Dra.: Gina Torres Fecha: 22/08/2013 Materia: Bioqumica Responsable: JRF.

BIOQUIMICA

APOPTOSIS POR CITOMETRIA DE FLUJO Hoy vamos a ver lo que es citometria de flujo que es justamente la tcnica con la que nosotros vamos a ver la apoptosis, aqu les muestro los equipos que antes exista para lo que la citometria de flujo que ahora son mucho ms pequeos, antes eran como computadoras y ocupaban un espacio muy grande eso fue a partir de 1941 ya que empezaron a aparecer estas nuevas computadoras.

APLICACIONES.- La citometria de flujo tiene muchas aplicaciones pero yo solo traje las ms importantes: Podemos decir que nos sirve mucho para el linaje de las clulas es importante porque podemos ver la respuesta a un tratamiento en farmacologa es muy importante lo que es citometria de flujo para ver cmo va el tratamiento, cmo va la enfermedad y el pronstico. Por otro lado nos ayuda para el estudio de la respuesta inmune por lo cual en inmunologa tambin es importante todo lo que son las interleucinas, las citosinas. Por otro lado el crecimiento celular, tambin en microbiologa es importante. Tambin son sirve en la apoptosis y necrosis celular. En la deteccin de leucemias, linfomas, sndromes neo-displasicos esto en la parte de onco-hematologia Tambin nos ayuda a medir las clulas madre, tambin para las Stem Cells que son marcadores como la CD34 y la CD45 que nos sirven para analizar cuantas clulas tenemos para trasplante de medula sea.

Dra.: Gina Torres Fecha: 22/08/2013 Materia: Bioqumica Responsable: JRF.

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DEFINICION DE CITOMETRIA DE FLUJO.- Es una tcnica o mtodo que mide simultneamente las propiedades fsicas, qumicas y biolgicas objetivamente de cada clula una por una y que va a una velocidad de 500 a 4000 clulas por segundo o sea es sper rpido. Este equipo lo tenemos ac en el piso 7 en el laboratorio, el equipo mismo Citometria de flujo consta de software que es el encargado de interpretar lo que est pasando ac, entonces tenemos todo un software que son varios paquetes como el paquete intraget o el septofbloct, tambin tiene impresora y adems la pantalla que es bastante amplia que nos ayuda a ver todas estas figuritas que van a ver ustedes que son dostplots, en el equipo lo que nosotros hacemos es colocar la muestra, marcamos la muestra con anticuerpos monoclonales se coloca ac y despus vamos a ver que va a pasar por ac las clulas una por una y el software se encarga de interpretar. Anticuerpos monoclonales Simplemente para hacerles un recuerdo de
Antgeno inoculado

Suero inmunologa ustedes van a ver lo que son los recolectado y anticuerpos monoclonales y gracias a su clulas separadas descubrimiento hemos podido hacer muchas investigaciones, ustedes en bioqumica llevan tambin la parte de anticuerpos no es verdad, entonces lo que se hace para obtener los anticuerpos monoclonales es inocular un antgeno a un ratoncito o un conejito cada semana se inocula para que despus tengamos Liquido sobrenadante Clulas de Clula de en el suero recolectado del ratoncito tengamos Clulas del cultivo celular hibridoma mieloma las Clulas B las cuales al final las vamos a (antisuero monoclonal) separar, cuales son las clulas B son las clulas plasmticas y que van a ir a formar anticuerpos, a estas clulas B las vamos a unir a clulas de mieloma que son va a dar clulas de un hibridoma y despus nosotros vamos a poder conseguir los Anticuerpos monoclonales anti este antgeno que hemos inoculado, por ejemplo yo quiero un anticuerpo monoclonal anti-CD10, anti-CD45 entonces vamos a inocular el antgeno respectivo para obtener al final el anticuerpo monoclonal que yo necesitaba.

Los anticuerpos monoclonales llegan en diferentes frascos cada uno de estos tiene un diferente anticuerpo monoclonal por lo cual tenemos una variedad inmensa actualmente hay ms de 373 anticuerpos monoclonales dirigidos para diferentes antgenos de la membrana de las clulas, pero a estos anticuerpos monoclonales solitos no vamos a poderlos detectarlos con ningn equipo por lo tanto necesitamos de la fluorescencia o algo que brille y nos diga que es y para que lo reconozca el equipo.

