Prctica No. 0 Espectrofotometra: Espectros de absorcin y cuantificacin espectrofotomtrica de biomolculas. Diego Andrs Donoso Cod.

201212675 Mauricio Huertas Cod. 201212306 Profesor Luis Eduardo Diaz. 05 de agosto de 2013 Universidad de la Sabana Facultada de Ingeniera Resumen: La clorofila es un pigmento natural, se encuentra en la mayora de las plantas y responde a la coloracin verde de la misma. En la naturaleza se pueden encontrar la clorofila a y la clorofila b. Esta prctica buscaba cuantificar estos pigmentos en cuatro muestras problemas diferentes utilizando la espectrofotometra en la regin UV-Vis. La clorofila absorbe a 665 nm. Los resultados arrojados en esta prctica tuvieron poca relacin entre ellos y se observa fcilmente con la desviacin estndar de los mismos. La ley de Lambert-Beer fue usada en esta prctica porque se analizan concentraciones muy pequeas. El uso de disolventes adecuados y de las condiciones del equipo fue fundamental para ptimos resultados. La clorofila se encuentro presente en las muestras problema (cilantro, apio, perejil y espinaca) pero su cuantificacin no se pudo determinar con exactitud. Abstract: The chlorophyll is a natural pigment, its located in most of the plants and aswer to the green color of them. In nature, there are the chlorophyll a and the chlorophyll b. This practice was looking for to quantify those pigments in four different analites using spectrophotometry in the UV-Vis region. The chlorophyll absorbs at 665 nm. The outcomes in this practice had a few relationships between them and are easy to watch with the standard deviation of them. The Lambert-Beer law was used in this practice because there were analites with concentrations very smalls. The use of adequate solvents and the conditions of the equipment was fundamental for optimal results. The chlorophyll was found in the analites (coriander, celery, parsley and spinach) but their quantify couldnt been done with accuracy. 1. Objetivos: Cuantificar la concentracin de clorofila en cuatro muestras problemas por medio de un anlisis espectrofotomtrico. Determinar el porcentaje peso a peso de la clorofila en una muestra problema de cilantro (coriandrum sativum L.) 2. Introduccin: El humano puede percibe el verde gracias a las radiaciones electromagnticas que recibimos de los pigmentos que se hallan en una hoja, por ejemplo la clorofila absorbe en el espectro visible a longitudes de onda de color azul-violeta y roja mientras que transmite y refleja ondas complementarias verdes, esto es gracias 1 a la capacidad de esta sustancia biomolecular de absorber diversas longitudes de onda que pueden detectarse gracias a la espectofometria, el cual es un mtodo en el que las sustancias absorben la luz en regiones ultravioletas o visibles del espectro (Neil A. Campbell, 2007). Entre los pigmentos de una planta existen varias clases de clorofila diferenciados por su estructura

molecular. La molcula de clorofila est formada por una cabeza tetrapirrolica con un tomo de magnesio en su centro y cola de ditol(alcohol de cadena larga) (Garca B. Francisco, 2006) . Existe una clorofila a, esta se relaciona con la tansformacin de la energa de la luz en energa qumica y una segunda clase de clorofila, que en las plantas y algas verdes es la clorofila b. El Cilantro (Coriandrum sativum L.) es una planta anual, herbcea, de 40 a 60 cm de altura, actualmente es una de las especias con mayores implicaciones econmicas, ya que es un cultivo con buen rendimiento y muy buen precio internacional. El color del tallo ms o menos es acanalado de color verde y, a veces se vuelve rojo o violeta durante el perodo de floracin. Las hojas son de color verde o verde claro y su parte inferior a menudo es brillante. Los usos tradicionales de la planta, que se basan en los productos primarios, es decir, las frutas y las legumbres y hierbas, son de dos tipos: medicinal y culinaria (Diederichsen, 1996). Para establecer el espectro en el que absorbe la clorofila para la regin del espectro UV-Vis (190-900 nm) se debe aplicar un escaneo por toda esta zona y analizar los picos de absorcin en una grfica de: longitud de onda-absorcin y escoger el pico ms simtrico y adecuado. Con la ley de Lambert-Beer se puede determinar cuantitativamente la concentracion de la clorofila en una muestra dado. Cuando la luz se encuentra con la materia esta puede ser reflejada, transmitida o absorbida. 3. Materiales y reactivos:

3.1. Materiales: Espectrofotmetro. Celdas de vidrio especializadas para medir en el espectrofotmetro (1.00 cm) Agitador de tubos de ensayo. Balanza electrnica. Gradillas con 12 tubos de ensayo. Juegos de pipetas graduadas (0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10.0 y 25.0 mL) Juego de micro pipetas Probetas 100 mL Vasos precipitados 100 mL 7 balones aforados de 25 mL Agitador de vidrio Aparato de extraccin soxhlet. 3.2. Reactivos: Etanol-ter etlico (9:1) 200 gr de Cilantro, Apio, Perejil y Espinaca. 4. Procedimiento: Ver anexos . 5. Datos: Primero se realiz una extraccin soxhlet con una mezcla de solventes (etano-ter etlico) a cuatro tipos distintos de plantas: cilantro, apio, perejil y espinaca. De estos se determin un porcentaje de humedad (Eduardo, 2003):
( )

Como paso siguiente se realiz un barrido o escaneo en toda la regin UV-Vis (190-900 nm) para encontrar la longitud de onda a la 2

Muestra Cilantro Alejandra y Nathaly m1 m2 m3 m1 m2 m3 Perejil Ma. Victoria y Cesar m1 m2 m3 m1 m2 m3

Absorbancia 0,156 0,157 0,161 0,255 0,262 0,263 0,346 0,352 0,361 0,136 0,226 0,272

que absorbe el patrn de clorofila. De este barrido, aparecieron dos picos apreciativos: uno grande y asimtrico en la regin de los 400 nm y otro ms pequeo que el anterior pero simtrico alrededor de los 665 nm. Paso siguiente se realiz una curva patrn de la solucin estndar de clorofila y estos fueron los datos:
Tabla 1 Datos de solucin patrn de clorofila, Concentracin vs Absorbancia a 665 nm. Grupos 1,2,3 y 4.

Diego y Mauricio

Vivian y Laura

muestras problema con el espectrofotmetro:

Tabla 3 Datos de absorbancia a 665 nm para los muestras problema con los grupos 1,2,3 y4.

Muestra Espinaca

Absorbancia 0,525 0,511 0,521 0,611 0,618 0,607 Apio 0,324 0,326 0,327 0,357 0,369 0,359

Concentracin (g/mL) 2 4 8 12 16 20

Alejandra y Nathaly Diego y Mauricio 0,02 0,031 0,028 0,069 0,082 0,084 0,004 0,005 0,008 0,029 0,039 0,049

Ma. Victoria y Cesar 0,012 0,018 0,03 0,047 0,095 0,076

Vivian y Laura 0,012 0,029 0,038 0,053 0,038 0,063

Carlos y Nelson

Carolina y Sofa

m1 m2 m3 m1 m2 m3 m1 m2 m3 m1 m2 m3

Jonathan y Ma. Fernanda

Tabla 2 Datos de solucin patrn de clorofila, Concentracin vs Absorbancia a 665 nm. Grupos 5,6,7 y 8.

Karen Sneider

Tabla 4 Datos de absorbancia a 665 nm para los muestras problema con los grupos 5,6,7 y 8.

Concentracin (g/mL) 2 4 8 12 16 20

Carlos y Nelson 0,023 0,045 0,047 0,062 0,077

Carolina y Sofa 0 0,005 0,0014 0,042 0,052 0,06

Jonathan y Ma. Fernanda 0,018 0,022 0,032 0,025 0,087 0,074

Karen Sneider 0,025 0,095 0,047 0,054 0,091 0,066

6. Clculos. Con base en la ley de LambertBeer se realiza la curva de calibracin para obtener un coeficiente de extincin especfico ( ) para la clorofila en unidades de ( ) . La pendiente de la ecuacin de la recta representa el coeficiente de extincin.

