UNIVERSIDADE DE BRASLIA DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA CIVIL E AMBIENTAL MICROBIOLOGIA AMBIENTAL E EXPERIMENTAL PROFESSORA LENORA LUDOLF GOMES

Avaliao da capacidade de biodegradao aerbia da microbiota indgena do solo atravs da respirometria

Clarice Carvalho Silva 11/0010132 1. Introduo Micro-organismos so considerados eficientes biodegradadores por causa de sua abundncia, variedade de espcies e versatilidade catablica e anablica, alm de sua habilidade de adaptao a condies ambientais diferenciadas. Quando as condies aerbias so mantidas, o produto metablico dos micro-organismos aerbios geralmente transformado em gua, CO2 e biomassa atravs da respirao, processo conhecido como mineralizao (MORAIS E TAUK-TORNISIELO, 2009). Levando isso em conta, estudos sobre biodegradao de resduos tm sido realizados nos ltimos anos com o objetivo de encontrar formas de diminuir a quantidade de resduos industriais dos mais diversos. Resduos esses, que se despejados no ambiente de forma inapropriada, causam impactos ambientais negativos e apresentam um risco potencial sade de todas as formas de vida (MIRANDA et al., 2007). A anlise do consumo de oxignio pelos micro-organismos envolvidos nos processos de estabilizao faz parte do que se denomina respirometria, tcnica utilizada por estudantes e profissionais que atuam na rea de controle da poluio e gesto de recursos hdricos e do meio ambiente, como ferramenta no monitoramento e na modelagem de processos de tratamento biolgico de esgotos e resduos slidos (BERNASDES E SOARES, 2005).

2. Objetivos i. Estimar, atravs da taxa de respirao, a capacidade biodegradadora da microbiota indgena do solo para os diferentes tipos de substratos: Glicose, Chorume, Benzeno e Tolueno. Verificar quais substratos se apresentam timos desenvolvimento da microbiota e quais so txicos a ela. para o

ii.

iii.

Definir se o solo da Estao de Biologia da Universidade de Braslia apropriado para implantao de tecnologias de Biorremediao.

3. Metodologia A respirometria a medida e a interpretao da taxa de respirao em um processo biolgico de degradao de terminado substrato definido como a quantidade de oxignio consumido pelos micro-organismos, em um determinado volume de controle por unidade de tempo (BERNASDES E SOARES, 2005). O respirmetro consiste basicamente em um reator fechado, onde o substrato colocado em contato com uma amostra de solo, com microbiota indgena para degradao. O princpio do mtodo que apenas haver produo de CO2 dentro do reator se ali houver efetivamente, seres vivos respirando, e consequentemente, degradando o substrato a quem esto submetidos. O teste respiromtrico foi realizado no Laboratrio de Anlise de guas do Departamento de Engenharia Civil e Ambiental da Universidade de Braslia, num perodo de 54 dias, como atividade da disciplina Microbiologia Ambiental e Experimental, Turma A. Foram utilizados seis respirmetros de Bartha, um equipamento relativamente simples que apresenta duas cmaras interligadas. Esses respirmetros foram montados segundo a Norma Tcnica NBR 14283, de Fevereiro de 1999, da seguinte forma: Primeiramente foram colocados dentro da Cmara maior de cada reator 50g de solo, coletados da estao de biologia da Unb,. Depois foram colocados 10 mL do substrato que se desejava analisar como potencial fonte de carbono para a microbiota indgena do solo. Os substratos utilizados foram: Glicose, Chorume (duplicata), Benzeno e Tolueno. Em um dos reatores foi feito um respirmetro de controle, com apenas a adio de gua sem presena de CO2, para que a microbiota utilizasse a prpria matria orgnica presente no solo como substrato. Na outra cmara do reator, foram adicionados 10 ml de soluo de Hidrxido de Potssio (KOH), com a funo de reagir com o CO2 gerado no sistema, e formar K2CO3. Os respirmetros foram ento fechados e lacrados com fita veda rosca, para que no houvesse entrada ou sada de CO2 do sistema, e levados estufa 28C para um perodo de incubao. A cada perodo, que alternava entre 3, 4 ou 7 dias, a soluo de KOH dos reatores era removida do sistema, e colocada em um frasco Erlenmeyer de 100 ml. Nesse mesmo frasco, eram acrescentadas 4 gotas do indicador fenolftalena (que apresenta colorao rosa para substncias bsicas e

