LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Presentado por: Luis Ricardo Ospina B Cdigo: 98498720

Presentado a: Mary Elena Ortega

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD MEDELLIN ABRIL 03 DE 2011

INTRODUCCIN

La biotecnologa es el uso de la microbiologa, la bioqumica y la ingeniera de una forma integrada con el objeto de utilizar los microorganismos, las clulas y los cultivos de tejidos (o sus partes) para obtener productos tiles. Esta puede ser dividida en dos categoras que son denominadas: Biotecnologa tradicional y Nueva biotecnologa. Los principales productos de la industria de biotecnologa tradicional son alimentos ingredientes saborizantes, alcohol industrial, antibiticos y cido ctrico. La nueva biotecnologa, que supone el uso de las tcnicas ms novedosas de la ingeniera gentica y la fusin celular para obtener organismos capaces de formar productos tiles. En el futuro, se predice que la nueva biotecnologa ser responsable de una fraccin mucho ms grande de la industria biotecnolgica total.Con el desarrollo de este laboratorio se pretende conocer de manera prctica los procesos utilizados en los tipos de fermentaciones, determinacin de la curva de crecimiento microbiano de los organismos unicelulares, obtencin de la amilasa y la celulosa entre otros, para su realizacin tuvimos en cuenta las normas generales de trabajo en el laboratorio, llevndose a cabo con buenas tcnicas aspticas, en un ambiente limpio y ordenado, y siempre en condiciones de esterilidad. De este modo conocemos una parte de todas las aplicaciones que brinda la biotecnologa y que son de gran utilidad en nuestro mundo actual.

OBJETIVOS

Estudiar las bateras del pan y de las cascaras de maracuy que tiene la capacidad de producir amilasa.

Estudiar las bateras del pan y de las cascaras de maracuy que tiene la capacidad para la degradacin de la celulosa.

Obtener alcohol por medio de la fermentacin y posterior destilacin del medio que contiene celulosa.

Identificar el tipo de enzimas en crecimiento de los hongos utilizados.

Definir las fases de crecimiento de una sepa bacteriana aislada, mediante la determinacin de absorbancia de la suspensin celular a diferentes tiempos de incubacin.

PRCTICAS

1. Obtencin de Amilasa 2. Obtencin de Celulosa, para la produccin de alcohol 3. Curva de Crecimiento microbiano

MARCO TEORICA

TIPOS DE ENZIMAS: Enzimas Amilasa: denominada tambin ptialina o tialina, es un enzima hidrolasa que tiene la funcin de digerir el glucgeno y el almidn para formar azcares simples, se produce principalmente en las glndulas salivares (sobre todo en las glndulas partidas) y en el pncreas. Tiene un pH de 7. Cuando una de estas glndulas se inflama aumenta la produccin de amilasa y aparece elevado su nivel en sangre. Fue la primera enzima en ser identificada y aislada por Anselme Payen en 1833, quien la bautiz en un principio con el nombre de diastasa. El almidn es el polisacrido de reserva ms abundante en los vegetales. Esta formado por -amilosa (lineal de unas 200 unidades de D-glucosa unidas por enlaces -(1,4) glucosdicos) y por amilopectina (lineal de glucosa con enlaces -(1,4) y con ramificaciones mediante enlaces -(1,6)-glucosdicos). La -amilosa en agua presenta una ordenacin espiral caracterstica, con 6 7 residuos de glucosa por vuelta. En esta hlice los grupos hidroxilos quedan hacia fuera, mientras que en el interior se disponen los grupos hidrofbicos. En este interior es donde se incluye el yodo, formando un complejo de intenso color azul que permite la identificacin positiva de trazas de almidn.

La celulasa es una enzima compleja especializada en descomponer celulosa, transformndola en glucosa. Es producida principalmente por bacterias del estmago de los herbvoros rumiantes. Ms all de los rumiantes, la mayora de los animales (incluido el hombre) no producen celulasa en sus cuerpos y por lo tanto no son capaces de usar la mayor parte de la energa contenida en las plantas. Las celulasas es un sistema complejo de enzimas que hidrolizan las uniones (1,4) de las glucanas, como la celulosa, produciendo celulodextrinas; se ha usado en forma limitada para mejorar la extraccin de aceites esenciales. Substratos Celulsicos: La hidrlisis cida de la celulosa a azcares fermentables es tcnicamente posible y fue utilizada ampliamente en economas controladas por el estado en tiempos de guerra, pero la utilizacin de la tecnologa primitiva con carcter prctico en una economa libre es dudosa. Sin embargo, se realiza mucha investigacin y parece probable el desarrollo con xito de uno o ms procesos que convienen un pre tratamiento econmico con la hidrlisis rpida y la recuperacin eficiente de los azcares

utilizables. El desarrollo con xito de formas puramente enzimticas para la hidrlisis de la celulosa parece ms problemtico, pero existe un considerable inters, unido a una posibilidad de la conversin directa de la celulosa adecuadamente pre tratada a etanol u otros compuestos voltiles de fermentacin, utilizando cultivos mixtos seleccionados de bacterias celulolticas y fermentadas, tales como especies de Clostridium algunas de las cuales para mayor utilidad son termfilas. Sin embargo, ninguno de estos progresos ha producido todava impacto en la produccin prctica de etanol.

