Protenas G y sistema adenililciclasa

FERNANDO PICATOSTE
Y

ENRIQUE CLARO

Receptores de membrana y mecanismos de transduccin

os receptores de membrana pueden clasificarse de acuerdo con los mecanismos implicados en la transmisin de la seal al interior celular. Segn esta clasificacin, se subdividen en receptores-canal, receptores con actividad enzimtica y receptores acoplados a protenas G (fig. 1). Los primeros son protenas oligomricas que forman un canal inico cuya apertura es modulada por los agonistas, de modo que el efecto primario de stos se manifiesta mediante un cambio en la polaridad de la membrana. A este grupo pertenecen cierto nmero de receptores de neurotransmisores, como el nicotnico de la acetilcolina, los ionotrpicos del glutamato o el receptor GABAA. Los receptores con actividad enzimtica son protenas monomricas u oligomricas con un dominio intracelular responsable de dicha actividad, la cual se activa tras la unin de los agonistas. Dentro de este grupo se conocen receptores con actividades guanililciclasa (como los de pptidos natriurticos), tirosina quinasa (como los de insulina y factores de crecimiento), fosfoprotena fosfatasa (implicados en la activacin de linfocitos T y B), serina-treonina quinasa (como el del factor de crecimiento transformante) e histidina quinasa (descritos en bacterias y levadura). Tambin dentro de este grupo suelen incluirse receptores que, sin tener actividad enzimtica, reclutan y activan enzimas citoslicos con actividad tirosina quinasa (como los receptores de cito319

Receptores para neurotransmisores

Receptorenzima Receptorcanal

Receptor acoplado a protenas G (GPCR)

Ion
Actividad enzimtica: - Guanililciclasa - Tirosina quinasa - Fosfoprotena fosfatasa - Serina/treonina quinasa - Histidina quinasa

Protena G

Sistema efector: - Canales inicos - Enzima (segundos mensajeros)

Figura 1

Tipos de receptores de membrana

quinas o las integrinas) o proteasa (Fas y receptores del factor de necrosis tumoral, que activan caspasas apoptticas). Finalmente, el ltimo grupo de receptores son protenas monomricas que, mediante la participacin de protenas reguladoras fijadoras de nucletidos de guanina llamadas protenas G, activan sistemas efectores, los cuales pueden ser canales inicos o enzimas generadores de segundos mensajeros. Dentro de este grupo se puede encontrar un buen nmero de los receptores de neurotransmisores. En los sistemas de receptores acoplados a protenas G (GPCR) existe una notable diversidad molecular en todos los componentes que participan. As, entre los agonistas encontramos aminocidos, aminas, pptidos y un gran nmero de seales sensoriales. Entre los receptores contamos con ms de un centenar (o un nmero muy superior si incluimos los receptores de odorantes de la mucosa olfatoria), agrupados en un cierto nmero de familias. Las protenas G se han clasificado en cuatro grupos segn las homologas de secuencia de una de sus subunidades (G), de las que se han descrito una veintena, si bien la diversidad de las otras dos subunidades que las componen (G, 5 variantes; G, 11 variantes), determina que el nmero de protenas G individuales pueda ser elevado. El nmero de sistemas efectores es ms reducido e incluye canales de K+ y de Ca2+, as como enzimas, tales como las adenililciclasas, la fosfodiesterasa de GMP cclico, las fosfolipasas C de fosfoinostidos y, posiblemente, la fosfolipasa A2. Estos efectores generan un nmero tambin limitado de segundos mensajeros, como AMP cclico, inositol trifosfato, diacilglicerol, Ca2+, etc., los cuales regulan actividades celulares a travs de la modulacin de algunas protena quinasas, entre las que podemos contar las
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dependientes de AMP cclico (protena quinasa A, PKA), de calcio y fosfolpidos (protena quinasa C, PKC) o de calcio y calmodulina (CaMK), as como las protena quinasas activadas por mitgenos, entre otras. Estos sistemas modulan un buen nmero de funciones biolgicas, entre las que se incluyen la percepcin sensorial, la neurotransmisin, funciones endocrinas, quimiotaxis, etc. Es importante mencionar aqu que los GPCR son capaces de interaccionar con otras protenas, adems de las protenas G, incluyendo protena quinasas, -arrestina, etc., lo que revela su versatilidad para participar en diversos procesos de sealizacin. No obstante, aqu nos centraremos en la sealizacin va protenas G. En este captulo veremos el sistema de la adenililciclasa y revisaremos, al mismo tiempo, las caractersticas generales de los mecanismos de transduccin en los que participan las protenas G.