A esta misma longitud de onda, se calcul la absorbancia de las

Grfico 1 Relacin de Absorbancia Vs Concentracin de la muestra patrn medidos a 665 nm. Grupo 2 Mauricio y Diego.

Alejandra y Nathaly

Muestra m1 m2 m3 Media m1 m2 m3 Media m1 m2 m3 Media m1 m2 m3 Media

Absorbancia 0,156 0,157 0,161 0,255 0,262 0,263 0,346 0,352 0,361 0,136 0,226 0,272

Diego y Mauricio

Ma. Victoria y Cesar

Vivian y Laura

Concentracin (g/mL) 36,150 36,400 37,400 36,650 96,556 99,148 99,519 98,407 78,409 79,773 81,818 80,000 54,591 95,500 116,409 88,833

Desviacin estandar. 0,354 0,177 0,530 0,354 1,309 0,524 0,786 0,873 1,125 0,161 1,286 0,857 24,213 4,714 19,499 16,142

Tabla 6 Datos de absorbancia a 665 nm para los muestras problema con los grupos 5,6,7 y 8.

Con las absorbancias de los duplicados se interpolan las absorbancias para hallar las concentraciones de la siguiente forma: ( ) En este caso se tom la primera absorbancia del grupo 2, Mauricio y diego, y as se realiz para todos los grupos. Este procedimiento esta de acuerdo a la ecuacin de la ley de LambertBeer (Skoog, 2005): Estas absorbancias fueron duplicadas para tener una corroboracin en la exactitud de los datos y se muestran en la siguiente tabla:
Tabla 5 Datos de absorbancia a 665 nm para los muestras problema con los grupos 1,2,3 y4.

Carlos y Nelson

Muestra m1 m2 m3 m1 m2 m3 m1 m2 m3 m1 m2 m3

Carolina y Sofa

Jonathan y Ma. Fernanda

Karen Sneider

Absorbancia 0,525 0,511 0,521 Media 0,611 0,618 0,607 Media 0,324 0,326 0,327 Media 0,357 0,369 0,359 Media

Concentracin (g/mL) 181,143 176,143 179,714 179,000 168,351 170,243 167,270 168,622 88,500 89,056 89,333 88,963 236,769 246,000 238,308 240,359

Desviacin estandar. 1,515 2,020 0,505 1,347 0,191 1,147 0,956 0,764 0,327 0,065 0,262 0,218 2,538 3,989 1,450 2,659

A los conjuntos de duplicados de cada grupo se le clculo la media y la desviacin estndar con respecto a la misma para relacionar la fiabilidad de los datos. Esto se hace mediante la siguiente frmula (Skoog, 2005):

Para calcular el % peso a peso de la clorofila en el cilantro se tom 4

la concentracin promedio de los datos de los grupos 1 y 2 , Alejandra y Nathaly y Diego y Mauricio respectivamente, y el peso de la muestra problema: Grupo 1:

Grupo 2:

7. Anlisis de resultados. La clorofila, pigmento natural de la mayora de las plantas, fue determinada en diversas muestras problema. Desde una solucin patrn de clorofila con concentracin (0,5 mg/mL) en etanol 90%, ter etlico 10% se realiz un escaneo entre las longitudes de onda (190-900 nm) de la cual se obtuvieron diversos picos. Uno de ellos, 665 nm, resalt por su simetra pero no por su intensidad. Esto concuerda con la literatura1 .Sin embargo es fiable tomar esta longitud como la de absorcin para el analito (Skoog, 2005). La curva de calibracin fue realizada independientemente en cada grupo para la misma solucin patrn. Como se observa en las tablas 1 y 2 se recogieron
1