TIPOS HONGOS: El Trichoderma es un tipo de hongo anaerobio facultativo que se encuentra de manera natural en un nmero importante de suelos agrcolas y otros tipos de medios. Pertenece a la subdivisin Deuteromycetes que se caracterizan por no poseer, o no presentar un estado sexual determinado. De este microorganismo existen mas de 30 especies, todas con efectos benficos para la agricultura y otras ramas. Este hongo se encuentra ampliamente distribuido en el mundo, y se presenta en diferentes de zonas y hbitat, especialmente en aquellos que contienen materia orgnica o desechos vegetales en descomposicin, as mismo en residuos de cultivos, especialmente en aquellos que son atacados por otros hongos. Su desarrollo se ve favorecido por la presencia de altas densidades de races, las cuales son colonizadas rpidamente por estos microorganismos. Esta capacidad de adaptacin a diversas condiciones medioambientales y sustratos confieren a Trichoderma la posibilidad de ser utilizado en diferentes suelos, cultivos, climas y procesos tecnolgicos. Trichoderma tiene diversas ventajas como agente de control biolgico, pues posee un rpido crecimiento y desarrollo, tambin produce una gran cantidad de enzimas, inducibles con la presencia de hongos fitopatgenos. Puede desarrollarse en una amplia gama de sustratos, lo cual facilita su produccin masiva para uso en la agricultura. Trichoderma, toma nutrientes de los hongos (a los cuales degrada) y de materiales orgnicos ayudando a su descomposicin, por lo cual las incorporaciones de materia orgnica y compostaje lo favorecen; tambin requiere de humedad para poder germinar, la velocidad de crecimiento de este organismo es bastante alta, por esto es capaz establecerse en el suelo y controlar enfermedades El Trichoderma probablemente sea el hongo beneficioso, mas verstil y polifactico que abunda en los suelos. No se conoce que dicho

microorganismo sea patgeno de ninguna planta; sin embargo, es capaz de parasitar, controlar y destruir muchos hongos, nemtodos y otros fitopatgenos, que atacan y destruyen muchos cultivos; debido a ello, muchos investigadores le llaman el hongo hiperparsito. Ello convierte al Trichoderma en un microorganismo de imprescindible presencia en los suelos y cultivos, y de un incalculable valor agrcola.

El Aspergillus es un gnero de alrededor de 200 hongos (mohos), y es ubicuo. Los hongos se pueden clasificar en dos formas morfolgicas bsicas: las levaduras y las hifas. El Aspergillus es un hongo filamentoso (compuesto de cadenas de clulas, llamadas hifas), el tipo de hongos opuesto a las levaduras, stas ltimas compuestas de una sola clula redondeada. El hbitat natural del Aspergillus son el heno y el compostaje. La estructura microscpica del Aspergillus es nica. Tienen hifas tabiculares y conidioforas cuya cabeza est localizada en el extremo de un hifa, compuesta por una vescula rodeada por una corona de filides en forma de botella directamente insertadas sobre la vescula.[8] De las filides se desprenden las esporas (conidios).

Aspergillus Mitospora de Aspergillus flavus.

Rhizopus es un gnero de mohos que incluyen especies cosmopolitas de hongos filamentosos hallados en el suelo, degradando frutos y vegetales, heces animales, y residuos. Las especies de Rhizopus producen esporos asexuales y sexuales. Los esporangiosporos asexuales se producen dentro de una estructura aguzada, el esporangium, y son genticamente idnticos a su padre. En Rhizopus, el esporangio es soportado por una gran columela apofisada, y el esporangiforo asoma entre rizpodes distintivos. Cigosporos negros se producen despus de dos fusiones compatibles de micelios durante la reproduccin sexual. Y hacen colonias que pueden ser genticamente diferentes de sus padres.

Diagrama equemtico de Rhizopus spp. Algunas especies de Rhizopus son agentes oportunistas de cigomicosis humana. Pueden causar serias (y con frecuencia fatales) infecciones en humanos y en animales debido a su rpido crecimiento a relativamente altas temperaturas. Algunas especies son patgenos vegetales. Dos son usados en fermentacin: Rhizopus oligosporus, en la produccin de tempeh, un alimento fermentado derivado de grano de soja; R. oryzae se usa en la produccin de bebidas alcohlicas, en partes de Asia y de frica. Las esporas de este hongo no son muy abundantes en el aire libre, pero lo son ms en lugares donde se acumula vege-tacin en descomposicin y hay un alto grado de humedad, as como en el serrn y la lea. Tambin se ha aislado de alfom-bras y del polvo domstico. FERMENTACIN Y DESTILACIN Sacararificacin y Fermentacin simultanea (SFS): La excesiva demanda energtica a nivel mundial y el impacto negativo del uso de combustibles fsiles en el ambiente, han sido los puntos cruciales para buscar alternativas energticas renovables como los bio-combustibles. Una de las tendencias actuales es la produccin de Bioetanol, el cual puede ser producido a partir de granos de maz o caa de azcar e incluso residuos agroindustriales (RA) como los generados por las empresas que trabajan con maderas.

La biomasa lignocelulosica contiene tpicamente entre 55-75%, en peso seco, carbohidratos polimricos de cinco y seis carbonos por unidad de azcar. La mayora de estos carbohidratos pueden ser convertidos a etanol va biotecnolgica, y tanto como sea posible deben ser transformados para maximizar la produccin de etanol. La biomasa utilizada fue de paja de trigo, y el aserrn desechados en aserraderos. Esta fue, primero, deslignificada por medio de un tratamiento lcali-oxidativo para posteriormente exponerla a una hidrlisis enzimtica (Sacarificacin) utilizando un extracto enzimtico proveniente del hongo Aspergillus Flavus. La biomasa Lignocelulsica como materia prima para la Produccin de etanol: Una gran parte de los materiales con alto contenido de celulosa, susceptibles de ser utilizados como materia prima para la produccin de etanol combustible se generan como residuos en los procesos productivos de los sectores agrcola, forestal e industrial. Los residuos agrcolas proceden de los cultivos leosos y herbceos y entre ellos hay que destacar los producidos en los cultivos de cereal y en algunos otros cultivos con utilidad industrial textil y olecola. La biomasa de origen forestal proviene de los tratamientos silvcolas y de mejora y mantenimiento de los montes y masas forestales. La biomasa de origen industrial son los generados en las industrias, como la papelera, y la fraccin orgnica de los residuos slidos industriales. Muchos de estos residuos no slo tienen un valor econmico en el contexto en el que se generan, sino que suelen provocar problemas ambientales durante su eliminacin. La biomasa lignocellulsica presenta una estructura compleja compuesta de tres fracciones que deben ser procesadas por separado para asegurar una conversin eficiente de este tipo de materiales a etanol. La fraccin mayoritaria de esta biomasa es la celulosa cristalina. La celulosa est compuesta de cadenas largas de molculas de D-glucosa unidas por enlaces beta (1-4) que, a su vez, se agrupan en estructuras superiores de gran cristalinidad, lo que dificulta su hidrlisis y conversin a azcares fermentables. Sin embargo, una vez se producen los azcares simples, pueden fermentarse sin dificultad. La celulosa puede ser hidrolizada a etanol mediante procesos cidos o enzimticos. La segunda fraccin es la hemicelulosa, formada por polmeros de azcares de cinco tomos de carbono (principalmente xilosa). Esta fraccin es fcilmente hidrolizable ya que no presenta estructura cristalina; sin embargo, la xilosa es un azcar difcil de fermentar a etanol. La ltima fraccin es

