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Influencia de la aireacin en la biotransformacin del bagazo de caa por Trichoderma viride M5-2 en un biorreactor esttico de fermentacin slida
Adisbet Ibarra1, Yaneisy Garca1, Elaine Valio1, J. Dustet2 , Nereida Albelo1 y Taim Carrasco1
2

Instituto de Ciencia Animal, Apartado 24, San Jos de las Lajas, La Habana Instituto Superior Politcnico Jos Antonio Echevarra, Facultad de Ingeniera Qumica, Calle 114 s/n y Autopista Nacional, La Habana

Para analizar la influencia de la aireacin en la biotransformacin del bagazo por la cepa Trichoderma viride M5-2 en un biorreactor esttico de fermentacin slida, se utiliz un modelo lineal jerarquizado con dos factores: flujo de aire y tiempo. Este modelo estudi el comportamiento de las actividades CMCasa, PFasa y la protena soluble. Los indicadores bromatolgicos fibra neutra detergente (FND), fibra cida detergente (FAD), protena verdadera, celulosa y lignina se analizaron con respecto al tiempo de fermentacin para los dos flujos de aire (20 y 30 L/min) mediante un diseo completamente aleatorizado con arreglo factorial de . 2 x 2 con tres repeticiones. Adems, se utiliz la dcima de comparacin de Duncan para comparar las medias. Las mayores expresiones enzimticas se obtuvieron a las 72 h de fermentacin para ambos flujos de aire. Se alcanzaron valores de 42.58 UI/g MS de CMCasa y 11.26 UI/g MS de PFasa para un flujo de 20 L/min (P < 0.001) y 54.82 UI/g MS de CMCasa y 19.21 UI/g MS de PFasa para 30 L/min (P < 0.001) El contenido de celulosa del bagazo disminuy en 5 unidades porcentuales y la protena verdadera se increment en 6 unidades porcentuales cuando se utiliz una aireacin de 30 L/min El pH alcanz valores superiores a 7 despus de las 72 h. La humedad tambin aument y vari de 65 a 73 %. Segn los resultados se puede concluir que la utilizacin de un flujo de aire de 30 L/min, en la variante esttica, favorece la eficiencia del proceso fermentativo. Se recomienda esta variante como una metodologa para la produccin de alimento animal a partir de desechos agroindustriales. Palabras clave: aireacin, fermentacin slida, Trichoderma viride, biorreactor, bagazo.

El bagazo de caa de azcar es uno de los subproductos ms abundantes de la industria azucarera; pero su utilizacin en la alimentacin animal se ha visto limitada por su naturaleza lignocelulsica, su bajo valor biolgico, su pobre palatibilidad, y la baja digestibilidad del extracto libre de nitrgeno (Figueroa y Ly 1990). Se ha estudiado y an se buscan diferentes mtodos para elevar el valor nutritivo de estos materiales fibrosos. La fermentacin slida con microorganismos lignocelulolticos para la obtencin de forraje suplementado con protena unicelular y otros productos por va microbiana (Quintero 1993), es uno de los mtodos ms eficaces para la degradacin de es-

tos sustratos y una va ms para el saneamiento ambiental. Sin embargo, no se dispone an de una tecnologa especfica para el uso eficiente de estos sustratos, por lo que se contina trabajando en el diseo y mejoramiento de fermentadores y en el escalado de los procesos de fermentacin slida (Durand et al. 1993, Zadrazil et al. 1996 y Gonzlez et al. 2000). En este tipo de proceso es muy importante la regulacin y control de las variables de operacin para lograr los resultados deseados (Dustet 1999). Una de las variables de mayor significacin en las fermentaciones slidas es la aireacin, la que se utiliza para mantener la concentracin de oxgeno imprescindible para

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el crecimiento del microorganismo; adems, permite regular la temperatura y la humedad del sustrato dentro del reactor (Chahal et al. 1993). Este trabajo tuvo como objetivo analizar la influencia de la aireacin en la bioconversin del bagazo de caa por el hongo Trichoderma viride M5-2 en un biorreactor esttico de fermentacin slida. Materiales y Mtodos Sistema de fermentacin en estado slido (FES) . Para la fermentacin se utiliz el biorreactor diseado por Carrasco et al. (1999) mostrado en la figura 1. Se realizaron dos corridas experimentales y se utiliz la variante esttica con flujos de aire de 4 y 6 L/min/kg de slido hmedo, correspondientes a 20 y 30 L/min El bagazo se llev a 65 % de humedad para ser inoculado posteriormente. La temperatura se mantuvo en 30 2 C, condicin necesaria para el crecimiento del hongo.