Sistema adenililciclasa
El sistema adenililciclasa, presente en muchas formas de vida y utilizado por un buen nmero de receptores, emplea la formacin del segundo mensajero AMP cclico como mecanismo de transmisin de la seal al interior celular. El AMP cclico se genera a partir de ATP por accin del enzima de membrana adenililciclasa y se inactiva transformndose en AMP por accin de enzimas llamados fosfodiesterasas de AMP cclico , los cuales forman parte de un amplio grupo que engloba a 11 familias de isoenzimas capaces de hidrolizar nucletidos cclicos. La mayor parte de las acciones de este segundo mensajero, desde sus conocidos efectos reguladores de importantes vas metablicas hasta sus acciones especficas en el sistema nervioso central, son consecuencia de su capacidad para activar la PKA, que fosforila otras protenas en restos de serina y treonina. No obstante, tambin se han descrito acciones no mediadas por PKA, como es el caso de la modulacin directa por AMP cclico de factores intercambiadores de nucletidos de guanina que activan protenas G monomricas de la familia Ras. El sistema adenililciclasa consta de tres componentes proteicos ubicados en la membrana plasmtica: receptores, protenas G y adenililciclasas. Entre los receptores hay un cierto nmero que induce la activacin de la adenililciclasa, mientras que otro grupo promueve su inhibicin (tabla 1). Tanto unos como otros pertenecen al grupo cuya estructura se caracteriza por la presencia de siete segmentos transmembrana y entre ellos encontramos un buen nmero de receptores de neurotransmisores, de modo que la mayora de stos interacciona con algn subtipo de receptor acoplado al sistema de la ciclasa. En cuanto a los otros dos componentes, revisaremos sus caractersticas por separado.
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Tabla 1 Receptores que activan o inhiben la adenililciclasa
Inhibidores Adrenrgicos (2A,2B,2C) Dopamina (D2,3,4) Serotonina (5HT1A,1B,1D,1E,1F,5A) Muscarnicos (M 2,4) Histamina (H3,4) Adenosina (A1,3) Purinrgicos (P 2Y12) Glutamato (mGLU 2,3,4,6,7,8) GABA (GABAB) Canabinoides (CB1,2) Lisofosfolpidos (edg1-4,6,8) Receptores de pptidos: Opioides ( , , , N/OFQ) Neuropptido Y (Y1,2,4,5,6) Somatostatina (sst1-5) Angiotensina (AT1,2) Melatonina (MT1,2) Galanina (Gal1-3) LSH, FSH Pptidos quimiotcticos (C3a,5, fMLP) Rec. activados por proteasa (PAR1) Quimioquinas (CCR1-10, CXCR1-5, CX3CR1, XCR1)

Estimuladores Adrenrgicos ( 1-3) Dopamina (D1,5) Serotonina (5HT4,6,7) Histamina (H2) Adenosina (A2A,2B) Purinrgicos (P 2Y11) Prostanoides (DP, IP, EP2,4) Receptores de pptidos: Vasopresina (V2) VIP/PACAP (VPAC1,2, PAC1) Melanocortina (MC1-5) Factor liberador de corticotropina (CRF 1,2) Calcitonina, CGRP FSH, LSH, TSH

Protenas G: papel en la transduccin de seales

La adenililciclasa puede ser modulada por dos subtipos de protenas G llamadas Gs, estimulatorias , y Gi, inhibitorias. Estas protenas son heterotrmeros que forman parte de una gran familia de protenas con actividad GTPasa, que engloba diversos subtipos de protenas G tanto monomricas como heterotrimricas con un papel central en la sealizacin celular, y cuya diversidad, estructura y papeles funcionales han sido intensamente estudiados en los ltimos aos y de las que en otro captulo de este libro se describen los aspectos estructurales. (Vase Biologa y estructura molecular de las protenas G, a cargo de Elsa M. Valdizan y ngel Pazos.) El conocimiento de las caractersticas y funciones de Gs y Gi, as como de otras protenas G, deriva, en gran parte, de las investigaciones sobre el sistema adenililciclasa, particularmente en el caso de su estimulacin por los receptores adrenrgicos . Una breve resea histrica de los principales hallazgos en este campo figura en la primera edicin de este manual (Picatoste et al., 1996),
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y relatos ms extensos pueden ser hallados en otras revisiones (Birnbaumer, 1990; Levitzki, 1988; Lefkowitz et al., 1983; Schramm y Selinger, 1984).