los resultados de absorbancia y concentracin para graficarlos y por medio de la relacin lineal de Lambert-Beer se hall el coeficiente de extincin especfico. La diferencia de absorbancias es notoria y se le atribuye a errores manuales en el manejo de los instrumentos de laboratorio. Cave recalcar como el disolvente puede afectar la relacin de estos datos porque el ter etlico reacciona con las cubetas de cuarzo, an en un porcentaje tan pequeo de concentracin, y las opaca haciendo que el haz incidente se refracte antes de entrar en contacto con el analito (Douglas A. Skoog, 2008). Se calcul la media de los coeficientes de extensin para tener una idea que tan relacionados estn cada uno de estos con el promedio del laboratorio. Esta media nos arroj 0,00309 ( ) . Entre los grupos ms alejados a este promedio se encuentran el grupo 8 (Karen y Sneider) y el grupo 3 (Ma. Victoria y Cesar). Es de esperar que las concentraciones por interpolacin de estos grupos no sean de fiar. Para el grupo 5 (Carlos y Nelson) se decidi omitir una de las absorbancias experimentales porque este dato estaba muy alejado de la relacin lineal que mantenan sus otros datos. El intercepto, tericamente es un valor nulo pero experimentalmente a valores ms 5

Extrado de Stvdia botnica 13; Pg 115-121. Ao:1994.

pequeos de 0,01 es aceptable este error y se toma en cuenta para la interpolacin (Skoog, 2005). El grupo 8 (Karen y Sneider) tienen el coeficiente de correlacin ( ) ms cercano a cero, esto implica que sus datos no guardan una relacin lineal como se esperaba. Para algunos grupos, si no se toma para anlisis la absorbancia ms alejada de su respectiva relacin lineal, alcanzan a tener un buen . Es caracterstico de la mayora de grupos que la absorbancia a una concentracin de 4 se aleja de la relacin lineal de los dems datos y es posible que el compartimiento para la cubeta estuviera interfiriendo con el haz policromtico (Douglas A. Skoog, 2008). Con las muestras problema se tomaron 5 mg y se llevaron a 25 mL para luego medir su absorbancia a 665 nm, esto gracias al barrido inicial, y hacer unos duplicados. Como se observa en la tabla 5 y 6 se interpolaron cada una de las absorbancias para cuantificar la concentracin de clorofila. La media y la desviacin estndar con respecto a esta nos dan una imagen de cmo estn relacionadas:
Tabla 7 Datos de promedios de media y de desviacin estndar de la concentracin de las muestras problema.

Cilantro Perejil Espinaca Apio

Concentracin (g/mL) Alejandra y Nathaly 36,65 Diego y Mauricio 98,407 Ma. Victoria y Cesar 80 Vivian y Laura 88,833 Carlos y Nelson 179 Carolina y Sofa 168,622 Jonathan y Ma. Fernanda 88,963 Karen Sneider 240,359

Desviacin estandar. 0,354 0,873 0,857 16,142 1,347 0,764 0,218 2,659

Ver anexos para diagrama de barras. De aqu se puede observar como los datos de tres grupos no son fiables por su poca relacin con el promedio de los mismos. El caso ms notorio es el del grupo 4 (Vivian y Laura) en el que sus duplicados tienen una mnima relacin. Pero es factible pensar que para el perejil la concentracin de clorofila en este est en un rango de 80 a 88 y se confirma porque estos dos grupos tienen una relacin en la solucin patrn muy parecida pero sus datos tiene poca confianza y la concentracin cuantificada no es muy vers. Para las muestras de cilantro y apio, cada grupo arrojo una concentracin media muy distinta (Skoog, 2005). En el caso del cilantro la diferencia de concentracin es elevada y adems la desviacin estndar de cada grupo con su media no es muy alta por lo que los datos son confiables para el anlisis. El grupo 2 (Diego y Mauricio) tienen una mejor curva de calibracin que el otro grupo pero hubiera sido conveniente utilizar otro duplicado de la curva de calibracin para saber cul era el coeficiente de extincin ms 6

certero para la clorofila a las condiciones del laboratorio (Sanz, 1994). En el caso de la espinaca la relacin de los dos grupos no es la mejor pero es considerablemente mejor que la de los dems grupos. Para el apio el grupo 8 de (Karen y Sneider) tuvieron tambin una desviacin de sus datos apreciable por lo que no se puede confiar de sus datos. Para los del cilantro del grupo

