Tcnicas Histolgicas

By. Rocker666 ERCA a partir de material didctico Histoembriologia1 Medicina Veterinaria USAC, fue modificado ltima vez en Julio 2011 www.fmvzusac.zobyhost.com

Obtencin de la muestra Fijacin Deshidratacin Aclaramiento Inclusin Corte Tincin Estas tcnicas nos sirven para poder llevar muestras al laboratorio. Para llevar muestras antes debemos seguir una seria de pasos para preparar la muestra y poder observarla en el mejor estado posible. Estas tcnicas son utilizadas en patologa e histologa. Bueno entonces empecemos a describir cuales son los pasos para poder preparar una muestra y observarla en el microscopio para su estudio. Obtencin de la muestra: Cuando uno quiere tomar una muestra lo puede hacer en animales encontrados muertos o en animales que se llevan al laboratorio y son sacrificados. Si los animales son encontrados muertos uno debe tener mucho cuidado, hay que investigar por qu se muri, porque si se enfermo de una enfermedad que puede transmitirse al humano (enfermedad Zoontica), uno debe tomar sus precauciones y no tocarlo directamente. Si uno tiene el animal vivo y quiere que sea examinado, en el laboratorio existe diferente formas para poder sacrificar a un animal, tcnicas desde las ms sencillas hasta las ms violentas. En aves se puede hacer desarticulacin a nivel de la cabeza (vertebras cervicales) En perros se puede hacer por narcotizacin con anestesia, se ponen altas cantidades para que el animal se quede dormido hasta que deje de respirar. (esta es una tcnica muy sencilla que se inyecta en la vena y en teora los animales no siente cuando mueren, ya que solo se quedan dormidos) Tambin se puede hacer por shock elctrico con 2 ctodos uno en la cola y otro en la oreja, se moja al animal y luego se conecta al toma corriente y el animal muere a veces a la primera vez o a las varias veces.

Luego de sacrificado el animal o de encontrado muerto se debe tomar la muestra inmediatamente luego de haber muerto ya que si se deja pasar tiempo empieza la descomposicin de los tejidos ya que ya no hay respiracin y se acumula dixido de carbono y empiezan a morir los tejidos (autolisis), por lo tanto se debe tomar la muestra de inmediato. Para luego hacer los cortos etc. FIJACION: Cuando uno toma una muestra el siguiente paso es fijar la muestra. La fijacin debe hacerse inmediatamente luego de tomar la muestra, la fijacin debe estar de 10 20 veces el volumen de la muestra.

Esto nos servir para preservar los tejidos, podemos usar para fijar el formol al 10% Para fijar muestras histolgicas podemos usar fijadores como: Formol ( fijador ordinario es el ms barato y fcil de conseguir penetra bien en los tejidos fijacin de 12 a 24hrs) Buoin (picro-formalinda fijador acido pcrico es buen fijador de glucgeno pero altera los lpidos y disminuye la cantidad de hierro fijacin de 1 12 hrs) Carnoy (fijador en alcohol buen fijador para glucgeno y nissy pero disuelve otros elementos citoplasmticos ya que produce hemolisis y lacado de glbulos rojos y disuelve lpidos y la mielina fijacin es de 3 6 hrs) Zenker (fijador metlico destruye glbulos rojos y elimina gran parte del hierro de la hemosiderina, es excelente para preservar detalles cuando se necesitan fotografas) Helly (fijador metlico es buen fijador para medula sea y bazo, excelente para tomar fotografa tiempo de fijacin es de 6 15 hrs.) Luego de fijar el tejido como ya lo dijimos 10 20 veces el volumen de la muestra procedemos a deshidratar la muestra DESHIDRATACION DE LA MUESTRA:

La muestra es fijada a base de agua, la muestra entonces est llena de agua, esa agua debemos extraerla.

Y aclarar la muestra con un alcohol, la deshidratacin y aclaracin se hace en un aparato conocido como Autotechnicon, este aparato tiene un reloj donde se coloca el tiempo para que se lleve a cabo el periodo de deshidratacin y aclaramiento, vemos en la imagen de arriba tenemos un Autotechnicon el cual tiene 12 recipientes, la muestra debe pasar en cada recipiente una hora exacta entonces se programa la mquina para que funcione por la noche o por la tarde con la muestra para que al siguiente da est listo El Autotechnicon tiene 2 recipientes con formol, 5 recipientes con alcohol isopropilico, tiene 3 recipientes con xilol y 2 recipientes con parafina. El Autotechnicon sirve para sacar el agua y luego introducir parafina dentro del tejido, para que se pueda introducir la parafina dentro del tejido se usa xilol este permite que la parafina ingrese al tejido. La parafina debe de estar fundida, liquida totalmente a una temperatura de 56 a 60 grados centgrados, para estar lista para ingresar dentro de los tejidos. Esto con el propsito de que cuando se haga el corte del tejido no se vaya a daar hacindose pedazos y as se mantengan las caractersticas. INCLUSION:

Luego de deshidratar y aclarar la muestra pasamos a la inclusin que consiste en meter el tejido en un bloque de parafina. Para meter el tejido en estos bloques hay una maquina donde hay parafina a 60 grados y una plancha fra. La muestra de tejido se mete en unos moldes de los cuales existen de cartn y plstico, al meter la muestra al molde este se llena de parafina, al estar lleno de parafina se pasa a la plancha fra, para que empiece la parafina a solidificarse. Al endurecerse completamente la parafina se quita el molde para proceder al corte.