lignina, polmero tridimensional de unidades de fenilpropano ligadas por enlaces ster y C-C. Los procesos de obtencin de etanol a partir de biomasa lignocelulsica que utilizan catalizadores cidos permiten, en condiciones adecuadas de presin y temperatura, una solubilizacin de la hemicelulosa y la celulosa, quedando prcticamente inalterada la lignina. A temperaturas superiores a los 200C aparecen productos de descomposicin de los azcares, por lo que no pueden obtenerse rendimientos muy altos. Adems, estas sustancias son inhibidoras del proceso fermentativo por lo que deben eliminarse del hidrolizado antes de realizar la fermentacin. Los mtodos industriales de hidrlisis cida de la fraccin celulsica se agrupan en dos tipos: los que emplean cidos concentrados y bajas temperaturas y los que utilizan cidos diluidos a temperaturas ms altas. A pesar de los altos rendimientos de hidrlisis que se obtienen con los procesos que utilizan cidos concentrados, no existe ninguna planta industrial operando con este sistema, por su falta de rentabilidad. Entre los procesos de hidrlisis de celulosa utilizando cidos diluidos, el ms utilizado es el mtodo de percolacin, en el que el cido se hace pasar a travs del material. Los problemas mencionados en los procesos cidos se evitan si se utiliza en el proceso una hidrlisis enzimtica. Para ello, es necesario realizar un pretratamiento de la biomasa lignocelulsica que altere la compleja estructura de este tipo de materiales, facilitando as la accin de los enzimas celulolticos. La dificultad est en que la cristalinidad de las molculas de celulosa, y la naturaleza de su asociacin con la lignina, constituyen una verdadera barrera fsica a la penetracin de los enzimas. Proceso de Obtencin de etanol a partir de biomasa lignocelulsica utilizando levaduras termotolerantes: Por medio de investigaciones realizadas se desarroll una cepa de la especie Kluyveromyces marxianus, la cual se obtuvo mediante mutagensis qumica y posterior seleccin, y es capaz de fermentar la glucosa, procedente de la hidrlisis de la celulosa, con buenos rendimientos. El proceso permite realizar la hidrlisis y la fermentacin a 42C, temperatura cercana al ptimo del complejo celuloltico, obtenindose buenos rendimientos (cercanos al 70% del terico). El tiempo de residencia est en torno a las 72 horas, lo que supone una reduccin importante frente a otras tecnologas. Esta tecnologa consiste en un proceso discontinuo para la obtencin de etanol a partir de biomasa lignocelulsica, que comprende el pretratamiento, mediante explosin a vapor, y la sacarificacin de la celulosa y fermentacin simultnea de la glucosa generada en el proceso de hidrlisis.

Mediante este proceso pueden transformarse en etanol materias primas que contienen predominantemente celulosa tales como, residuos forestales y agrcolas, pasta de papel, biomasa de cultivos lignocelulsicos y la fraccin orgnica de los residuos domsticos. Pretratamiento de Biomasa ignocelulsica mediante explosin a vapor: El primer paso consiste en la reduccin del tamao de las partculas de biomasa antes de someterlas al pretratamiento. Durante el tratamiento trmico con vapor se produce la formacin de una masa lignocelulsica hmeda. Como la temperatura es lo suficientemente elevada para forzar termodinmicamente la disociacin del agua lquida, se crea un medio cido que supera las barreras energticas de la hidrlisis y se produce una autohidrlisis que rompe el polmero de la hicelulosa. A la vez, y debido que la difusin de la fase vapor es de mayor magnitud que la difusin de la fase lquida, el vapor de agua se introduce dentro de la estructura de la fibra de lignocelulosa. Primero, se produce penetracin del vapor y luego su condensacin. Al despresurizarse el material, se produce una evaporacin sbita del agua capilar, que tiene el efecto mecnico de desagregar y romper algunas fibras. Una vez finalizada la etapa de pretratamiento se recoge el material y se filtra separando la fraccin lquida de la slida. Proceso de sacararificacin y fermentacin simultnea (SFS): Tras el filtrado, la fraccin slida se introduce en el fermentador y se diluye hasta alcanzar una relacin slido/lquido, dependiendo del material. Luego se aade un complejo celuloltico comercial en una concentracin de 15 Unidades de Papel de Filtro (UPF) por gramo de celulosa y 12.6 Unidades Internacionales por gramo de celulosa de enzima beta-glucosidasa, ambas resuspendidas en el tampn citrato pH 4.8. Esquema de la sacararificacin y fermentacin simultanea

MEDICIN DEL CRECIMIENTO MICROBIANO El clculo del nmero de clulas que existen en una suspensin se puede llevar a cabo mediante el recuento celular (microscopa, nmero de colonias), masa celular (peso seco, medida del nitrgeno celular, turbidimetra) o actividad celular (grado de actividad bioqumica con relacin al tamao de la poblacin). Todos estos mtodos se clasifican en dos apartados: mtodos directos y mtodos indirectos. Mtodos directos:

Recuento del nmero de clulas en una cmara Thoma Peso seco celular Determinacin de nitrgeno o de protenas totales Determinacin de DNA

