Facultad de Ingeniera Qumica UADY

Microbiologa Industrial

27, 29 de Sepetiembre y 3, 5 de Octubre

CINETICA MICROBIANA

Introduccin El cultivo por lotes o intermitentes representa el crecimiento en un sistema cerrado, puesto que no se aade medio nuevo al cultivo. El crecimiento microbiano unicelular es autocataltico, de modo que la velocidad de crecimiento es proporcional a la concentracin de clulas ya presente. Cuando un medio de crecimiento es adecuado y se inocula con clulas, tiene lugar una secuencia de eventos caracterstica llamada ciclo de crecimiento, el cual se puede describir por medio de una grfica del peso seco celular contra el periodo de incubacin en horas. Objetivos Evaluar el crecimiento microbiano y el consumo del sustrato de un cultivo tipo lote. Objetivos especficos Determinar el crecimiento microbiano por medio de la cuantificacin de la cantidad de protena celular. Evaluar la degradacin del sustrato (melaza) por medio de la cuantificacin de los azcares reductores residuales. Evaluar modelos de crecimiento microbiano ajustando los datos experimentales. Material y equipo Tubos eppendorf (40) Centrifuga para tubos eppendorf. Micropipetas de 20-200 L, 100- 1000L Puntas para micropipeta de 1000 L (30) Puntas para micropipeta de 200 L (30) 1 mechero fisher Bao trmico a 94C y a 80C Vrtex Pizeta Espectrofotmetro UV Gradilla para tubos eppendorf Soluciones y reactivos Agua destilada 1.5 mL de estndar de glucosa 1.5 g/L 3 mL de reactivo DNS 1 matraz con 100 mL de inoculo 20 mL de reactivo de Bradford 1 matraz con 470 mL de medio BH 1.5 mL de estndar de albumina srica bovina 10 g/mL 30 mL de NaOH 0.5M

Reactivo de DNS. Disolver 1.6 g de NaOH en agua destilada. Adicionar 30g de tartrato de sodio y potasio. Adicionar 1 g del reactivo DNS. Aforar a 100 mL con agua destilada. Guardar en frasco mbar para evitar la exposicin a la luz. Medio BH. Disolver 0.20 g/L de sulfato de magnesio, 0.02 g/L de cloruro de calcio, 1.0 g/L de fosfato monobsico, 1.0 g/L de fosfato dipotsico, 1.0 g/L de nitrato de potasio y 0.05 g/L de cloruro frrico en 1 litro de agua destilada. Reactivo de Bradford Reactivo de Bradford Sigma-Alrich Desarrollo Inoculacin. 1. Colocar el mechero en las tomas de gas y encenderlo cuidadosamente. 2. Colocar cerca del mechero el matraz con medio BH, la melaza y el matraz con el cultivo bacteriano. 3. Con la ayuda de la pipeta de 10 mL tomar 30 mL de medio con el cultivo microbiano y adicionrselos al matraz con el medio BH. 4. A continuacin tomar 5 mL de la melaza estril y adicionrsela al medio previamente inoculado. 5. Agitar manualmente y posteriormente ponerlo en un agitador orbital con control de temperatura. Verifica las condiciones de incubacin 37C y 150 rpm. Elaboracin y preparacin de la curva patrn de DNS 1. Realizar las diluciones por duplicado para cada estndar como se muestra en la tabla 1. Agitar con el vortex para homogenizar. 2. El volumen final de cada dilucin es de 100 L. 3. Adicionar 100 L del reactivo de DNS. 4. Llevar las muestras al bao trmico a 94 C por 5 min. 5. Enfriar las muestra en un bao de hielo por 10 min. 6. Adicionar 1 mL de agua destilada a cada muestra y agitar en el vortex. 7. Encender y ajustar el espectrofotmetro UV a 540 nm. 8. Leer las absorbancias para cada dilucin y anotar los resultados en la Tabla 2. Curva patrn de albumina srica bovina 1. En los tubos eppendorf realizar las diluciones del estndar de la albumina srica bovina (por duplicado) de acuerdo a la Tabla 2. 2. En los tubos con las diluciones adicionar 1mL del reactivo de Bradford y agitar vigorosamente con la ayuda de un vortex.

