticamente activos dando lugar a dos efectos Cotton muy cercanos entre s. Se observa que la curva DC muestra claramente ambos elementos, mientras que la curva DRO no. Ms sorprendente es la parte B de la figura que muestra el espectro de una molcula que presenta un fuerte efecto Cotton a una longitud de onda determinada y otro mucho ms dbil a otra longitud de onda ms distante. Debido al solapamiento del espectro DRO, la banda dbil es casi indetectable, mientras que el espectro DC, con sus estrechas bandas caractersticas, muestra claramente ambas bandas. En la parte C de la figura 18.12. puede verse el efecto de yuxtaposicin de curvas positivas y negativas. Estos ejemplos bastan para demostrar la mayor resolucin de los espectros DC respecto a los de DRO. La parte D de la figura 18.12. sirve para reforzar la anterior conclusin, adems de indicar que el anlisis por DC tambin proporciona una informacin superior a la de la simple espectroscopia de absorcin con luz no polarizada. Este espectro de absorcin tan slo indica que el sistema consiste en cuatro cromforos (se observan cuatro bandas), mientras que el espectro DC muestra que tres de las cuatro bandas (I, II y IV) son debidas a centros pticamente activos. El signo del dicroismo circular tambin indica el sentido del giro del cromforo. Puede observarse que el espectro DRO fracasa en evidenciar de forma clara si la banda II es pticamente activa a causa de la superposicin de las curvas de los efectos Cotton de las bandas I y III. As, ahora se puede sealar que la actividad ptica, tanto si se expresa como rotacin ptica como por elipticidad, est asociada a la presencia de cromforos pticamente activos y que incluyen: - cromforos quirales (con disimetra inherente) - cromforos no quirales pero que son perturbados por la vecindad.

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Figura 18.12.- Espectros de DC y DRO de molculas con ms de un cromforo pticamente activo.

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18.4. INSTRUMENTACION
A) Espectropolarmetros para D.R.O. Un espectropolarmetro para DRO consta de: - una fuente de emisin de radiacin constituida por una lmpara de descarga de xenn. - un sistema monocromador de red de difraccin . El intervalo de longitudes de onda empleado es de 185-800 nm. - un polarizador que produzca luz plano-polarizada a partir de la luz natural. Los sistemas polarizadores pueden dividirse en tres tipos principales: polarizadores basados en la reflexin , polarizadores dicroicos y polarizadores birrefringentes . Estos ltimos son los ms extensamente empleados y estn construidos con cristales unixicos birrefringentes y actan separando el haz incidente en dos haces, el rayo ordinario y el extraordinario, que, por su parte, estn polarizados de forma lineal y perpendicular, respectivamente.

La calcita, o espato de Islandia, CaCO 3, es un cristal unixico que posee una relativamente elevada birrefringencia y es el material ms empleado como polarizador; sin embargo, a causa de la considerable absorcin que presenta por debajo de 220 nm, suele substituirse por cristales de cuarzo o de fluoruro de magnesio, ambos de menor birrefringencia, pero ms adecuados en polarizadores que deben emplearse para determinar la actividad ptica en el UV lejano. Los polarizadores birrefringentes pueden emplearse segn diferentes diseos, de modo especial aquellos que no afectan la direccin de propagacin de la luz incidente. Adems, para prevenir la desviacin del haz que se transmite, se combinan dos mitades de prismas cortados de la misma manera. El tipo de polarizador ms profusamente empleado hoy en da es el de Rochon (figura 18.13.). Este polarizador est formado por dos prismas cortados a partir de un cristal uniaxial teniendo en una mitad el eje ptico paralelo a la radiacin incidente y la otra con el eje ptico perpendicular a la misma. Los prismas estn colocados uno junto al otro separndolos una pequea pelcula de un fluido transparente que los mantiene en contacto mutuo. Este fluido tiene un ndice de refraccin casi idntico al ndice de refraccin del cristal empleado. En este tipo de prisma, un haz de luz entra perpendicularmente a la superficie del primer prisma y lo atraviesa paralelamente al eje ptico. A continuacin, el haz se refracta doblemente cuando entra en el segundo prisma; los dos rayos producidos estn separados por un pequeo ngulo cuya magnitud depende de los ngulos de los prismas y de la birrefringencia del material cristalino que los forman. El haz ordinario se traslada sin desviarse y est linealmente polarizado mientras que el extraordinario experimenta una desviacin angular y est linealmente polarizado en una direccin ortogonal. Los polarizadores Rochon fabricados con prismas de cuarzo son de particular inters en la regin del ultravioleta lejano, por debajo de 175 nm a causa de la relativamente alta transmisin.

Figura 18.13.- Polarizador de Rochon.