Mtodos indirectos: Absorbancia: Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una partcula en suspensin, parte de la luz es reflejada, parte es diseminada, parte es absorbida y parte es transmitida. La nefelometra mide la luz dispersada por una solucin de partculas. La turbidimetra mide la luz dispersada como un decrecimiento de la luz transmitida a travs de la solucin. Con relacin a la longitud de onda y al tamao de la partcula pueden existir tres tipos de dispersin. Los mtodos de dispersin de la luz son las tcnicas ms utilizadas para monitorear el crecimiento de los cultivos bacterianos. Son muy tiles y poderosos pero pueden llevar a resultados errneos. Principalmente, dan informacin sobre el peso seco (contenido macromolecular). Turbidimetra: La turbidimetra mide la reduccin de la transmisin de luz debido a partculas de una suspensin y cuantifica la luz residual transmitida. Estudios tericos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de diferentes tipos de bacterias, independientemente del tamao celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad de concentracin de peso seco. Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamao celular del microorganismo. Sin embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes por partcula o por UFC (Unidad Formadora de Colonia) cuando los tamaos de las clulas bacterianas son diferentes. Por esta razn, para estimar el nmero de microorganismos totales o el nmero de microorganismos viables de una suspensin bacteriana debe realizarse una "curva de calibracin" con cada Recuento de colonias en placa Recuento sobre filtro de membrana Consumo de oxgeno Liberacin de dixido de carbono Concentracin de un enzima constitutivo Decoloracin de un colorante Incorporacin de precursores radiactivos Medida de la turbidez

tipo de microorganismo, slo de esta forma es posible relacionar Absorbancia ( Densidad ptica) con el nmero de microorganismos totales o con UFC.

Fig. 10.2.2-1 Absorbancia en funcin del Peso Seco Absorbancia = K x Peso Seco K: constante que vara con la longitud de onda utilizada y representa la inversa del peso seco del microorganismo que produce un aumento de 10 veces en el valor de la absorbancia(1/W0). Peso seco: Concentracin celular bacteriana expresada en unidades de peso seco (g/ml-mg/ml). La relacin directa entre la absorbancia y el peso seco slo se aplica para suspensiones diluidas de bacterias. Estas suspensiones no deben tener una absorbancia mayor a 0.3, ya que valores mayores producen desviaciones de la ley de Beer. Sin embargo, el inconveniente de utilizar suspensiones diluidas puede involucrar un mayor error de pipeteo y menor sensibilidad por el bajo nivel de absorcin.

1. Practica Obtencin de Amilasa

Introduccin: Las amilasas son enzimas extracelulares que hidrolizan el almidn, y que pueden ser producida por diferentes microorganismos, entre ellos son bateras y hongos. Estas enzimas tienen diferentes aplicaciones en diferentes industrias como la alimentaria, panadera, cervecera, etc. Muchos microorganismos se examinan con el objetivo de encontrar los ms adecuados para la produccin industrial de enzimas.

1.1 Materiales: 1.2 Equipos: Cascaras de Maracuy Pan con hongos Peptona Extracto de Carne Almidn Agar Nutritivo Agua destilada Cajas de petri Beaker Erlen Meyer Pipetas Esptula Lugol (Yoduro de potasio)

Autoclave Balanza analtica

1.3 Procedimiento: 1.31. Preparacin de Medios de Cultivo: Se prepararon 30 ml Pesaje de ingredientes: Peptona 0,15 g Extracto de Carne 0,09 g Almidn 0,3 g Agar Nutritivo 0,6 g Agua destilada 30 ml

Se pesan en un beaker los anteriores ingredientes, se homogenizan y se lleva a un erlen meyer a ebullicin para que se active el agar hasta que vuelva translucido. Tambin se prepara 60 ml de un segundo agar para hongos Sabourand. 1.3.1 Esterilizacin: Los medio de cultivo se lleva a esterilizacin en una autoclave, a 15 PSI a 121 C. 1.3.4 Realizar separacin de hongos de pan y de cascara de Maracuy 1.3.5 Realizar siembra: Vaciar aproximadamente 15 ml de medio mineral esterilizado en una caja de petri y dejar solidificar. Despus de enfriar y solidificar el agar realizar el proceso de siembra de los hongos de pan y de la cascara de maracuy.

1.3.6 Realizar incubacin (de 35 a 37C por 24 horas): Se realiz incubacin por 53 horas aproximadamente de 25 a 32C (temperatura ambiente) en una zona oscura.

1.3.7 Identificacin: Para realizar el proceso de identificacin de la enzima amilasa, se prepara una solucin de Lugo, y se adiciona unas 2 gotas las la caja de petri, se espera unos segundos para obtener los resultados.

1.4 Resultados: Siembra de Hongo de Cascara de Maracuy: No se observe cambio de color con el lugol.

Siembra de Hongos del Pan: Al adicionar el lugol, se observa un cambio de color blanco alrededor de hongo, como en forma de aro.

1.5 Anlisis de Resultados: - El Hongo que se cultiva de la cascara de Maracuy no produjo la enzima amilasa. - El hongo que se cultiva del pan, si produjo la enzima amilasa, esta se identifica por medio de la tincin con lugol, la cual se observa como un aro alrededor del hongo.

2 Prctica Obtencin de Celulosa, para la produccin de alcohol Introduccin: La celulosa es una enzima compleja especializada en descomponer celulosa transformando en B-Glucosa. Es producida principalmente por bacterias del estomago de los herbvoros ruminates y la mayora de los animales incluyendo el hombre no producen celulasa en sus cuerpos y por lo tanto no son capaces de usar la mayor parte de energa contenida en las plantas. Tambin puede ser encontrada en los hongos de la madera.

2.1 Materiales: Aserrn Erlen Meyer Solucin salina Caja de petri Pipeta Filtro Esptula Medio de cultivo (Agar) Medio mineral (Nitrato de Sodio NaNO3 Fosfato diacido de Potasio K2HPO4 , Sulfato de Magnesio MgSO4 7H2O , Perxido de Magnesio MnO2, Sulfato Ferros FeSO4 7 H20, Cloruro de Calcio CaCL2 H2O.