Ciclo de las protenas G

De acuerdo con el modelo comnmente aceptado (fig. 2), existe un ciclo de disociacin y asociacin de las subunidades de la protena G, activado por intercambio del GDP por GTP en el lugar de unin de estos nucletidos de la subunidad G. Dicho intercambio puede ser promovido por agonistas de GPCR que inducen la interaccin del receptor con la protena G trimrica unida a GDP, generndose un complejo ternario agonistareceptorprotena G. La protena G responde con un cambio conformacional que permite la disociacin de GDP y la unin de GTP, cuya concentracin intracelular es mucho mayor, con lo que la protena G se activa y el dmero formado por las subunidades G se separa de la subunidad G. El receptor tiene menor afinidad por la subunidad G que por el heterotrmero, por lo que tambin se disocia. Tanto la subunidad G unida a GTP como el dmero G pueden modular efectores hasta que la actividad GTPasa de la subunidad G la inactiva al hidrolizar el GTP. Esto conduce a la reasociacin de las subunidades dando lugar al heterotrmero inactivo, disponible para un nuevo ciclo de activacin. Durante el ciclo, la subunidad G cambia su conformacin pasando por tres estados: heterotrmero, G-GTP y G-GDP. Si la activacin tiene lugar con anlogos no hidrolizables del GTP, la protena G no se desactivar y los efectores sern modulados de forma permanente. Por otro lado, las protenas G pueden ser tambin activadas por factores distintos de los GPCR, como en el caso del AlF4-, que mimetiza el fosfato ausente en el ADP y promueve la disociacin del heterotrmero o, como se ha descrito ms recientemente, por un

GDP G GDP H + RL H-R H-G

GTP H-R H-G GTP

GDP

Pi

bg EFECTORES

H-R H-a

GTP

H2O a

GTP

Figura 2 Ciclo de las protenas G y papel de los receptores en la modulacin de efectores

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pequeo y heterogneo grupo de protenas conocidas genricamente como AGS (de activators of G-protein signaling), cuyo papel funcional an ignoramos. La interaccin del receptor con la protena G tambin produce cambios en la conformacin del primero, con importantes secuelas funcionales. stas fueron analizadas por primera vez en estudios sobre los receptores adrenrgicos en membranas de eritrocitos, en las que la competicin por agonistas de la fijacin especfica de antagonistas marcados radiactivamente presenta curvas bifsicas que se resuelven en dos componentes, correspondientes a dos afinidades distintas del receptor por el agonista, llamados R H (componente de alta afinidad) y RL (componente de baja afinidad). Este comportamiento no lo muestran los antagonistas y sus caractersticas dependen del agonista, de modo que cuanto mayor es la eficacia intrnseca de ste, tanto mayor es el porcentaje de receptores en forma de RH y la razn entre las constantes de disociacin de ambos estados. Por otra parte, en presencia de GTP o sus anlogos las curvas de competicin de los agonistas muestran un solo componente, que corresponde al de baja afinidad, es decir, los nucletidos de guanina transforman RH en RL. Estos resultados se interpretan asumiendo que RH est constituido por el complejo ternario agonistareceptorprotena G y RL por el receptor separado de la protena G. La primera demostracin de esta propuesta se llev a cabo al verificar que los receptores adrenrgicos , solubilizados y separados por cromatografa de filtracin en gel, poseen un mayor peso molecular aparente cuando han sido incubados previamente con un agonista (que promover la formacin del complejo ternario) que cuando lo han sido con un antagonista. Adems, el marcaje simultneo de los receptores, con un agonista tritiado, y de la protena G, mediante ADP-ribosilacin catalizada por la toxina colrica usando [ 32 P]NAD + como sustrato, permite observar la coelucin de ambas marcas radiactivas en las columnas de filtracin en gel, tras incubacin de los receptores con el agonista. La reversibilidad del primer paso del ciclo (formacin del complejo ternario y disociacin del GDP) explica que, en los ensayos de fijacin de radioligandos, el GDP tambin reduzca la afinidad del receptor por los agonistas. Por otro lado, la disociacin del heterotrmero tras la unin de GTP determina que el receptor se libere y explica que, en presencia de concentraciones suficientemente altas de agonista y GTP, slo un pequeo porcentaje del receptor se encuentre en la forma de alta afinidad por el agonista.

