Introducción.

El método de PCR consiste en la amplificación de DNA in vitro por medio de la

polimerización en cadena de DNA utilizando un termociclador. El propósito del
PCR es hacer muchas copias de un fragmento de DNA. Se realiza la amplificación
de un segmento específico de DNA, teniendo poco material disponible y es una de
sus mas importantes características en el diagnostico.
Fue diseñada por el Dr. Kary Mullis en 1987 quien gano el premio Nóbel de
Química en 1993 por su invento y utilizo el PCR para amplificación del gen de β-
hemoglobina humana, y el diagnostico prenatal de anemia falciforme.
OBJETIVOS:

• Conocer los fundamentos de la técnica de amplificación de DNA por PCR

• Conocer sus usos y aplicaciones

• Ventajas y desventajas del PCR

MATERIALES

• Termociclador
• Microcentrífuga
• Micropipetas de 2, 20 y 200 ul
• Microtubos para “PCR”,
• Puntas estériles o con filtro
• Agua bidestilada
• ADN molde (extraído practico anterior)
• Primer Forward y Reverse, mas nucleotidos DNTP´s
• 10X buffer para PCR (Solución amortiguadora para “PCR”)
• MgCl2 (25 mM)
• Polimerasa Taq
COMPONENTES

• Amortiguador (Buffer)

50mM KCl, 10mM Tris. Cl (pH 8.3 a temperatura ambiente) y 1.5 mM MgCl2.

• MgCl2

Puede estar en forma de MgCl2, MgSO4. Se usa 25mM -Es un cofactor para la
función de la polimerasa-

• dNTP’s

(Dinucleotidos trifosfatados): dATP, dGTP, dCTP, dTTP.

La concentración de dNTPS, es proporcional al tamaño del fragmento que se desea
amplificar. Ej: Si vamos a amplificar un fragmento de 500pb vs uno de 5500 pb,
necesitamos más concentración de dNTPS para el de 5500pb.

• Cebadores “primers”

Son secuencias cortas de nucleótidos 20-24 nucleótidos de longitud,

complementarias a una región del DNA que se quiere amplificar. -Se usa a
concentración de 1µM-

• DNA molde

El DNA a amplificar puede tener desde 50 a 2,000 nucleótidos de longitud.

El mínimo va de 10-100 ng. y el máximo entre 400-500 ng.

• Polimerasa
 Generalmente se usa 1 a 2 unidades por reacción.

FUNDAMENTO

El proceso de “PCR” incluye 3 pasos básicos que se repiten 25 veces o más:

Desnaturalización.

Consiste en separar la doble hebra de DNA y convertirla en hebra sencilla.

-Típicamente se usa una temperatura de 95˚C - 97˚C, por 15 a 40 segundos –el tiempo
depende del tamaño del genoma-

Apareamiento o “anneling”.

Los cebadores “primers” previamente diseñados, reaccionan con la hebra

sencilla de DNA y se pegan en lugares específicos por complementariedad de bases.
Para esto, se baja la temperatura -ej: 55˚C por 30 segundos-. La temperatura y el tiempo
pueden variar entre cebadores según sea el caso.

Polimerización o Extensión.

Una Polimerasa de DNA extiende los “primers”, en el espacio comprendido

entre ambos “primers”, y coloca dinucleotidos trifosfatados (dNTP’s) de 5’a 3’ leyendo
el DNA de 3’a 5’. De esta forma sintetiza la secuencia complementaria de las hebras de
DNA molde

Se efectúa a 70˚C por 1½ minutos (puede variar según sea necesario)

PROCEDIMIENTO

En este practico realizaremos el análisis de polimorfismos de FFV; F13A01,

FESFPS y VWA. Los cuales necesitan condiciones especiales en la termoclicacion que
no difieren mucho de la programación clásicamente conocida.

PREPARACION MASTER MIX.

Componentes Volumen por Numero de Volumen final (ul)

muestra (ul) reacciones
Agua dest. Esteril. 7 4.15 29.05
STR 10X Buffer 1 4.15 4.15
Multiplex 10X Primer 1 4.15 4.15
Taq DNA polimerasa 0.5 4 1.5

Trabajamos en cabina con luz UV. En la cual seguimos los siguientes pasos;
añadimos 29.05 Ul de agua bidestilada en un tubo eppendorf (1.5ml) marcado
previamente, luego añadimos 4.15 ul de STR 10X Buffer, mas 4.15 ul de Multiplex 10X
Primer, homogenizamos y trasvasijamos 9 ul en cada una de las muestras contenidas en
eppendorf (0.2ml) para finalizar añadiendo 1 ul de enzima TaqPolimerasa, con un total
de 3 muestras y 1 control (+) (k562), colocamos en cada uno de ellos una gota de
aceite mineral, para luego colocar cada uno de los tubos en el termociclador ,
seleccionamos el programa diseñado previamente para esta determinación especifica y
damos paso a la PCR.

Programación termociclador para determinación de FFV

DENATURACION INICIAL

• 1 ciclo a 96º C por 2 minutos

10 ciclos:
• 94º C por 1 min.
• 64º C por 1 min.
• 70º C por 1.5 min.
20 ciclos:
• 90º C por 1 min
• 60º C por 1 min
• 70º C por 1 min
EXTENCION FINAL
• 1 ciclo a 60º C por 30 min.

Conclusión.

En base al trabajo realizado hemos podido determinar ciertas ventajas;

A partir de una muestra pequeña de ADN se puede obtener una cantidad considerable
para el estudio que se vaya a realizar. El producto se puede utilizar para clonar,
secuenciar y análisis. Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo o muerto.
Sus aplicaciones son múltiples: medicina forense, diagnósticos, análisis prenatales, etc.
Y paralelamente se pueden determinar ciertas desventajas tales como; que se puede
reproducir solamente partes del genoma en donde se conoce por lo menos una mínima
secuencia de 20 – 40 pb. Se necesitan “primers” específicos que sean complementarios
al fragmento que se desea sintetizar. La polimerización puede tener errores al sintetizar
el ADN. Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del mismo investigador o de
cualquier otro) de no mantener las condiciones necesarias.
Bibliografia

Tecnologías de marcadores moleculares para Estudios de diversidad genética de plantas:

Módulo de aprendizaje, Tecnologías basadas en la PCR, Fundamentos de la PCR.
IPGRI y Cornell University, 2003.

Mullis KB: The polymerase chain reaction. Nobel Lecture, December 8, 1993
http://www.nobel.se/chemistry/laureates/1993/mullis-lecture.html

Kary Mullis Website: http://www.karymullis.com

Deutsches Hepatitis C Forum e.V. Homepage – Qualitativer HCV-RNA Nachweis:
http://hepatitis-c.de/pcr1.htm

PCR en Tiempo Real: la nueva era de la información Genética celular, REDVET. Revista
electrónica de Veterinaria. ISSN: 1695-7504
2009 Vol. 10, Nº 2

PCR-MÚLTIPLE PARA EL DIAGNÓSTICO DE Mycoplasma genitalium,

Mycoplasma hominis, Ureaplasma parvum Y Ureaplasma urealyticum, Nadia
Rodríguez-Preval1a, Carmen Fernández-Molina1b, Islay Rodríguez G,Denis
Berdasquera C, José Rivera-Tapia