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FLUORESCENCIA.- Es la propiedad de algunos compuestos qumicos que tienen en su composicin anillos cclicos y electrones que absorben la energa y luego emiten la fluorescencia y aqu tenemos simplemente una grfica de la composicin de la fluorescencia. Aqu tenemos una estructura cclica que va a absorberlos fotones de excitacin que va a ver, ahora de donde sale este fotn de excitacin de la luz del lser que tiene el equipo, en el equipo que nosotros tenemos solo tiene un lser pero hay en otros equipos que tienen tres laser entonces va a ver un fotn de excitacin y tambin va a ver un fotn que va emitir por eso va a ver un cambio de energa, de luz, de calor y vamos a tener un espectro de emisin por los fluorocromos.

FLUOROCROMO.- a todo esto se llama fluorocromo, hay una variedad enorme de estos nosotros en el laboratorio usamos tres tipos de fluorocromos el FIT, FITC y el PE, entonces cuando tenemos la muestra sacamos los anticuerpos monoclonales los cuales estn unidos a tres diferentes fluorocromos que el equipo puede detectar a los cuales nosotros podemos medir, el fluorocromo que nosotros tenemos se encarga de: Absorber la energa de la fuente del lser a esto se le llama excitacin Libera la energa absorbida por medio de la vibracin y disipacin del calor Emite fotones de largo espectro llamado fluorescencia que no es ms que la emisin.

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Entonces el anticuerpo monoclonal est unido a un fluorocromo, simplemente para mostrarles lo que nosotros tenemos ac en el piso 7 desde el ao 1999 y para diagnostico desde 2012, consta de un sistema de fluidos, tambin tiene un sistema elctrico por el cual pasa la luz del lser que no se ve muy bien en la foto el cual es de color azul y por ac ustedes inyectan la muestra y pasa una a una las clulas a travs del lser, debido a eso nosotros vamos a poder ver si la clula est o no marcada, este es el fundamento aqu se ve ms grafico lo que hemos hablado tenemos en una muestra diferentes clulas adems le hemos colocado en un tubo un anti-CD4 o sea un anticuerpo monoclonal unido a un fluorocromo adems hemos colocado un anticuerpo monoclonal anti-CD8 unido a otro fluorocromo diferente, van a ver clulas que se van a unir a un solo fluorocromo a un solo anticuerpo monoclonal, otras se van a unir a dos antgenos monoclonales, entonces pasan cada una de las clulas por el lser y que tenemos nosotros despus gracias a los software podemos tener diferentes tipos de histogramas y en este caso de dotplot y ver lo marcado con el anticuerpo monoclonal anti-CD8 y los que se han marcado con el otro anticuerpo monoclonal anti-CD4, vemos ac las clulas que estn en blanco son clulas negativas para ambos anticuerpos monoclonales, las clulas que estn aqu de color rojo son las que se han marcado con la CD8 y las que estn de color verde son las que se han marcado con CD4 porque el anticuerpo monoclonal ha ido a reconocer a nivel de la membrana de la clula el antgeno respectivo y aqu se observa las que son positivas tanto para CD8 como para CD4 porque nosotros hemos hecho un cuadrante de cellas negativas para ambos y clulas positivas para ambos anticuerpos monoclonales.

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DETECTOR SIDE SCATTER (mide la complejidad celular

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DETECTOR FORWARD (mide tamao celular

Incidencia, fuente de luz

En s que hace el equipo: pasa una clula y si la luz va en esta forma directa se llama FORWARD SCATTER que es la que mide el tamao celular en cambio si la luz se refleja de esta manera va y choca en alguna cosa y se refleja se llama SIDE SCATTER y que es la que mide la complejidad celular lo que quiere decir que si la clula es ms rugosa, ms grande vamos a poder nosotros justamente identificar con el SIDE SCATTER y el FORWARD SCATTER claro est segn como incide la luz.

Bueno y gracias al paquete Cell QUEST PRO vamos a poder tener diferentes tipos de dotplots que ya les haba indicado y diferentes tipos de agrupaciones celulares unos positivos para ambos y otros totalmente negativos y tambin vamos a poder tener los histogramas que nos van a poder decir la positividad y la negatividad y gracias a esto si ustedes han marcado con un anticuerpo monoclonal y su fluorocromo respectivo.

El equipo nos va a dar estos tipos de dopblop por ejemplo ac se ha marcado con CD34 podemos decir que todos esto a son positivos para CD34 y lo dems es negativo. En cambio ac que tenemos que es positivo para CD45 podemos ver gracias a esto donde van las clulas por su tamao y complejidad donde se ubican.

APOPTOSIS.- Es la muerte celular programada y que es normal en cada clula, esta clula llega a un tiempo en que tiene que morir. NECROSIS.- Es una muerte accidental debida a un estrs, shock trmico, cambio de pH, etc.