CORTE:

Luego del proceso de inclusin, pasamos al corte histolgico en MICROTOMO que es el aparato que vemos en la imagen que hace cortes bien delgados, utilizamos para las muestras generalmente de 4 a 5 micras de grosor, esto permite que la luz del microscopio atraviese el tejido y nos permita observarlo sin problemas. (para fijar el cubo al soporte del micrtomo se puede derretir su parte ventral un poco para que se adhiera al soporte y no se mueva) Hay diferentes micrtomos como por ejemplo: De deslizamiento Rotario De balanceo De congelacin Para cortes ultra delgados que se usan en microscopia electrnica

Despus de haber sido cortada la muestra en el micrtomo a la par hay un bao de Maria donde hay agua y gelatina histolgica a 60 grados, entonces la capa delgada que cortamos la dejamos caer all en el bao Maria para que flote (la gelatina es para que el tejido que cortamos no se desplace del porta objetos) cuando uno quiere colocar el tejido sobre el portaobjetos solo se mete el porta objetos dentro del bao Maria y el tejido queda adherido al portaobjetos debido a la gelatina.

Ya cuando uno tiene adherido el tejido al porta objetos se pasa el tejido a un aparato que le quita un poco de parafina al tejido y despus se lleva a un horno que esta a 60grados donde pasara 30 minutos para que seque.

TINCION: Luego de transcurridos los 30 minutos en el horno y nuestro corte este seco pasamos a la tincin donde le daremos color a nuestro corte de tejido y veremos el citoplasma de color rosado y los ncleos de color oscuro.

Para el proceso de tincin haremos lo siguiente: a. Desparafinar el corte con xilol, sumergiremos el corte en xilol para esto debemos tener 3 recipientes con xilol y sumergir el corte 5min. En cada recipiente. b. Luego pasar el tejido en 3 recipientes con alcohol isopopilico 5min. En cada uno c. Luego re hidrataremos el tejido con agua corriente durante 5minutos d. Luego de re hidratar el tejido lo coloreamos con hematoxilina durante 5min. e. Luego lavamos el corte rpidamente con agua corriente (solo es de pasar el tejido a que le caiga agua) f. Luego sumergimos el corte en alcohol acido para diferenciar (alcohol isopropilico al 80% con 1cc de acido clorhdrico por cada 100cc de alcohol al 80%) g. Luego lavamos durante 10min. Para azulear los cortes h. Luego sumergimos 1 minuto el corte en Eosina al 5% i. Luego lavamos rpidamente con agua, (solo que le caiga agua) j. Luego pasamos a deshidratar el corte otra vez sumergindolo en 3 baos en alcohol isopropilico pero solo unas pocas sumergidas en cada bao. k. Aclaramos el corte sumergindolo en xilol igual con unas pocas sumergidas l. Luego ya tenemos listo el corte para observarlo en el microscopio, pero para evitar que se dae le ponemos un cubre objetos el cual pegaremos con algn pegamento como: Permount, merckoglass, blsamo de Canad, etc. m. Luego al observar en el microscopio veremos de color rosa los citoplasmas y de color oscuro los ncleos, esto es debido a la hematoxilina eosina (H.E.)

Descalcificacin de tejidos duros (huesos)

La descalcificacin consiste en disolver las sales de calcio y el fosfato de los huesos (cal y p) Los medios utilizados para descalcificar huesos son los cidos; todas las soluciones acidas lesionan las sustancias orgnicas de base en el hueso y otros tejidos, por lo tanto deben protegerse por fijacin antes de iniciar la descalcificacin. La fijacin la hacemos con piezas de 2 a 4mm de espesor las cuales cortamos con sierra de calado o alambre, luego ponemos la pieza obtenida en formol con cloruro mercrico, liquido de Helly, Susa de heidehain o liquido de Zenker. Lo mantendremos en esta solucin durante 15 a 24hrs Aunque si se puede tener ms tiempo en formol es mucho mejor para que resista la accin hidrolitica de los cidos empleados en la descalcificacin. Si lo que queremos es estudiar la medula o el hueso esponjoso desechamos el hueso compacto y nos quedamos solo con lo que queremos estudiar. Si lo que queremos estudiar es la medula sea, la debemos extraer luego de morir el animal no esperar tanto tiempo ya que pueden ocurrir detalles enzimticos que pueden destruir muchas clulas. Descalcificacin: Para descalcificar el hueso lo metemos en acido frmico o acido ntrico, acido tricloracetico, acido clorhdrico y verseno (EDTA) El acido frmico preserva mejor el tejido para la tincin El acido ntrico es 2 veces ms rpido que el frmico El volumen de solucin descalcificante es de 30ml/gr. De tejido y se debe cambiar 1 o 2 veces, al da hasta terminar la descalcificacin.

Pruebas para ver si ya se descalcifico el hueso: Podemos hacer pruebas de rayos x, flexibilidad del hueso, pruebas qumicas, resistencia a la ua y agujas. Inclusin del hueso: La inclusin se realiza durante 1 o 2 horas al vacio y en parafina Tincin del hueso: La tincin se puede realizar con: - Hematoxilina eosina (H.E.) - Mtodo schmorl con picriotionina para el hueso compacto con (H 2 0 + tionina/alcohol ms agua destilada)

By. Rocker666 ERCA a partir de material didctico Histoembriologia1 Medicina Veterinaria USAC, fue modificado ltima vez en Julio 2011 www.fmvzusac.zobyhost.com