2.2 -

Equipos: Autoclave Balanza analtica Plancha de Calor Condensador

2.3 Procedimiento: 2.3.2 Preparacin de Medios de Cultivo: Se prepararon 100 ml Pesaje de ingredientes: Nitrato de Sodio NaNO3 Fosfato diacido de Potasio K2HPO4 Sulfato de Magnesio Perxido de Magnesio MgSO4 7H2O MnO2 0,2 g 0,05 g 0,02 g 0,002 g 0,002 g 0,002 g 100 ml

Sulfato Ferros FeSO4 7 H20 Cloruro de Calcio CaCL2 H2O Agua destilada

Se pesan en un beaker en un balanza analtica los anteriores ingredientes y se homogenizan. Se pesan 15 g de aserrn y se adiciona los 100 ml de la solucin anterior. 2.3.2 Esterilizacin: El medio de cultivo se lleva a esterilizacin en una autoclave, a 15 PSI a 121 C

2.3.3 Realizar separacin de hongos de pan y de cascara de Maracuy 2.3.4 Realizar siembra: Vaciar aproximadamente 15 ml de medio mineral esterilizado en una caja de petri y dejar solidificar. Despus de enfriar y solidificar el agar realizar el proceso de siembra de los hongos de pan y de la cascara de maracuy.

2.3.5 Realizar incubacin (de 35 a 37C por 24 horas): Se realiz incubacin por 53 horas aproximadamente de 25 a 32C (temperatura ambiente) en una zona oscura.

2.3.6 Identificacin: Se obtiene crecimiento de hongo a partir de la cascara de Maraya, el cual se corta con cuidado para adicionar el segundo medio de crecimiento.

. 2.3.7 Resiembra: El hongo que se corta de caja de petri, se adiciona a las mezcla, anteriormente preparada (15 g de aserrn con 100 ml solucin de sales), por un tiempo de 5 das con el objetivo que se alimente de la celulosa y la desdoble glucosa.

2.3.7 Sacarificacin y Fermentacin simultnea: Se adiciona levadura y se deja 24 horas en fermentacin.

2.3.9 Destilacin: - Se retirara la fermentacin del lugar oscuro - Agitacin y filtracin del cultivo, por medio de un colador, con el objetivo de facilitar la destilacin - Armar el equipo de destilacin: Sellndolo bien para evitar la perdida de alcohol - Abrir la llave del condensador, para iniciar el proceso destilacin - Poner a ebullicin el matraz que contiene la solucin a destilar - Recoger el alcohol en probeta graduada y en bao de hielo.

2.4 Resultados: Por medio de proceso de destilacin se obtuvo una cantidad de alcohol de 4 ml, contando que solo 3 de estos son alcohol, el mililitro restante es agua. D= m/v La densidad del alcohol es 0,7876 g/cm 3

Calculo de alcohol recuperado

X P/S = 1,5/15 g x100 = 10% de etanol recuperado por la destilacin 2.5 Anlisis de Resultados: Con el proceso de destilacin logramos obtener 3 ml de etanol, los cuales representan el 10% del sustrato inicial, evidenciado por medio de la fermentacin de este sustrato no es una forma rpida y rentable para obtener etanol o bioetanol a gran escala.

Practica Curva de Crecimiento microbiano

Introduccin: La Fase de crecimiento de una poblacin bacteriana puede determinarse midiendo la turbidez del cultivo. Aunque dicha turbidez no es una medida del nmero clulas, su incremento es una indicacin de crecimiento bacteriano. Para esta determinacin se utiliza un espectrofotmetro, en cual luz pasa atreves del cultivo bacteriano hasta alcanzar una clula fotoelctrica conectada a un galvanmetro. A medida que la concentracin celular aumenta, el cultivo se hace mas turbio, y se reduce la cantidad de Luz transmitida que alcanza la clula fotoelctrica, como consecuencia de la difraccin de la Luz por parte de las clulas. El cambio de la Luz se registra en el espectrofotmetro como porcentaje de transmisin (Cantidad de Luz trasmitida) y absorbencia o densidad optima. Donde se inoculo. Cuando se inoculo una pequea poblacin bacteriana en un medio de cultivo lquido adecuado, generalmente el crecimiento no comienza inmediatamente, sino que hay un periodo de latencia. Una vez que empieza el crecimiento, se observa un crecimiento exponencial en la densidad, que corresponde a la fase exponencial de crecimiento. Esta fase en la ms significativa en el ciclo del crecimiento de los microorganismo y se caracteriza porque los parmetros cinticos de crecimiento (, q) se mantiene constantes. A medida que el crecimiento avanza, la concentracin de los nutrientes esenciales disminuye, y se aumentan los productos finales del metabolismo, hasta que el crecimiento llega a detenerse, de modo que el cultivo entra en fase estacionaria. Despus las clulas lentamente de mueren, lisndose en algunos casos, en una ltima fase de muerte celular.

3.1 Materiales: Azcar Levadura Agua Beaker

3.2 Equipos:

Balanza analtica Espectrofotmetro

3.3 Procedimiento:

3.3.1 Preparar la solucin: En 100 ml de H2O, adicionamos una cantidad de 0.5 gr de azcar a una temperatura de 35C y luego le adicionamos una pequea cantidad de levadura. Por medio de una celda pusimos una pequea cantidad en el espectrofotmetro, el cual se encarga de medir los niveles de absorbancia y tramitancia.

3.3.2 Medida de crecimiento en espectrofotmetro

Encender el equipo mantenindolo 10 minutos de precalentamiento antes de realizar la lectura.

Fijar la longitud de onda a 600mm, para absorbancia mxima de la cepa y mnima del medio de cultivo Primero fijar el aparato a 0% absobancia Colocar el control correspondiente al medio de cultivo sin inocular en el lugar de las muestras y fijar el 100% de tramitancia o 0 absorbancia en el equipo Para medir las muestras 3 ml de cultivo bien homogenizado en un tubo y situarlo en el lugar de las muestras y anotar el valor de obsorbancia.

3.4 Resultados:
Azcar, H2O,levadura Absorbancia 5 minutos 96.2% 10 minutos 95.9% 15 minutos 95.8% 20 minutos 96.2% 25 minutos 98.4% 30 minutos 96.3% 35 minutos 96.3%

3.5 Anlisis de Resultados:

Se llega a la fase estacionaria en un tiempo de 35 minutos. Se observa un comportamiento creciente a partir de los 15 minutos, cuando llega a las 30 comienza la fase estacionaria. En las mediciones realizas a los 10 y 15 minutos no se homogenizo bien la muestra, por esta razn se observa un comportamiento decreciente con respecto a la primera medicin.