Histricamente, el polarizador Nicol es, quizs, el polarizador birrefringente ms conocido. Consiste en dos prismas de espato de Islandia (carbonato clcico cristalizado) que estn pegados con blsamo del Canada. El blsamo del Canada tiene un ndice de refraccin tal (n = 1,55) que provoca la reflexin total del rayo ordinario cuando incide sobre la superficie de separacin. Cuando una radiacin incide paralela a las aristas largas del prisma lo hace casi perpendicular a su eje ptico. El rayo extraordinario no sufre apenas desviacin y atraviesa la capa de blsamo del Canada, emergiendo del prisma polarizador en el plano que forman el eje ptico y la direccin de incidencia. El rayo ordinario incide sobre el blsamo con un ngulo superior a su ngulo lmite y sufre la reflexin total siendo absorbido por la montura metlica que sostiene el Nicol. Debido a que la luz entra y sale del polarizador con incidencia oblicua hace que el rayo experimente un desplazamiento lateral. El hecho de que solo puedan admitirse relativamente pequeos ngulos de incidencia junto con la elevada absorcin de la radiacin ultravioleta por el blsamo del Canada son los principales inconvenientes que presenta este tipo de polarizador.

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- Una cubeta para contener la sustancia, que en la mayora de los casos est en forma de disolucin (en muy raras ocasiones se han empleado slidos o pelculas). La cubeta tiene un paso de luz de 0,02 a 20 cm y est termostatizada a fin de mantener una temperatura constante (la temperatura es un factor que influye en gran manera en los resultados obtenidos). - un analizador: El analizador es un polarizador que determina la direccin de la luz linealmente polarizada. Si una radiacin plano-polarizada incide sobre un prisma no existe transmisin de luz a travs del prisma si la direccin de la vibracin es perpendicular al eje ptico (direccin de extincin). Sin embargo, si la direccin de la vibracin es paralela al eje ptico del prisma, toda la luz, descontando las prdidas por reflexin, se transmite (direccin de mxima transmisin). La transmisin de luz varia entre en mnimo y un mximo cuando la direccin de la vibracin rota 90. Un analizador puede caracterizarse, por consiguiente, por dos direcciones ortogonales y perpendiculares al rayo de la luz incidente: la direccin de mxima transmisin y la de extincin. El ngulo , entre una vibracin vi, de una amplitud a i de un haz analizador y la direccin de extincin OE (figura 18.14) determina la amplitud a de una vibracin v, de un haz que emerge del analizador: a = ai sin

Figura 18.14- Accin de una analizador sobre una vibracin lineal incidente: OT, direccin de la mxima transmisin de un analizador; OE, direccin de extincin del analizador.

El analizador sirve para determinar el cambio en la direccin de vibracin cuando una sustancia pticamente activa se coloca entre el analizador y el polarizador. Se dice que dos prismas estn cruzados (figura 18.15) cuando no pasa luz por el analizador. Si se coloca una sustancia pticamente activa entre dos prismas cruzados, la luz se transmite debido a la rotacin de V0 a V1 (figura 18.16.). La extincin puede restablecerse rotando el analizador un cierto ngulo que es idntico al ngulo de rotacin ptica de la sustancia que se encuentra en la cubeta.

Figura 18.15- Combinacin de un analizador con un polarizador. Caso de prismas cruzados.

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Figura 18.16.- Transmisin de la luz que atraviesa una substancia pticamente activa situada entre dos prismas cruzados.

- Sistema detector . El sistema detector de un espectropolarmetro generalmente es un tubo fotomultiplicador unido a una amplificacin electrnica externa. El fototubo, al igual que el ojo humano en los polarmetros sencillos, debe detectar la posicin del analizador en la que la transmisin es cero y esto el fototubo no puede realizarlo con precisin ya que el instrumento no responde bien cuando se aproxima al cero. Para evitar este problema se han adoptado distintos mtodos que se basan en llegar a un punto de referencia distinto al cero de intensidad. Esto se consigue modulando el haz de luz de manera que primero llegue al detector la mitad del haz y despus la otra mitad; as, la seal de salida del detector ser una corriente alterna si las dos intensidades luminosas que llegan son distintas y una corriente continua cuando las dos intensidades sean iguales. Los espectropolarmetros comerciales son instrumentos de compensacin y se basan en dos sistemas distintos: la compensacin mecnica y la compensacin elctrica . El sistema de compensacin mecnica consiste en hacer girar con un servomotor el analizador o el polarizador. El sistema de compensacin elctrica se basa en el efecto Faraday, consistente en mantener fijos el analizador y el polarizador y compensar elctricamente la rotacin de la muestra por efecto Faraday (generacin de actividad ptica en sustancias normalmente inactivas por la accin de un campo magntico). Finalmente cabe indicar que debido a que la radiacin de la lmpara de xenn no es constante en toda la gama de frecuencias empleadas y a que la radiacin que llega al fotomultiplicador tiene diferente energa segn su longitud de onda, es preciso que exista un sistema de control automtico de ganancia para que mediante variaciones del grosor de la rendija se compensen las variaciones de la fuente de emisin y proporcione la misma energa radiante en todo el margen de longitudes de onda empleado. En la figura 18.17. se muestran dos diagramas esquemticos de un espectropolarmetro que utiliza un sistema de compensacin mecnico (A) y de uno que utiliza un sistema de compensacin elctrico de efecto Faraday (B). B) Espectrmetros de dicroismo circular