El proceso de fermentacin se estudi durante 5 d y se tomaron muestras de bagazo fermentado cada 24 h. De estas muestras se tomaron 5 g para extraer el crudo enzimtico y 20 g para realizar los anlisis qumicos necesarios. Con el objetivo de analizar las variaciones que se producen durante el proceso de fermentacin, se utiliz un modelo lineal jerarquizado con dos factores (flujos de aire y tiempo), en el que las variables analizadas fueron las actividades enzimticas (CMCasa y PFasa) y la protena soluble. Tambin se estudiaron las variaciones de pH y humedad. Los indicadores bromatolgicos se analizaron con respecto al tiempo de fermentacin, para los dos flujos de aire, mediante un diseo completamente aleatorizado con arreglo factorial de 2 x 2 con tres repeticiones. Adems, se utiliz la dcima de comparacin de Duncan (1955) para discriminar diferencias entre las medias. Se us la cepa mutante con capacidad celullitica sobre bagazo de caa, Trichoderma viride M5-2.
5 6 7 17 16

4 3

2 13 14 15

9 10

11 12

1. Compresor 2. Vlvula reguladora 3. Rotmetros de aire 4. Cuerpo del fermentador 5. Ventanilla para muestreo 6. Orificios de medicin 7. Rejilla de soporte 8. Entrada de aire 9. Distribuidor de aire

10. Entrada de agua 11. Cmara de agua 12. Salida de agua 13. Circuito de recirculacin de agua 14. Bao termostatado 15. Controles 16. Termmetro del bao 17. Termmetro de contacto

Figura 1. Diseo del biorreactor de fermentacin en estado slido (Carrasco et al. 1999)

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Resultados y Discusin

Se emple como medio de cultivo para el crecimiento del microorganismo papa-dextrosa-agar (PDA), pH=5, el que se esteriliz en autoclave a 121 C durante 20 min La siembra del hongo se efectu en 15 erlenmeyers de 250 mL y se incub a 30 C durante 7 d para obtener abundante esporulacin. La suspensin de esporas se prepar mediante el arrastre de los microorganismos sembrados. Se filtr por lana de vidrio para eliminar los restos de micelios y se realiz el conteo de las esporas en cmara de Neubauer. La concentracin obtenida del conteo se ajust a 15 x 107 ufc/mL. Como sustrato se utiliz 1500 g de bagazo de caa de azcar con un tamao de partculas de 0.1-5.0 mm. El bagazo se someti previamente a un tratamiento con hidrxido de calcio al 5 %, segn la metodologa propuesta por Bambanaste (1998). Las actividades endo y exo 1,4 -D glucanasas (CMCasa y PFasa) se determinaron por el mtodo descrito por Mandels et al. (1976) y se expresaron en unidades internacionales por gramos de materia seca. La protena soluble se midi segn el mtodo de Lowry et al. (1951) y se expres en miligramos por gramos de materia seca. Para las determinaciones de pH se utiliz un pHmetro digital (CD-70) de precisin 0.01 unidades. Se realizaron, adems, anlisis de humedad (AOAC 1990), fibra neutro detergente (FND) y fibra cido detergente (FAD) segn Goering y van Soest (1970) y protena verdadera (PV) de acuerdo con Bernstein (citado por Meir 1986).

Segn Durand et al. (1993), la aireacin ptima en los procesos de FES se encuentra determinada por la naturaleza de los microorganismos utilizados, el oxgeno requerido para el crecimiento, la cantidad de calor metablico para disipar, el espesor de las capas de sustrato y el espacio para el aire entre sus partculas. En la variante esttica utilizada, segn el anlisis estadstico realizado, se encontr que para la enzima CMCasa no hubo interaccin significativa entre los flujos de aire y el tiempo de fermentacin, ya que en los dos flujos se observ el mismo comportamiento durante el tiempo de fermentacin. Sin embargo, s fue significativa la variacin de esta enzima en el tiempo (P < 0.001) y se alcanz el valor mximo de 42.58 UI/g MS a las 72 h, para el flujo de 20 L/min y 54.82 UI/g MS para el flujo de 30 L/min en este mismo tiempo. El anlisis mostr adems interaccin significativa entre los flujos de aire para esta enzima (P < 0.001) ya que se obtienen valores superiores para el flujo de 30 L/min que para el de 20 L/min. Para la enzima PFasa se observ interaccin significativa entre los flujos de aire y el tiempo de fermentacin (P < 0.001) al igual que para la protena soluble (tablas 1y 2). Valio, E., Elas, A., Rodrguez, M. y Albelo, N. (2001, indito) al utilizar un flujo de 22 L/min con esta cepa, obtuvieron valores de 31.59 y 23.04 UI/g MS de CMCasa y PFasa, respectivamente. En este experimento, cuando se suministraron 30 L/min de aire, se alcanzaron valores superiores de actividad endo y exo glu-