Modulacin de efectores por las subunidades de las protenas G

Las protenas G heterotrimricas son generalmente identificadas por su subunidad G, la cual les confiere especificidad de interaccin con los efectores. Conocemos 20 subunidades G diferentes (21 si consideramos las va324

Protenas G y sistema adenililciclasa

Tabla 2 Familias de subunidades de las protenas G
Subtipo sS (x2) sL (x2) olf t-r t-c gust i1-3 oA/oB z q,11,14 15/16 12,13 Expresin Ubicuas Ubicuas Epitelio olfatorio, ncleo estriado Retina (bastones) Retina (conos) Papilas gustativas Ubicuas Cerebro Cerebro, plaquetas Ubicuas Clulas hematopoyticas Ubicuas Efectores Adenililciclasa Canal de Ca2+ Adenililciclasa Fosfodiesterasa de GMP cclico Fosfodiesterasa de AMP cclico Adenililciclasa Canal de K+ Adenililciclasa Fosfolipasa C Intercambiador Na+/H+ Rho-GEF/Rho PLC

Familia Gs

Gi

Gq

G12

riantes en distintas especies) que son expresin de 16 genes, generndose algunas de ellas por procesado alternativo de los transcritos primarios (variantes de splicing). Estas subunidades tienen pesos moleculares entre 39 y 52 kDa y presentan entre un 45 % y un 95 % de homologa de secuencia, de acuerdo con la cual se han agrupado en cuatro familias. En la tabla 2 se muestra dicha clasificacin, especificando la distribucin tisular y los efectores que modulan. Las subunidades G que median la activacin de la adenililciclasa pertenecen a la primera familia, la cual incluye las cuatro variantes de splicing de la subunidad G s, dos cortas (GsS) y dos largas (GsL), que difieren en el nmero de aminocidos, as como la subunidad Golf, presente en la mucosa olfatoria y en el ncleo estriado. Las subunidades Gs tambin pueden activar un canal de Ca2+ dependiente de voltaje. Los tres tipos de subunidad Gi, que participan en la inhibicin de la adenililciclasa y que tambin modulan algunos canales inicos, pertenecen a la segunda familia. sta incluye, adems, las dos variantes de Go, que regulan canales inicos e inhiben la ciclasa, las dos transducinas, que activan la fosfodiesterasa de GMP cclico en las neuronas de la retina, la Ggust presente en las papilas gustativas y la G z que tambin inhibe la ciclasa. La tercera familia agrupa las cuatro subunidades G (Gq, G11, G14, G15/16) que activan la fosfolipasa C de fosfoinostidos y la cuarta las subunidades G12 y G13, que han sido propuestas como moduladoras del intercambiador Na +/H+, de factores intercambiadores de nucletidos de
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guanina para las protenas G monomricas de la familia Rho y de la recientemente descrita fosfolipasa C. Adems de estos cuatro grupos, se ha descrito la existencia de una subunidad Gh de mayor tamao (unos 80 kDa), ya que contiene un dominio adicional con actividad transglutaminasa, y cuya activacin parece estar relacionada con la estimulacin de una de las isoformas de fosfolipasa C. Las subunidades G no presentan segmentos transmembrana, pero estn modificadas covalentemente en la zona N-terminal por cido mirstico (irreversiblemente), palmtico (de forma reversible) o ambos. Estas modificaciones permiten su asociacin con la membrana y tambin parecen afectar a su interaccin con las subunidades G y con algunos efectores. Finalmente, constituyen los sustratos de las toxinas colrica y pertusis que catalizan la ADP-ribosilacin de restos de arginina y cistena respectivamente, tienen el centro de fijacin de los nucletidos de guanina y muestran la actividad GTPasa. Las subunidades G forman un dmero que slo puede ser disociado en condiciones desnaturalizantes. En la tabla 3 se muestran las variantes de estas subunidades, su distribucin y los efectores que modulan. Se conocen cinco isoformas de las subunidades G , de aproximadamente 36 kDa, que muestran entre un 50 % y un 83 % de homologa de secuencia, y 11 subunidades

Tabla 3

Subunidades y de las protenas G

Expresin Varios tejidos Varios tejidos Varios tejidos Varios tejidos Cerebro principalmente Efectores modulados por los dmeros

Subunidad 1 2 3 4 5 1 conos 11 10 5 12 7 2 3 4 3olf

Retina (bastones) Retina (conos)

Adenililciclasa (II, IV, VII) Adenililciclasa (I, V, VI) Fosfolipasa C-1-3 Fosfolipasa A2 Fosfoinostido 3-quinasa Canal de K+ (GIRK1,2,4) Canal de calcio (N, P/Q) Va de las MAPK (Shc, Raf-1, Ras-GEF) Tirosina quinasas (Bruton, Tsk)

Varios tejidos Varios tejidos Cerebro principalmente Cerebro principalmente Epitelio olfatorio