En un principio podra parecer que la realizacin de determinaciones de dicroismo circular requiera dos fuentes luminosas, una para luz polarizada circularmente a la derecha y otra para la izquierda, respectivamente, y cada una de estas fuentes requerira un monocromador para seleccionar la longitud de onda. Sin embargo, los aparatos comerciales usan unos dispositivos muy sencillos para generar luz polarizada circularmente a la derecha y a la izquierda, y que se basan en retrasar una de las dos componentes un cuarto de longitud de onda. Una forma de obtener la luz polarizada circularmente a partir de luz plano polarizada es mediante el uso de prismas tales como el rombo de Fresnel y otra, ms generalizada, mediante un modulador electroptico que se basa en el efecto Pockel . - prismas modulares: El rombo de Fresnel (figura 18.18.) funciona combinando dos retrasos de 45 en cada reflexin interna con un rombo de un vidrio tipo crown (n = 1,5217) que vara el retardo menos de 2 sobre el espectro visible.

- modulador de retardo electroptico : En este sistema se emplean lminas de fosfato dibsico de amonio cortadas segn el eje z. El fosfato dibsico de amonio es una sustancia que cristaliza en el sistema tetragonal y que en ausencia de campos elctricos tiene solo un eje ptico (el eje z, que es por el

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que normalmente pasa el haz luminoso) y que bajo la accin de un campo elctrico tiene dos ejes pticos, es decir que presenta efecto Pockel. Al aplicar una tensin alterna relativamente grande (del orden de 1 kV) a lo largo del eje ptico z, los ejes pticos inducidos elctricamente sern alternativamente los que forman ngulos de +45 y -45 con el plano de polarizacin original. El efecto neto ser la transformacin de luz polarizada en un plano en luz polarizada circularmente a la derecha durante medio ciclo y hacia la izquierda durante el otro medio. Si la muestra presenta dicroismo circular la radiacin neta que llegar al detector estar polarizada elpticamente .

Figura 18.17.- Esquema de un espectrofotmetro con sistema de compensacin mecnica (A) y con sistema de compensacin elctrico (B).

Figura 18.18.- Esquema de un rombo de Fresnel.

Este tipo de dispositivos permiten medir directamente (y no diferencialmente) el dicroismo circular (en realidad, la salida del fotomultiplicador tiene un componente de corriente alterna superpuesto al componente medio y esta corriente alterna est relacionada con la diferencia de transmisin a travs de la muestra de la luz polarizada circularmente en ambos sentidos. Esta seal compleja es transformada electrnicamente y da una seal relacionada directamente con el dicroismo circular de la muestra). La salida del fotomultiplicador es entonces interrumpida electrnicamente de forma bastante compleja, proporcionando un voltaje que es proporcional a la elipticidad. Esta elipticidad automticamente se grafica en funcin de la longitud de onda obtenindose el espectro de dicroismo circular. La sensibilidad de estos aparatos es de 0,8 mdgr para DRO y 0,2 mdgr para DC. Relacin seal/ruido La optimizacin de una determinacin ptica est en funcin de la absorbancia de la muestra. Esto se debe a que mientras la actividad ptica vara linealmente con la concentracin, la absorbancia lo hace exponencialmente. A causa de la emisin de electrones al azar por el detector, producida por la llegada al azar de cuantos de luz, la fluctuacin media en la seal de corriente (suponiendo ningn tipo de alteracin por otras fuentes) se incrementa con la raz cuadrada de la misma corriente. Si se supone que el detector est recibiendo una seal de luz de forma proporcional a la rotacin de la muestra, la expresin para la relacin seal/ruido (S) ser:

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S = I2 c 10-cA/2 donde es la rotacin de una solucin al 1%; A la absorbancia de una solucin al 1%, I 0 la intensidad de la luz incidente, c la concentracin de la solucin (g/100 ml). Por diferenciacin se obtiene que S ser mxima cuando cA = 2/ln 10 = 0,85, y esta es la absorbancia de la muestra de concentracin ptima c. En la prctica no es posible trabajar continuamente a este valor de absorbancia puesto que sta vara con la longitud de onda; sin embargo, la expresin es til para tener una idea de la actividad ptica que un espectropolarmetro es capaz de determinar de forma satisfactoria.