1 (Diego yMauricio) y 2 (Nathaly y Alejandra) se observa una variacin en sus porcentajes de clorofila ya que la concentracin promedio del grupo 1 (36,65 ) es mnimo frente a la ) por lo cual al hacer los cantidad del grupo 2 (98,407 clculos respectivos, las proporciones no se pueden considerar aceptables por errores durante la experimentacin afectaron los porcentajes de los dos grupos, por lo cual sera necesario un duplicado ms para observar que grupo estara desviado frente a su respectivo . El porcentaje de humedad calculado para el cilantro en muy elevado, esto concuerda con que esta planta logra almacenar ms humedad de la que puede. No se debe olvidar que es una planta que se cultiva en climas fros donde la humedad relativa es 7

considerablemente alta (Murillo, 2006). 8. Conclusiones. El uso de los disolventes en esta prctica afecto la exactitud de los resultados y las condiciones del equipo no se creen que sean ptimas por el error que ocurri en casi todos los grupos. Los datos obtenidos muestran una desviacin con respecto a su media, por lo que no son fiables para tomarlos como concentraciones exactas de la clorofila. El porcentaje peso a peso del cilantro no guarda una relacin aceptable entre los grupos que la utilizaron como analito, por lo que la cuantificacin de la misma es poco fiable. 9. Bibliografa. Diederichsen, A. (1996). Coriande, Coriandrum sativum L. Rome, Italy. Gatersleben, Germany: International Plant Genetic Resources Institute. Douglas A. Skoog, S. R. (2008). Principios de Anlisis Instrumental. Mxico, Sexta edicin: CENGAGE learning. Eduardo, O. C. (2003). Procesamientos de alimentos. Manizales: Universidad Nacional de Colombia Sede Manizales. Ege, S. (2000). Qumica Orgnica: Estructura y reactividad. Barcelona, Edicin tercera: Editorial Revert.

Garca B. Francisco, R. C. (2006). Introduccin al funcionamiento de las plantas. Valencia: Editorial Universidad Politcnica de Valencia. Murillo, I. C. (2006). R.A.S.P.A. Relacin agua, Suelo, Planta, tmosfera. Bogot: Universidad Nacional. Neil A. Campbell, J. B. (2007). Biologa. Madrid, Espaa: Editorial Medica Panamericana. Sanz, S. d. (1994). Coeficientes de extincin de clorofilas y feofitinas (ayb) en DMSO y ecuaciones para el clculo de sus concentraciones. Stvdia botnica 13, 115-121. Skoog, W. H. (2005). Fundamentos de Qumica Analitica. Mexico: Thomsom. 10. Anexos.

10.1. PROCEDIMIENTO Espectro de absorcin UV-Vis para clorofila para determinar su max Preparar una solucin patrn de 0,5mg/mL en una mezcla de etanol 90% y ter de etlico 10%

Relizar un barrido del espectro UV-Vis con el espectrofotmetro

Con la solucin patrn montar una alcuota en una celda de cuarzo

Determinar max y realizar la curva de calibracin

Curva de calibracin para clorofila

Con el patrn preparado en la primera parte preparar diluciones de 25 mL de 2, 4, 8, 12 16, y g/mL

Pesar 200g de cilantro y crtalos en pequeos trozos

Determinacin de clorofila en el cilantro

Determina la absorbancia y realice curva de calibracin

Dejar en estufa 3h a 40 C y pesar el pasto y determinar el % de humedad

Colocar el material seco dentro de los dedales de soxhlet y llevar a cabo la extraccin con una mezcla de etanol-ter etlico (9:1) durante 3 h

Preparar tres soluciones a 50 L y llevarlos a un volumen de 2ml para determinacin de clorofila en a condiciones de la curva de calibracin

10.1.

Barra de medias y desviacin estndar.

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