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G, de 6-9 kDa, que presentan mayor variedad. Las subunidades G muestran modificaciones covalentes que incluyen prenilacin (con grupos farnesil o geranilgeranil) y carboximetilacin en la cistena C-terminal, las cuales permiten su asociacin a la membrana y regulan la interaccin del dmero con las subunidades G, los receptores y algunos efectores. No todas las combinaciones G parecen igualmente probables y, si bien son intercambiables entre las distintas subunidades G in vitro, an no se conoce bien el grado de especificidad de las interacciones entre ellas, que podra determinar la preferencia por combinaciones heterotrimricas especficas. Por lo que respecta a sus funciones, los dmeros G participan, en primer lugar, en el reconocimiento de las protenas G por los receptores, los cuales presentan baja afinidad por las subunidades G disociadas. En esta funcin parece existir selectividad de isoformas de las subunidades G y G, como se ha mostrado tras inhibicin de la expresin de subtipos especficos de dichas subunidades con oligonucletidos antisentido, lo que ha revelado, por ejemplo, que la modulacin de canales de Ca+ en clulas GH3 por receptores de somatostatina y muscarnicos M4 est mediada especficamente por las combinaciones heterotrimricas Go213 y Go134, respectivamente. La asociacin de los dmeros G con las subunidades G las desactiva como moduladoras de efectores y, adems, permite a stas ser ADP-ribosiladas por las toxinas colrica o pertusis. La capacidad para desactivar las subunidades G fue durante tiempo la principal funcin asignada a los dmeros G y, para algunos autores, un mecanismo por el que algunos agonistas podran inducir la inhibicin de la adenililciclasa, pues las subunidades G liberadas por activacin de las protenas Gi pueden asociarse con la subunidad Gs desplazando el equilibrio de disociacin de la protena Gs hacia la formacin del trmero inactivo. Sin negar completamente esta posibilidad, la visin cambi al demostrarse que los dmeros G tambin modulan efectores directamente. Los efectos conocidos hasta ahora incluyen la activacin de canales de K+, de tres isoenzimas de la fosfolipasa C, de la fosfolipasa A2 en la retina, de la fosfoinostido 3-quinasa, de receptor quinasas, de algunas tirosina quinasas y de tres de los isoenzimas de la adenililciclasa, adems de la inhibicin de otros tres de dichos isoenzimas (vase ms adelante) y de canales de Ca2+. Estas acciones cesan, al igual que las de las subunidades G, cuando stas son inactivadas por la hidrlisis del GTP y se produce la reasociacin del trmero.

Aspectos cinticos
Todas las protenas G se desactivan por la hidrlisis del GTP catalizada por su actividad GTPasa intrnseca, si bien la cintica de este paso vara notablemente de unas a otras. Las protenas G monomricas son las que presen327