18.5. APLICACIONES DEL DRO Y DEL DC

Las aplicaciones de las tcnicas espectropolarimtricas van a agruparse en tres apartados: 1. Identificacin de sustancias. 2. Estudios estructurales en molculas orgnicas. 3. Elucidacin de estructura en biopolmeros. Identificacin de sustancias Una de las posibles aplicaciones del DC sera emplear el espectro obtenido como "huella dactilar"es decir como medio de identificacin de sustancias. Los espectros de DRO y DC son medios identificadores ms potentes que el simple espectro de absorcin al UV o visible aunque menos que los IR, si bien las tcnicas espectropolarimtricas permiten distinguir enantimeros, cosa no posible con el espectro I.R. En la figura 18.19. se observan los espectros de dicroismo circular y ultravioleta obtenidos con un derivado fenantrnico y en donde se pone de manifiesto la mayor capacidad identificadora de la tcnica espectropolarimtrica.

Figura 18.19.- Curvas de absorcin al UV (----) y de DC (- - -) del (-)-1,12-dimetilbenzeno[c]-fenantreno-5-cido actico.

Estudios estructurales en molculas orgnicas Junto con la resolucin de problemas analticos, de modo especial aquellos que conciernen a mezclas de ismeros, y la deteccin de bandas de absorcin dbiles u ocultas, la principal aplicacin de la espectropolarimetra en qumica se centra en el campo de la determinacin de estructuras (p.e., la localizacin del grupo carbonilo en un esteroide o en un triterpenoide) y en la estereoqumica. En sntesis, estas tcnicas pueden emplearse en dos tipos de problemas estructurales: a) la determinacin del tipo de enantimero al que un compuesto pertenece y b) la determinacin de la configuracin de un centro de asimetra relativa a otro centro de asimetra de la misma molcula. Las tcnicas espectropolarimtricas pueden proporcionar informacin relacionada con la estereoqumica absoluta de los centros asimtricos de una molcula. El procedimiento clsico para la determinacin de la estereoqumica absoluta de las molculas implica la conversin de stas en otras cuya estereoqumica absoluta sea conocida; este procedimiento emplea una sucesin de pasos qumicos en los que se mantiene imperturbado el centro asimtrico, o bien se conoce perfectamente la estereoqumica de cada paso. Tales correlaciones

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involucran a menudo bastantes pasos intermedios y son muy tediosas. La comparacin de los cambios de actividad ptica cuando dos cromforos semejantes se someten a idnticas transformaciones qumicas es la que permite la designacin de la estereoqumica absoluta. Sin embargo, este proceso requiere una serie de compuestos modelo, cuya estereoqumica absoluta sea conocida a efectos de comparacin. Se hace posible la asignacin exacta de la estereoqumica absoluta mediante el empleo de tcnicas de rayos X o difraccin electrnica; sin embargo, el equipo que se requiere para estas tcnicas no es fcilmente asequible y el anlisis de las muestras de difraccin era, hasta el desarrollo de los ordenadores de alta velocidad, sumamente laborioso. Estudios estructurales de Biopolmeros La teora de la actividad ptica no es todava capaz de proporcionar la estructura exacta de una protena, aunque se obtienen mejores resultados con cidos nucleicos. Las complicaciones en la interpretacin de las curvas frecuentemente se deben al hecho de que el cromforo no es asimtrico, pero si que es asimtricamente perturbado por los grupos vecinales. En algunas protenas existe una complicacin adicional debida al enlace peptdico que es el principal elemento que detecta el DC, y a las diferentes conformaciones que una protena puede adoptar segn la precisa localizacin en la protena: el espectro obtenido es un valor medio de las varias conformaciones posibles. Actualmente la elucidacin de la estructura de macromolculas se realiza a travs de la informacin que proporciona el anlisis por difraccin de rayos X. No obstante la espectropolarimetra contina aportando importantes datos especficos y complementarios. Por otra parte, el gasto, en particular de tiempo, que se requiere para esta tcnica es relativamente pequeo. En el caso de protenas y polipptidos permite, cuanto menos, la obtencin de las caractersticas de la composicin de la estructura secundaria, siempre y cuando existan razones que imposibiliten el anlisis por rayos X (prdida de material, material con un peso molecular demasiado alto, no cristalizabilidad de la muestra, etc.). Las interacciones intra e intermoleculares de las cadenas laterales cromofricas reflejan efectos realizados sobre la estructura terciaria y cuaternaria. Adems la unin de pequeas molculas, como es el caso de los coenzimas, pueden monitorizarse a travs de los efectos Cotton extrnsecos o bandas de las cadenas laterales implicadas. En cintica, la espectroscopia DC permite el seguimiento de la misma a travs de los cambios transformacionales si estos se producen a velocidad lenta o media.