CONCLUSIONES

De las cascaras de maracuy en descomposicin y el pan, logramos obtener diversos tipos de hongos, algunos de los cuales fueron Trichoderma, Aspergillus y Rhizopus.

El hongo que se cultiva del pan en descomposicin produce la enzima amilasa debido a la degradacin del polisacrido almidn, esta enzima se identifica por una tincin con ligol en la caja de petri.

A partir de un hongo de la cascara de un maracuy sumergido en un sustrato de celulosa y realizando una fermentacin y posterior destilacin, se obtuvo alcohol.

Se logra obtener 3 ml de alcohol (etanol) en el proceso de destilacin de la fermentacin con levadura.

Obtuvimos una curva de crecimiento de microorganismos por medios los niveles de absorbancia y tramitancia que se pueden observar en el espectrofotmetro.

La medida de absorbancia y tramitancia son mtodos indirectos utilizados como tcnicas para monitorear el crecimiento de los cultivos bacterianos.

La optimizacin de la produccin de enzimas a partir de microorganismos depende de una serie de factores interrelacionados, lo que significa que una enzima solo puede sintetizarse durante parte del ciclo de crecimiento.

A lo largo de la historia, se han venido empleando las enzimas para usos industriales, lo que ha desarrollado la biotecnologa como herramienta para que a travs de microorganismos se obtengan metabolitos de inters tanto industrial como ambiental. Una de las enzimas comnmente utilizadas es la celulasa, obtenida mediante diferentes microorganismos, los cuales han sido estudiados en diferentes tipos de sustratos.

CUESTIONARIO SOLICITADO EN LA GUIA 1. Elabore un paralelo entre los diferentes tipos de fermentaciones.

TIPO DE FERMENTACION Fermentacin actica

CARACTERISTICAS La fermentacin actica es la fermentacin bacteriana por Acetobacter, un gnero de bacterias aerbicas, que transforma el alcohol en cido actico. La fermentacin actica del vino proporciona el vinagre debido a un exceso de oxgeno y es considerado uno de los fallos del vino. La fermentacin actica es un rea de estudio dentro de la cimologa La fermentacin alcohlica es un proceso anaerbico que adems de generar etanol desprende grandes cantidades de dixido de carbono (CO2) adems de energa para el metabolismo de las bacterias anaerbicas y levaduras La fermentacin alcohlica (denominada tambin como fermentacin del etanol o incluso fermentacin etlica) es un proceso biolgico de fermentacin en plena ausencia de aire (oxgeno - O 2), originado por la actividad de algunos microorganismos que procesan los hidratos de carbono (por regla general azcares: como pueden ser por ejemplo la glucosa, la fructosa, la sacarosa, el almidn, etc.) para obtener como productos finales: un alcohol en forma de etanol (cuya frmula qumica es: CH3-CH2-OH), dixido de carbono (CO2) en forma de gas y unas molculas de ATP que consumen los propios microorganismos en su metabolismo

Fermentacin alcohlica.

Fermentacin butrica.

celular energtico anaerbico. El etanol resultante se emplea en la elaboracin de algunas bebidas alcohlicas, tales como el vino, la cerveza, la sidra, el cava, etc. Aunque en la actualidad se empieza a sintetizar tambin etanol mediante la fermentacin a nivel industrial a gran escala para ser empleado como biocombustible. La fermentacin butrica (descubierta por Louis Pasteur) es la conversin de los glcidos en cido butrico por accin de bacterias de la especie Clostridium butyricum en ausencia de oxgeno. Se produce a partir de la lactosa con formacin de cido butrico y gas. Es caracterstica de las bacterias del gnero Clostridium y se caracteriza por la aparicin de olores ptridos y desagradables. Se puede producir durante el proceso de ensilado si la cantidad de azcares en el pasto no es lo suficientemente grande como para producir una cantidad de cido lctico que garantice un pH inferior a 5.

Fermentacin lctica

La fermentacin lctica es una ruta metablica anaerbica que ocurre en el citosol de la clula, en la cual se oxida parcialmente la glucosa para obtener energa y donde el producto de desecho es el cido lctico. Este proceso lo realizan muchas bacterias (llamadas bacterias lcticas), hongos, algunos protozoos y muchos tejidos animales. La fermentacin ptrida es un tipo de fermentacin que se lleva a cabo sin gasto de sustrato oxidante. Se basa en la degradacin de sustratos de naturaleza proteica, para obtener

Fermentacin ptrida

productos malolientes como escatol, cadaverinas o indol. Algunas putrefacciones dan lugar a productos poco desagradables, que, por su fuerte aroma y sabor son utilizados en la fabricacin de vinos y quesos, como la que lleva a cabo el Penicillum rocheforti, que es la causa de las manchas verdosas del queso Roquefort. Tambin puede producir gases apestosos como los son el cido sulfhdrico que tiene olor a huevo podrido. 2. Identifique los organismos que intervienen en la fermentacin. MICROORGANISMOS Aspergillus Oryzae: Shacharomices Chevaliere-s. ellipsoideus: Sacharomices Cerivisiae: Aspergillus Niger: Sacharomices Cerivisiae: APLICACION Salsa de soya Vino rojo Cerveza cido Ctrico Pan

Lactobacillus bulgaris- steptococcus thermophillus : Yogurt Staphylococcus carnosus: Lactobacillus de /bruckii: Clostridium Butyricum: Carnes cido lctico cido actico