Receptores para neurotransmisores

tan una cintica ms lenta, hasta el punto de que necesitan, para hidrolizar el GTP, la colaboracin de otras protenas llamadas GAP (de GTPase activating proteins). El estudio de las GAP ha conducido a la caracterizacin de un grupo de ms de una veintena de protenas, etiquetado con el nombre de RGS (de regulators of G-protein signaling), que poseen un dominio caracterstico de unos 25 kDa que contiene un haz de cuatro hlices , el cual interacciona tanto con las protenas G monomricas como con subunidades G de las heterotrimricas, reduciendo la energa de activacin para la hidrlisis del GTP. En algunos casos este dominio aporta un residuo de arginina necesario en el proceso cataltico, ya que estabiliza el estado de transicin de la reaccin, y que est ausente en protenas G incapaces de hidrolizar el GTP sin la ayuda de GAP. Esta arginina est presente en las protenas Gs y es precisamente el ADP que se ribosila por accin de la toxina colrica, lo que conduce al bloqueo de su actividad GTPasa. La cintica de activacin del ciclo es de primer orden respecto al receptor, como se pone en evidencia al observarse que la velocidad de activacin de la adenililciclasa por anlogos no hidrolizables del GTP y agonistas adrenrgicos disminuye de forma proporcional a la inactivacin de los receptores con agentes alquilantes, sin que se modifique la mxima estimulacin alcanzada por la ciclasa. Asimismo, en experimentos de reconstitucin cambiando la relacin receptores adrenrgicos /protenas G en membranas de clulas cyc, se observa que una estequiometra 1/10 permite la activacin por agonistas de todas las protenas Gs. Estos datos indican que el receptor acta como catalizador en el ciclo, de modo que una molcula del mismo puede activar varias de protena G, lo cual determina la existencia de amplificacin en dicha activacin. Una consecuencia de esto es que la Vmx y la EC50 para la estimulacin por agonistas de un efector han de variar de forma hiperblica al variar la concentracin de receptores, lo que ha sido verificado experimentalmente determinando los citados parmetros para la activacin por agonistas de la adenililciclasa al variar la densidad de los receptores adrenrgicos en un sistema de expresin heterlogo. La desactivacin de la protena G por la GTPasa dirige el ciclo termodinmicamente y hace que ste tenga una cintica de estado estacionario en lugar de una de equilibrio. La constante cataltica de la GTPasa es aproximadamente dos rdenes de magnitud inferior a la de la adenililciclasa, por lo que la protena G se mantiene activa el tiempo suficiente para que se forme un buen nmero de molculas de AMP cclico, generando una amplificacin adicional a la indicada en el prrafo anterior. Estas amplificaciones caractersticas del ciclo de las protenas G parecen, no obstante, estar moderadas en el caso de algunos sistemas mediante la activacin de la GTPasa por los propios
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efectores, que pueden actuar como GAP, como se ha observado en los casos de rodopsina-transducina-fosfodiesterasa de GMP cclico y de receptores muscarnicos M1-protena Gq-fosfolipasa C1, de modo que se produce una rpida inactivacin del sistema cuando cesa el estmulo del agonista. Adems, otros factores pueden modular la amplificacin y, en general, la cintica de activacin de los efectores. Por un lado la menor expresin de algn componente del sistema puede resultar limitante. En este contexto, se ha observado que, en general, las concentraciones de las protenas G son al menos un orden de magnitud superior a las de receptores y efectores, por lo que stos seran factores limitantes. Por otro, en los ltimos aos se han acumulado evidencias de la formacin de homo y heterodmeros entre receptores, as como de complejos en los que diversos componentes de un sistema de sealizacin se asocian unindose a protenas de anclaje, como el descrito en el ojo de Drosophila, donde varios componentes de la ruta de sealizacin iniciada por la rodopsina (fosfolipasa C, proteina quinasa C, canal de Ca2+, calmodulina) se unen a la protena InaD mediante dominios de interaccin protenaprotena denominados PDZ. Las amplificaciones constituyen la base de la existencia de reserva de receptores, ampliamente ejemplificada en el caso de muchos receptores acoplados a protenas G. Ello implica que basta con que tenga lugar un pequeo porcentaje de ocupacin del receptor por el agonista para que se produzca una importante fraccin del efecto mximo. Es decir, en trminos de parmetros farmacolgicos, los valores de EC50 de los agonistas son marcadamente inferiores a los correspondientes de KD. Este hecho representa una de las ventajas ms notables de la transduccin a travs de protenas G: el sistema responder frente a concentraciones de agonistas relativamente pequeas (alta sensibilidad), aunque las afinidades de este tipo de receptores por sus agonistas sean moderadas o bajas, lo que, a su vez, determina que las velocidades de disociacin de los complejos agonistareceptor sean altas y que las respuestas cesen rpidamente al bajar la concentracin de agonistas (alta flexibilidad).

Adenililciclasa. Isoenzimas y regulacin por protenas G

La revisin del sistema adenililciclasa se completa con la descripcin de las caractersticas del enzima efector. La primera purificacin de la adenililciclasa fue descrita en 1985 y el primer isoenzima fue clonado en 1989. Hasta ahora se han clonado diez isoenzimas de mamferos (nueve de membrana y uno citoslico) y se han caracterizado parcialmente sus mecanismos de regulacin por protenas G y otros factores. Los nueve isoenzimas de membrana (I-IX) son monmeros de unos 120 kDa con una homologa de secuencia del
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orden del 50 %. Por lo que respecta a su estructura, tras un corto segmento citoslico en el extremo N-terminal, presentan un grupo de seis segmentos transmembrana seguido de un gran dominio citoslico (C1a), de unos 250 aminocidos, al cual sigue de nuevo el mismo motivo estructural de seis segmentos transmembrana y otro gran dominio citoslico (C2a). La adenililciclasa citoslica posee tambin dos dominios semejantes a los descritos, pero carece de los segmentos transmembrana. Esta isoforma no es modulada por protenas G, sino que es activada por bicarbonato, de modo que constituye un sensor de actividad metablica. Los dos dominios citoslicos de las adenililciclasas presentan gran homologa entre s, habindose observado que ambos interaccionan cooperativamente y son necesarios para la actividad cataltica. La estructura de estos dominios, determinada en homodmeros del dominio C2a de la adenililciclasa II (ACII) y en dmeros C2a(ACII)/C1a(ACV), revela que ambos estn constituidos por un sandwich / doblado y que se unen en una disposicin cabezacola. En las dos interfases existen lugares de unin de ATP pero slo uno es el centro activo, siendo el otro el sitio de unin del activador forskolina. Asimismo, en los dominios citoslicos existen zonas que permiten la interaccin con subunidades Gs, Gi y G de las protenas G y, en algunos isoenzimas (I, III y VIII), existe un lugar de unin de Ca2+/calmodulina en el dominio C1a. Tanto la unin de forskolina como la de la subunidad Gs promueve la interaccin de los dos dominios y la constitucin del centro activo (fig. 3). En cuanto a su distribucin, los isoenzimas I, II, IV, VII, VIII y IX se expresan preferentemente en el tejido cerebral, aunque tambin se encuentran en otros tejidos, las formas V y VI son mayoritarias en tejidos perifricos y la III se encuentra, sobre todo, en la mucosa olfatoria. Todas las isoformas de membrana son activadas por la subunidad Gs, pero existen marcadas diferencias entre ellas en lo referente a la modulacin por otros factores, estando todas reguladas de forma mltiple. En la tabla 4 se resume lo que hoy sabemos sobre la modulacin de los distintos isoenzimas