transparente para cidas) e 1,0 ml de soluo de Cloreto de Brio (CaCl2) 1,0 N, para que a soluo de K2CO3 gerada no sistema, fosse precipitada na forma de Carbonato de Brio (BaCO3). Simultaneamente, era realizada uma reoxigenao do sistema, por meio da injeo de ar comprimido, com o emprego de uma bomba de aqurio, atravs de uma entrada contendo cal soldada, que impede a sada de CO2 do sistema, e permite apenas a entrada do oxignio, essencial para a atividade metablica dos micro-organismos utilizados. Alm disso, era feita uma lavagem do brao lateral do respirmetro, com a insero e retirada de 10 ml de gua destilada do reator por trs vezes consecutivas. Essa gua era despejada no frasco de titulao. Para a continuidade do experimento, eram adicionados mais 10 ml de KOH ao sistema. Os respirmetros eram ento lacrados e encubados para uma avaliao posterior da atividade microbiana. Para a titulao, utilizou-se uma bureta contendo uma soluo de cido Clordrico (HCL) 0,1 N. O cido era introduzido lentamente (gota a gota) ao Erlenmeyer, at que ocorresse a mudana da soluo de rosa para branco. Para cada titulao realizada, foi anotada a quantidade de cido utilizada, o que representava a quantidade de KOH excedente, que no havia reagido com o gs carbnico produzido pelo sistema. Alm da titulao realizada em cada respirmetro, foi feita a titulao do branco, inserindo ao Erlenmeyer 10 ml de KOH puros e os outros reagentes utilizados na titulao normal. A Norma Brasileira NBR 14283 (ABNT,1999), disponibiliza a forma correta para fazer os clculos referentes expresso dos resultados da seguinte forma: i. A produo de gs carbnico entre a determinao anterior e a presente calculada por: (Equao 1) Onde: Volume de HCL 0,1 N utilizado para titular o branco (ml); Volume de HCL 0,1 N utilizado para titular o tratamento (ml); Fator para transformar equivalente em Fator do HCL 0,1 que igual a 0,1 de gs carbnico;

ii. Para determinar a quantidade de gs carbnico devida biodegradao (CO2), subtrair a quantidade de CO2 produzida no respirmetro-controle da quantidade obtida no respirmetro-ensaio. Construir uma tabela e um grfico

que forneam a quantidade de CO2 acumulado produzida por biodegradao em funo do tempo de incubao.

iii. Admitindo-se que a metade da quantidade de carbono que biodegradado convertida em CO2 e a outra metade incorporada na forma de biomassa, a quantidade total de carbono biodegradado se d pela seguinte equao: (Equao 2) Onde: mols de carbono biodegradado; mols de CO2 produzido.

4. Resultados Os resultados referentes quantidade de HCl necessria para titular o KOH encontram-se na Tabela 1. Foram obtidos dois valores de branco, o primeiro, com 16 ml, utilizado a primeira at a quinta leitura, e o segundo com 17,5 ml, utilizado at o final do experimento. Os dados referentes segunda leitura, realizada no 10 dia do experimento foram desprezados, pois foram obtidos de forma errada.