3. Investigar tipos de fermentacin La fermentacin es un proceso catablico de oxidacin incompleta, totalmente anaerbico, siendo el producto final un compuesto orgnico. Estos productos finales son los que caracterizan los diversos tipos de fermentaciones. La fermentacin actica es la fermentacin bacteriana por acetobacter, un gnero de bacterias aerbicas, que transforma el alcohol en cido actico. La

fermentacin actica del vino proporciona el vinagre debido a un exceso de oxgeno y es considerado uno de los fallos del vino. La formacin de cido actico (CH 3COOH) resulta de la oxidacin de un alcohol por la bacteria del vinagre en presencia del oxgeno del aire. Estas bacterias, a diferencia de las levaduras productoras de alcohol, requieren un suministro generoso de oxgeno para su crecimiento y actividad. El cambio que ocurre es descrito generalmente por la ecuacin: C2H5OH + O2 Acetiobacter aceti CH3COOH + H2O La fermentacin alcohlica (denominada tambin como fermentacin del etanol o incluso fermentacin etlica) es un proceso biolgico de fermentacin en plena ausencia de aire (oxgeno - O2), originado por la actividad de algunos microorganismos que procesan los hidratos de carbono (por regla general azcares: como pueden ser por ejemplo la glucosa, la fructosa, la sacarosa, el almidn, etc.) para obtener como productos finales: un alcohol en forma de etanol (cuya frmula qumica es: CH3-CH2-OH), dixido de carbono (CO2) en forma de gas y unas molculas de ATP que consumen los propios microorganismos en su metabolismo celular energtico anaerbico. El etanol resultante se emplea en la elaboracin de algunas bebidas alcohlicas, tales como el vino, la cerveza, la sidra, el cava, etc. Aunque en la actualidad se empieza a sintetizar tambin etanol mediante la fermentacin a nivel industrial a gran escala para ser empleado como biocombustible. La fermentacin alcohlica tiene como finalidad biolgica proporcionar energa anaerbica a los microorganismos unicelulares (levaduras) en ausencia de oxgeno para ello disocian las molculas de glucosa y obtienen la energa necesaria para sobrevivir, produciendo el alcohol y CO2 como desechos consecuencia de la fermentacin. Las levaduras y bacterias causantes de este fenmeno son microorganismos muy habituales en las frutas y cereales y contribuyen en gran medida al sabor de los productos fermentados (vase Evaluacin sensorial). Una de las principales caractersticas de estos microorganismos es que viven en ambientes completamente carentes de oxgeno (O2), mxime durante la reaccin qumica, por esta razn se dice que la fermentacin alcohlica es un proceso anaerbico. La fermentacin alcohlica (denominada tambin como fermentacin del etanol o incluso fermentacin etlica) es un proceso biolgico de fermentacin en plena ausencia de aire (oxgeno - O 2), originado por la actividad de algunos microorganismos que procesan los hidratos de carbono (por regla general azcares: como pueden ser por ejemplo la glucosa, la fructosa, la sacarosa, el almidn, etc.) para obtener como productos finales: un alcohol en forma de etanol (cuya frmula qumica es: CH 3-CH2-OH), dixido de carbono (CO2) en forma de gas y unas molculas de ATP que consumen los propios microorganismos en su metabolismo celular energtico anaerbico. El etanol resultante se emplea en la elaboracin de algunas bebidas alcohlicas, tales como el vino, la cerveza, la sidra, el cava, etc. La

fermentacin etlica ha sufrido algunas transformaciones con el objeto de aumentar la eficiencia qumica del proceso . Una de las mejoras ms estudiadas en la industria es la posibilidad de realizar la fermentacin alcohlica continua con el objeto de obtener mayores cantidades de etanol. Hoy en da el procesamiento industrial de algunas bebidas alcohlicas como puede ser el vino o la cerveza se realizan en ambientes controlados capaces de ofrecer a un ritmo apropiado de estos productos de consumo al mercado. Esta va ofrece una amplia materia de investigacin en temas de eficiencia de birreactores, empleando para ello teora de sistemas de control (el problema desde el punto de vista de ingeniera de sistemas es altamente no lineal y oscilatorio) Otra va de investigacin acerca de la mejora de los procesos industriales es la mejora de las cepas de levaduras (como puede ser la Zymomonas Mobilis que ofrece ventajas en los procesos continuos de fermentacin Hay dos clases bien definidas que son: Fermentacin microbiana Promovidas o catalizadas por microorganismos. La reproduccin de los microorganismos conlleva a que la reaccin tenga un comportamiento autocataltico siendo la concentracin de los microorganismos variable. Dentro de este tipo de reaccin hay 2 clases bien definidas:
o

Cultivos de tejidos o macroorganismos (clulas vegetales y animales). Reactores microbianos en s (cultivo de microorganismos).

Reacciones enzimtica Catalizadas por enzimas, el agente cataltico no se reproduce y cuando se opera discontinuamente este permanece constante. Clasificacin de las reacciones de fermentacin segn el consumo de oxgeno La fermentacin butrica (descubierta por Louis Pasteur) es la conversin de los glcidos en cido butrico por accin de bacterias de la especie Clostridium butyricum en ausencia de oxgeno. Se produce a partir de la lactosa con formacin de cido butrico y gas. Es caracterstica de las bacterias del gnero Clostridium y se caracteriza por la aparicin de olores ptridos y desagradables. Se puede producir durante el proceso de ensilado si la cantidad de azcares en el pasto no es lo suficientemente grande como para producir una cantidad de cido lctico que garantice un pH inferior a 5.