C1a

C2a ATP a s -GTP , FSK FSK a s GTP

Figura 3

Adenililciclasa. Activacin por Gs y forskolina

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Protenas G y sistema adenililciclasa

Tabla 4 Isoenzimas de la adenililciclasa. Distribucin y regulacin por subunidades de las protenas G, Ca2+ y protena quinasas
Isoenzima I II III IV V VI VII VIII IX Distribucin Cerebro, glndula suprarrenal Cerebro, msculo, pulmn Epitelio olfatorio, cerebro Cerebro Miocardio, cerebro Amplia Cerebro, plaquetas Cerebro, pulmn Cerebro, msculo s ( s ) ( s ) (<1 M) (<1 M) (CaM) (Calcineurina) i o z ( s ) (CaM) Ca2+ (CaM) Protena quinasas (PKC), (CaMK-IV) (PKC) (PKC), (CaMK-III) (PKC) (PKA), (PKC/) (PKA,PKC) (PKC)

( )

por subunidades Gs, Gi, Go, Gz, dmeros G, Ca2+ y protena quinasas. En primer lugar, las subunidades Gi, clsicamente relacionadas con la inhibicin hormonal de la ciclasa, inhiben las adenililciclasas I, III, V, VI, VIII y IX. Otros miembros de la misma familia de subunidades G tambin inhiben algunas isoformas: las subunidades Go inhiben la ciclasa I y la subunidad Gz las formas I y V. Por su parte, las subunidades G inhiben las adenililciclasas I, V y VI, mientras que activan las isoformas II, IV y VII, si bien, en este caso, la activacin requiere la presencia de la subunidad Gs. Las concentraciones de subunidades G necesarias para estos efectos son claramente superiores a las que se precisan de G s, por lo que, en la clula, estas subunidades G no provendrn de Gs sino, probablemente, de otras protenas G ms abundantes, al menos en el tejido cerebral, como las Gi y Go. Por otra parte, diversos isoenzimas de la ciclasa son regulados por incrementos en la concentracin de Ca 2+ y por activacin de la PKC. Ambos factores pueden ser el resultado de la estimulacin de receptores que, va protenas de la familia Gq, activan la fosfolipasa C de fosfoinostidos, la cual, como se explica en el siguiente captulo, genera segundos mensajeros que movilizan Ca2+ intracelular y activan la PKC. Bajas concentraciones de Ca 2+ (< 1 M), activan, va calmodulina, las isoformas I y VIII y, en menor medida, la III. Asimismo, concentraciones del orden micromolar de Ca2+ inhiben, directamente, las ciclasas V y VI, as como a la IX, en este caso por mediacin de la calcineurina. Por su parte, varios isoenzimas de la PKC activan in vitro las
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Receptores para neurotransmisores