Tabela 1: Volume de HCl (mL) Intervalo leituras Grupos 1A gua 2A Glicose 3A Chorume 4A Chorume 5A Benzeno 6A Tolueno 7 4 7 3 4 3 4 3 4 3 4 3 4 3 dias dias dias dias dias dias dias dias dias dias dias dias dias dias L1 2,0 0,0 0,0 L2 L3 5,8 0,0 7,9 5,7 L4 4,0 0,0 6,5 4,0 L5 L6 L7 L8 L9 L10 L11 L12 L13 L14 11,5 0,0 10,2 Sem 0,0 leitura 11,7 15,9 10,9 15,2 9,1 8,5 11,4 9,1 11,4 7,8 10,0 8,4 10,8 10,2 0,0 0,0 0,0 0,0 3,6 2,0 5,8 5,6 6,9 8,9 12,5 12,4 14,3 12,8 14,7 12,2 13,5 12,1 13,3 13,6 10,0 9,7 11,7 10,7 12,2 9,6 11,2 9,5 12,4 11,1

14,5 15,1 15,6 16,8 17,5 17,4 17,9 14,7 15,8 15,8 16,1 15,4 14,1 14,2 15,5 15,7 17,3 17,2 17,5 14,7 15,4 13,2 15,3 14,9

5. Discusso Assumindo que a quantidade de cido clordrico titulada, representa a quantidade de base que no reagiu com o CO2, podemos inferir que quanto menor a quantidade de HCL titulada, maior a taxa de respirao da microbiota presente nos respirmetros, e quanto maior o intervalo das leituras, maior foi quantidade de CO2 liberada, por isso, menor foi a quantidade de HCL titulada. Ento, a quantidade de CO2 produzida nos respirmetros, calculada a partir da Equao 1 apresentou valores oscilando para todos os respirmetros. Fato ilustrado no Grfico 1.

Quantidade de CO2 produzida

100 80 60 40 20 0 -20 0 10 20 30 40 50 60 6A Tolueno 1A gua 2A Glicose 3A Chorume 4A Chorume 5A Benzeno

Grfico 1: Quantidade de CO2 produzida pelos respirmetros com diferentes tratamentos.

Pode-se perceber a partir da anlise do Grfico 1, que inicialmente houve uma exploso na atividade metablica nos respirmetros contendo glicose, no sendo possvel quantificar exatamente a taxa de respirao da microbiota, pois houve mais produo de CO2 do que a quantidade de KOH no respirmetro, no sendo necessria a titulao at a sexta leitura, quando essa taxa comeou a decair. No respirmetro com gua, a taxa de respirao dos micro-organismos comeou alta e a partir da quarta leitura diminuiu at se tornar mais ou menos constante, isso pode se relacionar ao fato de os micro-organismos terem vivido uma fase exponencial at a quarta leitura, e depois permaneceram na fase estacionria. Os respirmetros com chorume apresentaram resultados bem distintos. Na primeira leitura, os dois apresentavam alta taxa de respirao, mas a partir da terceira leitura, o respirmetro com chorume 4A comeou a apresentar resultados semelhantes aos do respirmetro de controle, enquanto que o chorume 3A apresentou taxas de respirao cada vez mais decrescentes durante toda a realizao do experimento. Isso pode ter ocorrido porque o

chorume um substrato que contm diversos compostos, alguns simples e outros mais complexos. Alm disso, pode haver micro-organismos diferenciados em cada respirmetro, fato que pode ter causado tal alterao. Provavelmente no respirmetro com amostra de chorume 4A existia uma maior quantidade de compostos assimilveis pela microbiota que na amostra de chorume 3A. No caso dos respirmetros contendo benzeno e tolueno, foi verificado que as taxas de respirao dos micro-organismos foram baixas desde a primeira leitura e continuaram decrescendo at o final. Percebeu-se ainda que no final do experimento, todos os microorganismos iniciaram sua fase de morte. A quantidade de CO2 acumulada devido biodegradao representada no Grfico 2, e foi obtida atravs da subtrao das quantidades de CO2 obtidas nos respirmetros com gua da quantidade obtida nos diferentes tratamentos, e posterior soma dos valores obtidos em cada medio.

Quantidade de CO2 acumulada devido biodegradao.