3. Una vez agitados los tubos dejar reposar por 10 min evitando la exposicin de los tubos a la luz. 4. Transcurrido el tiempo encender el espectrofotmetro y ajustar la longitud de onda a 595 nm. Leer las absorbancias y anotar los resultados en la Tabla 2. Separacin de la pastilla celular y el sobrenadante 1. Posteriormente con la ayuda de una micropipeta tomar 1.5 mL (por duplicado) del cultivo previamente incubado despus de 5 min de agitacin, para colocarlo en un tubo eppendorf. 2. Centrifugar el tubo eppendorf a 13000 rpm por 15 min a temperatura ambiente. 3. Identificar la pastilla celular, la cual puede ser observada en el fondo del tubo. Cuantificacin de la degradacin de la melaza. 1. Tomar 100 L del sobrenadante de los tubos y colocarlo en un tubo eppendorf. 2. Adicionar 900 L de agua destilada y agitar con la ayuda del vortex. Para realizar una dilucin 1:10 o la que sea necesaria para que el resultado se encuentre dentro de la curva de calibracin. 3. Tomar 100 L de los tubos que contienen la dilucin de las muestras problemas y colocarlos en un tubo eppendorf de 1.5 mL. 4. Adicionar 100 L del reactivo de DNS 5. Llevar las muestras al bao trmico a 94 C por 5 min. 6. Enfriar las muestra en un bao de hielo por al menos 10 min. 7. Adicionar 1 mL de agua destilada a cada muestra y agitar en el vortex. 8. Encender y ajustar el espectrofotmetro UV a 540 nm. 9. Leer las absorbancias para cada muestra y anotar los resultados en la tabla 5. Cuantificacin de la protena celular 1. Tomar 1 mL de NaOH 0.5M y adicionrselos a las pastillas celulares, agitar con la ayuda del vortex. 2. Llevar a calentamiento los tubos en el bao trmico a 80C por 5 min. 3. Con la ayuda del vortex diluir la pastilla celular. 4. Una vez disuelta se realiza la dilucin pertinente (1:10) o que sea necesaria. 5. Tomar 100 L de la dilucin celular y colocarla en un tubo limpio. 6. Adicionar 1mL del reactivo de Bradford y dejar reaccionar por 10 min evitando la exposicin de la luz. 7. Transcurrido el tiempo leer las muestras a una longitud de 595 nm y anotar los resultados en la Tabla 5.

Tabla 1. Curva de calibracin de glucosa

Concentracin de glucosa [g/L] 1.5 1.2 0.9 0.6 0.3 0.0

L de solucin patrn de glucosa 100 80 60 40 20 0

L agua destilada 0 20 40 60 80 100

Tabla 2. Curva de calibracin de albumina srica bovina

Concentracin de protena [g/mL] 10 7.5 5.0 2.5 0.0 Clculos

L de solucin patrn de albumina srica bovina 100 75 50 25 0

L agua destilada 0 25 50 75 100

1. Realizar la curva de calibracin para la glucosa y albumina srica bovina. Graficar los promedios de las absorbancias y las barras de error de la desviacin estndar de los datos obtenidos. 2. Presentar los datos de R2 la ecuacin de la recta y la desviacin estndar de los duplicados de la curva patrn. 3. Obtener la Absorbancia para cada muestra problema e interpolar en la curva para obtener la cantidad de glucosa en cada una de las muestra problemas. Resultados
Tabla 3. Medicin de la curva de calibracin de glucosa.

Concentracin de glucosa [g/L] 1.5 1.2 0.9 0.6 0.3 0.0

Absorbancia

Tabla 4. Medicin de la curva de calibracin de albumina srica bovina.

Concentracin de albumina srica bovina [g/mL] 10 7.5 5.0 2.5 0

Absorbancia

Tabla 5. Datos de la cintica microbiana.

T0 Tiempo transcurrido(h) Absorbancia a 540 nm [Glucosa] g/L Absorbancia a 595 nm Protena celular g/mL % remocin de melaza

T1

T2

T3

T4

Investigar a cerca de la melaza y la forma de expresar su degradacin como glucosa. Presentar el grfico de la curva de calibracin para el DNS. Presentar el grfico de biomasa y consumo de glucosa vs tiempo. Calcular la velocidad especifica de crecimiento () empleando una linearizacin de la ecuacin de Monod. Presentar ecuacin de este procedimiento. Calcular el tiempo de duplicacin (td). Calcular el rendimiento biomasa sustrato (Yx/s). Ajustar el comportamiento de crecimiento a un modelo de crecimiento no estructurado. Explicar la razn de la seleccin. Cuestionario 1. Mencione y describa las diferentes etapas del crecimiento microbiano. 2. De qu otra manera se pudo haber determinado el crecimiento microbiano y la degradacin de residuos? 3. Cul es la ventaja de emplear consorcios microbianos en la degradacin de residuos orgnicos?

Observaciones

Discusin

Conclusin

Referencias
Crueger W. Crueger A. Biotecnologa. Manual de microbiologa industrial. Editorial Acrina. Espaa. 1989. Scragg A. Biotecnologa para ingenieros. Sistemas biolgicos en procesos tecnolgicos. Ed. Limusa. 2007.