Tabla 1. Comparacin de los indicadores enzimticos y protena soluble con respecto al tiempo de fermentacin para un flujo de aire de 20 L/min

Indicadores CMCasa, UI/g MS PFasa, UI/g MS PS, mg/g MS

abc

48 3 3 . 3 6b 5 . 9 9b 7 . 5 9b

Tiempo, h 72 42.58a 11.26a 11.57a

EE Sign. 96 28.64b 5.91b 11.43 2.36*** 1.67*** 0.27***

Valores con letras diferentes difieren a P < 0.05 (Duncan 1955) *** P < 0.001

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canasas con 54.82 UI/g MS para CMCasa y 19.21 UI/g MS para PFasa. El anlisis estadstico para determinar la accin de las enzimas celulolticas, demostr diferencias significativas con respecto al tiempo de fermentacin (P < 0.001). Esto significa que en la dinmica de crecimiento de este hongo sobre el bagazo se producen cambios en los niveles de la actividad hidroltica. Estos resultados se sustentan sobre la base de la hidrlisis previa del sustrato con el propsito de aumentar la actividad de las enzimas (Prior et al. 1992). Los valores elevados de actividad enzimtica obtenidos en este trabajo son objeto de estudio con vistas al empleo de los extractos crudos de estas enzimas en la alimentacin de especies monogstricas, as como el uso del bagazo biotransformado para la alimentacin de rumiantes.

La protena soluble aument con diferencias significativas (P < 0.001) a medida que transcurra el proceso fermentativo. La mayor produccin se alcanz a las 72 h para ambos flujos de aire. Cuando se trabaj con 20 L/min se obtuvo 11.57 mg/g MS y para 30 L/min se alcanz 17.59 mg/g MS (tablas 1 y 2). En la tabla 3 se ofrece el anlisis bromatolgico del producto fermentado. Se hall que para 20 L/min hay una utilizacin de 5.17 unidades porcentuales de los constituyentes de la pared, segn el anlisis de la fibra neutra detergente. Para 30 L/min la disminucin de la FND fue de 9.14 unidades porcentuales, y se encontr interacciones significativas con respecto al tiempo de fermentacin en ambos casos (P < 0.001). Se hall que estas disminuciones

Tabla 2. Comparacin de los indicadores enzimticos y protena soluble con respecto al tiempo de fermentacin para un flujo de aire de 30 L/min
Indicadores 48 CMCasa, UI/g MS PFasa, UI/g MS PS, mg/g MS
abc

Tiempo, h 72 54.82a 19.21 17.59

a a b c

EE Sign 96 32.71c 7.08b 14.51

b

4 0 . 2 6b 4.45 10.59

2.04*** 1.45*** 0.27***

Valores con letras diferentes difieren a con P < 0.05 (Duncan 1955) *** P < 0.01

Tabla 3. Comparacin de los indicadores bromatolgicos de la fermentacin del bagazo de caa para los dos flujos de aire

Flujos, L/min FN D PV Contenido celular Lignina

abcd

20 30 20 30 20 30 20 30

Tiempo, 0 7 9 . 5 4b 8 2 . 5 5c 1.77a 2 . 2 8b 20.46b 17.45a 10.20a 11.30c

h 72 74.37a 73.41a 4.92c 8.72d 25.63c 26.59c 10.46b 11.40c

EE Sign 0.41*** 0.06*** 0.41*** 0.03*

Valores con letras diferentes para cada indicador difiren a P < 0.05 (Duncan 1955) * P < 0.05 *** P < 0.001