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Por lo cual son diferentes, ac en la tabla podemos ver las diferencias entre apoptosis y necrosis. DIFERENCIAS ENTRE APOPTOSIS Y NECROSIS Mecanismo Tamao celular Integridad de membrana Orgnulos Condensacin de la cromatina Fragmentacin del DNA Fragmentacin celular Restos celulares APOPTOSIS NECROSIS

Programada genticamente Disminuye Se mantiene Se preservan Temprana Temprana en fragmentos oligonucleosomales En cuerpos apoptoticos rodeados por membrana Son reconocidos y fagocitados

Accidental Aumenta Se pierde Se desintegran Tarda Tarda en fragmentos grandes Los contenidos de los orgnulos se liberan Inducen inflamacin local

Lo que pasa en la apoptosis, vean como se forman los cuerpos apoptoticos, en cambio hay clulas que van a pasar a la necrosis que van a formar la ruptura de la membrana como ya habamos mencionado. Cuando nosotros hacemos una investigacin de lo que nosotros queremos por ejemplo para ver cuantas clulas existe a nivel de la medula sea podemos nosotros ver el tamao de las clulas donde se ubican.

Miren aqu tenemos un dotblot donde podemos ubicar las clulas no viables y las clulas viables y esto tambin nos da el equipo lo cual podemos ver en forma de histograma de las clulas viables como las no viables, bueno y como sabe el equipo lo que es viable y lo que no lo es viable lo que se hace es tomar una muestra y en esta ponemos nosotros diferentes tipos de reactivos, en este caso colocamos 7AAD, si en las clulas que tienen completa su membrana no van a poder ingresar estos reactivos a las clulas por lo tanto son viables, en cambio en las que su membrana est rota e ingresa el reactivo es una clula no viable, estas sustancias se van a ir a unir dentro del DNA y sobre todo suelen ir a nivel de la guanina y de la citosina y nosotros vamos a poder saber que concentracin de clulas son viables o no en %.

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Ac se ha usado un reactivo llamado Anexina 5 porque el kit viene con Anexina 5 y 7AAD entonces aqu podemos ver las clulas que si se han unido a la Anexina 5, esto nos da el equipo tambin nos da las clulas negativas.

Entonces que es lo que ha pasado a nivel de la membrana por el aumento de la FOSFATIDIL SERINA lo que sucede es que: hay una traslocacion de la PS durante la apoptosis, la PS esta dentro de la celula y posteriormente hay una traslocacion. Traslocacion es universal y sobre todo es especifica La Anexina 5 va ir a reconocer especificamente a la FOSFATIDIL SERINA Posterior a eso hay una combinacion con sondas vitales como es la 7AAD Esta es la Anexina 5 que esta conjugada que va ir a unirse a la Fosfatidil serina de la membrana plasmtica, esta es la fosfatidil serina que pasa por translocacin externamente y al estar externamente se va poder unir a la anexina 5 junto con el calcio y a estos si vamos a poder verificar mediante el equipo. Aca tenemos otro grafico que es lo mismo:

Anexina V con fluorocromo Membrana plasmtica Fosfatidil serina Sonda vital o yoduro de propilo o 7AAD

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Entonces el equipo nos va a dar los resultados mediante estos dotblot, entonces las viables donde no han podido ingresar el 7AAD, la membrana esta perfecta van a estar a este nivel o sea en este cuadrante en cambio vamos a tener algunas clulas apoptoticas tempranas a este nivel y aqu todas las necrticas o sea todas las que estn muertas, entonces imagnense ustedes lo importante de este equipo adems nos va a dar en % como vemos aqu un 2%, 3%, etc. Tambin nos da el % de las clulas viables, no viables, apoptoticas tempranas, apoptoticas tardas y necrticas y esto para que nos sirve, nos sirve para un trasplant de medula sea cuantas clulas tenemos de clulas madre y de estas clulas madre cuantas han muerto y cuantas estn vivas y cuantas voy a poder colocarle al receptor. CONCLUSIONES.- La citometria de flujo es una herramienta muy til para poder medir, en este caso para investigacin, para ver la respuesta inmune, para ver el tratamiento con nuevos frmacos los cuales se da para probar esto a los presos para disminuir su tiempo de vida en estados unidos despus que ya hemos pasado ratones, monitos etc. quienes nos quedan son los presos, en el crecimiento celular, apoptosis, necrosis, para saber la cantidad de DNA, para trasplantes de medula sea y para lo que es la cuantificacin de las clulas madre.

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