Obtenido de La fermentacin lctica es una ruta metablica anaerbica que ocurre en el citosol de la clula, en la cual se oxida parcialmente la glucosa para obtener energa y donde el producto de desecho es el acido lctico. Este proceso lo realizan muchas bacterias (llamadas bacterias lcticas), hongos, algunos protozoos y muchos tejidos animales; en efecto, la fermentacin lctica tambin se verifica en el tejido muscular cuando, a causa de una intensa actividad motora, no se produce una aportacin adecuada de oxgeno que permita el desarrollo de la respiracin aerbica. Cuando el cido lctico se acumula en las clulas musculares produce sntomas asociados con la fatiga muscular. Algunas clulas, como los eritrocitos, carecen de mitocondrias de manera que se ven obligadas a obtener energa por medio de la fermentacin lctica; por el contrario, el parnquima muere rpidamente ya que no fermenta, y su nica fuente de energa es la respiracin aerbica. En condiciones de ausencia de oxgeno (anaerobias), la fermentacin responde a la necesidad de la clula de generar la molcula de NAD (Nicotinamida adenina di nucletido), que ha sido consumida en el proceso energtico de la gluclisis. En la gluclisis la clula transforma y oxida la glucosa en un compuesto de tres tomos de carbono, el cido pirvico, obteniendo dos molculas de ATP (Adenosn trifosfato); sin embargo, en este proceso se emplean dos molculas de NAD + que actan como receptores de electrones y se reducen a NADH. Para que puedan tener lugar las reacciones de la gluclisis productoras de energa es necesario re oxidar el NADH; esto se consigue mediante la cesin de dos electrones del NADH al cido pirvico, que se reduce a cido lctico. Un ejemplo de este tipo de fermentacin es la acidificacin de la leche. Ciertas bacterias (Lactobacillus, Estreptococos), al desarrollarse en la leche utilizan la lactosa (azcar de leche) como fuente de energa. La lactosa, al fermentar, produce energa que es aprovechada por las bacterias y el cido lctico es eliminado. La coagulacin de la leche (cuajada) resulta de la precipitacin de las protenas de la leche, y ocurre por el descenso de pH debido a la presencia de cido lctico. Este proceso es la base para la obtencin del yogur. El cido lctico. Dado que otorga acidez al medio, tiene excelentes propiedades conservantes de los alimentos. 4. Determinar los productos y subproductos obtenidos en la fermentacin. Pueden tenerse diversos tipos de fermentacin en funcin principalmente del substrato y los microorganismos involucrados. En el caso de la Industria de Alimentos se pueden clasificar de la siguiente manera: Fermentaciones no alcohlicas Panadera (fermentacin por levaduras de panadera)

Vegetales fermentados (encurtidos en general) Ensilado (fermentacin de forraje)

Fermentaciones alcohlicas: Se Obtiene como producto final un alcohol en forma de etanol (cuya frmula qumica es: CH3-CH2-OH), dixido de carbono (CO2) en forma de gas. unas molculas de ATP que consumen los propios microorganismos en su metabolismo celular energtico anaerbico. El etanol resultante se emplea en la elaboracin de algunas bebidas alcohlicas: Vino (fermentacin alcohlica y malolctica) Cerveza Sidra

Fermentaciones lcticas: el producto de desecho es el cido lctico del cual se derivan: Yogurt (fermentacin de leche con microorganismos acidificantes, como Lactobacillus) Quesos (fermentacin con determinados cultivos bacterianos inoculados) Bebidas lcticas alcohlicas (kefir).

Fermentaciones crnicas : Embutidos crudos curados (salami, chorizo espaol y otros.) Jamn serrano (producto curado) Productos de pescado fermentado (fermentacin de filetes de pescado ahumado)

Fermentacin actica: Como producto se obtiene Acetaldehdo = Acido Actico + Acetato de etilo. Durante el proceso, el alcohol etlico es transformado totalmente en cido actico y agua por accin de bacterias del grupo acetobacter en presencia de oxigeno (bacterias aerbicas) Otras transformaciones paralelas tienen lugar, como son la transformacin del cido mlico cido lctico y glicerina y la aparicin de otros subproductos qumicos que pueden alterar el producto final. La fermentacin actica del vino produce el vinagre

Fermentacin butrica: Se produce a partir de la lactosa con formacin de cido butrico y gas. Se caracteriza por la aparicin de olores ptridos y desagradables. 6. Investigue los beneficios producidos por alimentos fermentados a nivel nutricional y econmico. Tradicionalmente, el hombre ha empleado de forma emprica microorganismos (fundamentalmente, bacterias lcticas, levaduras y mohos) para la elaboracin de una gran variedad de alimentos fermentados, entre los que se incluyen: (i) (ii) (iii) (iv) (v) derivados de la leche; pan y derivados de cereales; bebidas; derivados de vegetales; derivados del pescado.

Desde la demostracin a mediados del siglo XIX por Louis Pasteur de que los microorganismos son los responsables de la fermentacin de los alimentos, las fermentaciones industriales se han convertido en procesos estrictamente controlados en los que se emplean cultivos iniciadores muy especializados que permiten garantizar y estandarizar las caractersticas organolpticas del producto final. Pero el papel de los microorganismos (principalmente bacterias lcticas), y/o de sus metabolitos, en la industria alimentaria no se limita a la produccin de alimentos fermentados, sino que tambin pueden emplearse con los siguientes fines: Como cultivos probiticos, Como factoras celulares para la produccin de enzimas y otros compuestos, Como bioconservantes. Aunque tanto su definicin como el marco normativo vigente para los alimentos funcionales (entre ellos fermentados) admite variantes segn los criterios y los pases, estos productos son una realidad comercial creciente. Se estima que su mercado representa hoy US$ 20.000 millones, pero algunos prevn que en una dcada se comercializarn por valores cercanos a los US$ 100.000 millones. Caractersticas de una tendencia que se va consolidando. (Fuente The times, economyc section). Algunas ventajas importantes de los alimentos fermentados: Se eliminan sabores y texturas desagradables.

Hay una reduccin considerable en el tiempo de coccin y por lo tanto ahorro de energa. Los productos son ms digeribles. Hay un incremento en el contenido de vitaminas del complejo B. Inhibicin del desarrollo de microorganismos patgenos y de la produccin de toxinas. Aumenta considerablemente el tiempo de conservacin del alimento Modificacin de caractersticas organolpticas del alimento.

BIBLIOGRAFIA Practicas de Laboratorio, Asignatura Bioqumica y Biotecnologa de Alimentos 3 Licenciado en Qumica 08/09,Universidad de Huelva http://www.uhu.es/480004034/documentos%20de %20texto/practicas/protocolo_practicas_alimentos_08_09.pdf Articulo: Todo sobre Trichoderma. http://foroarchive.infojardin.com/orquidea/t-39804.html

wikipedia.org/wiki/Aspergillus

wikipedia.org/wiki/celulasa

wikipedia.org/wiki/Rhizopus

Manual de Laboratorio introduccin a la biotecnologa, Dr magamani Balagurosamy, Escuela de ciencias biotecnolgicas. Y Manual de laboratorio FRADA LORENA ORTIZ BENAVIDS