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son proporcionales al aumento del contenido celular (R2=99, P < 0.001) La protena verdadera tuvo un incremento de 3.15 y 6.44 unidades porcentuales para 20 y 30 L/min de aire, respectivamente (P < 0.001). Este aumento contribuy al enriquecimiento proteico del bagazo de caa para su posible utilizacin como alimento animal.Durante la fermentacin se observ que el contenido de celulosa disminuy de 43.79 a 39.21 % para 20 L/min y de 48.64 a 43.63 % para 30 L/min. No se encontr correlacin en la disminucin de la fibra cida detergente en relacin con el porcentaje de lignina a las 72 h. Algunos autores consideran que el mtodo de fraccionamiento de la fibra de van Soest, pudiera ser inadecuado para sustratos biotransformados (Reid 1989 y Marrero 1998), teniendo en cuenta la solubilidad de la lignina de un 72 % en cido sulfrico. Por ello, Valio, E., Elas, A., Rodrguez, M. y Albelo, N. (2001, indito) proponen la utilizacin de la espectroscopia infrarroja para determinar los cambios moleculares en los grupos funcionales de las estructuras aromticas de la lignina, como va ms confiable para la determinacin de los cambios producidos por la biotransformacin con el hongo. El indicador de pH, para ambos flujos de aire, present un incremento despus de las 72 h de fermentacin con valores superiores a 7 (figura 2). El comportamiento del pH, despH

pus de este tiempo, pudo ser una de las causas que provocaron la disminucin de la actividad celuloltica. Este aumento del pH pudiera deberse a la hidrlisis de la urea adicionada al bagazo y a que la proporcin inicial entre la urea y el sulfato de amonio, aadidos como nutrientes, no sea la ptima para este hongo. En ambas corridas (20 y 30 L/min) hubo un incremento progresivo de la humedad del sustrato en el biorreactor, (figura 3) y se observ mayor significacin cuando se utilizaron 30 L/min (P < 0.001). El incremento de la humedad pudo estar asociado a la acumulacin de agua producida por el metabolismo del hongo, o por el arrastre de sta en la lnea de entrada de aire hmedo. Roussos et al. (1991) fermentaron bagazo de caa de azcar con Trichoderma harzianum, en fermentadores de columna durante 64 h y sealaron que el contenido de humedad durante la fermentacin se mantuvo entre 70.5 y 72.9 %. Medina (1998) y Medina et al. (2000) a su vez, informaron que para la cepa Aspergillus fumigatus 155 v sobre bagazo de caa de azcar, en el biorreactor utilizado en este experimento, la humedad tambin aument y mostr su valor mximo de 78 % a las 58 h (P < 0.001). Esto sugiere que para este tipo de equipo la humedad se incrementa con el transcurso de la fermentacin. Segn Moo Young et al. (1983), SaucedoCastaeda y Gutirrez-Rojas (1990) la temperaHumedad, %

8 7.5 7 6.5 6 5.5 5 0 24 20 L/min 48 72 30 L/min 96

Tiempo, h

80 75 70 65 60 0 24 20 L/min 48 72 30 L/min 96
Tiempo, h Figura 3. Variacin de la humedad del bagazo de la fermentacin para los dos flujos de aire

Figura 2. Variacin del pH con el tiempo en la fermentacin esttica del bagazo con T. viride M5-2 para los dos flujos de aire

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tura es otro de los factores importantes para las fermentaciones en estado slido. Sus valores ptimos oscilan entre 20 y 45 C, segn el microorganismo utilizado. En las fermentaciones slidas es muy difcil mantener la temperatura en los rangos ptimos. Esto se debe, fundamentalmente, a la acumulacin del calor producido por la actividad metablica del microorganismo, el bajo contenido de humedad, la ausencia de mezclado en las fermentaciones estticas, as como a la baja conductividad trmica de los materiales biolgicos. No obstante, en este experimento se logr mantener la temperatura en 30 2 C, lo que no afect la actividad hidroltica del hongo sobre el bagazo durante el proceso fermentativo. Se concluye que la utilizacin de un flujo de aire de 30 L/min en la fermentacin slida del bagazo de caa, con tamao de partculas entre 0.1-5.0 mm, en el biorreactor esttico, aumenta la accin biotransformadora del hongo sobre la fibra del bagazo. Por lo tanto esta tecnologa se podra emplear para la obtencin de bagazo enriquecido con protena unicelular y enzimas celulasas, para la alimentacin animal. Referencias
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