600 400 200 0 -200 0 -400 -600 Grfico 2: Quantidade de CO2 acumulada devido biodegradao. 10 20 30 40 50 60 2A Glicose 3A Chorume 4A Chorume 5A Benzeno 6A Tolueno

O Grfico 2 mostra que todos os respirmetros tiveram uma taxa inicial de respirao parecida, o que pode ter ocorrido devido a fase de adaptao da microbiota ao meio. Porm no decorrer do experimento, o que continha glicose apresentou uma alta taxa de crescimento na respirao, mostrando que a microbiota se adaptou melhor a esse substrato. Os respirmetros com chorume apresentaram resultados prximos de zero, mostrando que a duplicata de chorume foi txica para alguns micro-organismos fato que provavelmente selecionou os mais adaptados degradao desse composto. As taxas de CO2 acumulado para o benzeno e tolueno mostraram-se menores que os do respirmetro de controle durante toda a realizao do experimento. Esses

resduos apresentam estrutura complexa de compostos aromticos, que por sua vez no possuem boa biodisponibilidade para os micro-organismos utilizados, apresentando-se txicos a eles. Sabendo que a quantidade total efetiva de carbono biodegradado a quantidade total de gs carbnico e Biomassa produzida nos respirmetros em todo o perodo do experimento, foi realizado o clculo a partir da Equao 2, e os resultados foram representados no Grfico 3. Comprovou-se que a glicose foi o substrato mais adequado ao metabolismo da microbiota indgena do solo, e o tolueno foi o que se apresentou mais txico entre todos os compostos. Alm disso, foi confirmado que duplicatas no funcionam quando se trata de micro-organismos, pois pode ser que existam seres diferentes em amostras de solo diferentes, por isso a duplicata do chorume apresentou valores to divergentes na quantidade final de Carbono Biodegradado.

Quantidade total de Carbono Biodegradado.

1000 800 600 400 200 0 Grfico 3: Quantidade total de Carbono Biodegradado para os diferentes tratamentos. 6A Tolueno 5A Benzeno 1A gua 4A Chorume 3A Chorume 2A Glicose 1A gua 2A Glicose 3A Chorume 4A Chorume 5A Benzeno 6A Tolueno

6. Concluso Da anlise dos dados, pode-se inferir que: A glicose foi o substrato com maior biodisponibilidade para a microbiota indgena do solo, fato que j era esperado, j que um composto orgnico facilmente assimilvel pela maioria dos organismos. A eficincia da degradao do chorume no foi comprovada, pois apesar de apresentar resultados divergentes, foram muito prximos aos do respirmetro de controle.

No caso do Benzeno e Tolueno, foi verificado que por serem compostos muito complexos, ambos apresentaram-se txicos aos micro-organismos, com valores cada vez mais decrescentes nas taxas de respirao e carbono biodegradado.

Os resultados mostraram que o solo da estao de Biologia da Unb no apropriado para a aplicao de tecnologias de biorremediao para degradao dos compostos analisados.

7. Referncias Bibliogrficas MORAIS, E.B.;TAUK-TORNISIELO, S.M. Biodegradation of oil refinery residues using mixed-culture of microorganisms isolated from a landfarming. Brazilian archives of Biology and technology, v. 52, n. 6, p. 15711578, 2009. Miranda, R.C; Souza, C.S.; Gomes, E.B.; Lovaglio, R.B.; Lopes, C.E.; Souza, M.F.V.Q. (2007), Biodegradation of diesel oil by yeast from the vicinity of Suape Port in the State of Pernambuco Brazil. Braz. Arch. Biol. Tecnol., 50(1), 147-152. BERNARDES, R.S.; SOARES, S.R.A. Fundamentos da respirometria no controle da poluio da gua e do solo. Ed. Universidade de Braslia, Finatec, 2005. 164p. COSTA, M.R. (2009). Uso da respirometria para avaliao da biodegradao aerbia de lixiviado de resduos slidos urbanos em Latossolo Vermelho-Escuro. Dissertao de Mestrado em Tecnologia Ambiental e Recursos Hdricos, Publicao PTARH.DM 125/09, Departamento de Engenharia Civil e Ambiental, Universidade de Braslia, Braslia, DF, 109p. ASSOCIAO BRASILEIRA DE NORMAS TCNICAS ABNT NBR 14283 Resduos em solo Determinao da biodegradao pelo mtodo respiromtrico, 1999.