adenililciclasas I, II, III, IV, V y VII, e inhiben la VI, mientras que la PKA inhibe las formas V y VI, y algunas CaMK reducen la actividad de los subtipos I y III. De acuerdo con estos datos, se ha propuesto clasificar los isoenzimas de la adenililciclasa en tres grupos. En el primero se hallaran las isoformas I y III que son activadas por Ca2+/calmodulina e inhibidas por subunidades Gi y G y por CaMK, en el segundo los isoenzimas II, IV y VII, activables por subunidades G (en presencia de Gs) y PKC y en el tercero los isoenzimas V y VI, inhibibles por subunidades Gi, Ca2+ y PKA. Los isoenzimas VIII y IX presentan propiedades de regulacin que permitira encajarlos en el primer y tercer grupo, respectivamente Este complejo conjunto de modulaciones indica que el sistema de la adenililciclasa puede ser controlado por ms receptores que los estrictamente acoplados a las protenas G s o Gi. Su significado funcional est relacionado, probablemente, con la distribucin de los isoenzimas y las diferentes protenas G, as como con las concentraciones a las que acta cada regulador. As, la activacin en el tejido nervioso de las adenililciclasas II, IV y VII por las subunidades G, en presencia de subunidades Gs, constituye un caso de regulacin condicional, pues exige la activacin simultnea de protenas Gs y de protenas Gi o Go. Estos subtipos de adenililciclasa muestran alta expresin en dicho tejido, en el que tambin son abundantes las protenas G i y Go, de modo que pueden proporcionar la alta concentracin de subunidades G requerida. Esta regulacin puede explicar la repetida observacin de que la activacin de la ciclasa por estimulacin de receptores acoplados a la protena Gs es potenciada por receptores acoplados a otras protenas G, como las Gi o Go. Segn este razonamiento, este tipo de regulacin por subunidades G no se da en los isoenzimas V y VI, que se encuentran preferentemente en tejidos perifricos, donde las protenas Gi y Go son menos abundantes. Los datos descritos revelan la insuficiencia del tradicional esquema que describe la ciclasa como un efector activado por ciertos receptores va protena Gs e inhibido, independientemente, por otros receptores va protena Gi. Para aadir an mayor complejidad al esquema de regulacin de las adenililciclasas, recientemente se han aportado pruebas que indican que estos enzimas pueden dimerizar. Entre otras, stas incluyen los efectos de mutantes inactivos que reducen la actividad ciclasa sin alterar su expresin o la coinmunoprecipitacin de homodmeros y heterodmeros de isoformas de la adenililciclasa. Lejos de ser completamente conocido, este largamente estudiado mecanismo de transduccin es todava un sistema con importantes aspectos por explorar.

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Protenas G y sistema adenililciclasa

Bibliografa
ANTONI F.A.: Molecular diversity of cyclic AMP signalling, Front Neuroendocrinol 2000; 21: 103-132. BIRNBAUMER L.: Transduction of receptor signal into modulation of effector activity by G proteins: the first 20 years or so..., FASEB J 1990; 4: 3178-3188. CLAPHAM D.E.; E.J. NEER: G protein subunits, Annu Rev Pharmacol Toxicol 1997; 37: 167-203. HAMM H.E.: The many faces of G-protein signalling, J Biol Chem 1998; 273: 669-672. HANOUNE J.; N. DEFER: Regulation and role of adenylyl cyclase isoforms, Annu Rev Pharmacol Toxicol 2001; 41: 145-174. HILDEBRANDT J.D.: Role of subunit diversity in signaling by heterotrimeric G proteins, Biochem Pharmacol 1997; 54: 325-339. HURLEY J.H.: Structure, mechanisms and regulation of mammalian adenylyl cyclase, J Biol Chem 1999; 274: 7599-7602. LEVITZKI A.: From epinephrine to cyclic AMP, Science 1988; 241: 800-806. LEFKOWITZ R.J., J.M. STADEL y M.G. CARON: Adenylate cyclase coupled beta-adrenergic receptors: structure and mechanism of activation and desensitisation, Annu Rev Biochem 1983; 52: 159-186. NEER E.J.: Heterotrimeric G proteins: Organizers of transmembrane signals, Cell 1995; 80: 249-257. PICATOSTE F., E. SARRI y E. CLARO: Protenas G y sistema adenililciclasa, en: J.A. GARCA SEVILLA (ED.): Receptores para neurotransmisores, Barcelona, Ediciones en Neurociencias, 1996: 327-344. ROSS E.M. y T.M. WILKIE: GTPase-activating proteins for heterotrimeric G proteins: Regulators of G Protein signaling (RGS) and RGS-like proteins, Annu Rev Biochem 2000; 69: 795-827. SCHRAMM M. y Z. SELINGER: Message transmission: receptor controlled adenylate cyclase system, Science 1984; 225: 1350-1356. ZHANG G., Y. LIN, A.E. RUOHO y J.H. HURLEY: Structure of the adenylate cyclase catalytic core, Nature 1997; 386: 247-253.

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