32

4. MATERIALES Y METODOS

4. 1. Mat eria Prima

Los ci nco cultivares de chil e sel eccionados por su i mportanci a
comerci al segn el Centro de Agronegocios del Noroest e (2003) fueron:
Anaheim, Bel l, Caribe, Jalapeo y Serrano; cosechados en el mes de
Novi embre del 2008. Di chos cultivares fueron cosechados en la regin de
Zamora, en el municipi o de Hermosill o, Sonora (29 05 lat itud, 110
57l ongitud y a una altura de 282 metros sobre el ni vel mar); y fueron
proporci onados por comercializadora Dist frut S. A. de C. V.

4. 2. Preparacin de l a Muest ra

Las muest ras de chi les fueron lavadas con agua desti lada, se cort aron
por l a mit ad para retirar l as semill as y se realizaron cort es del peri carpio en
raj as de 5 cm de l argo y 0. 5 cm de ancho. Part e de l as muestras fueron
liofil izadas (Modelo 5, Labconco Corporation, Kansas Cit y, MO) a una
temperatura de 50 C (Vinson et al . , 1998). Las muestras frescas y
liofizadas se almacenaron a 20 C.

4. 3. Extraccin de l os Compuestos Fenli cos

Los compuestos fenlicos fueron extrados del peri carpio fresco de cada
uno de l os cul tivares de l os chil es en est udio (Fi gura 5). Di ez gramos de
muestra fresca fueron homogenizados con 20 mL de metanol -agua (70:30 v/ v)
utilizando un Ultra-Turrax T 25 basi c S1 (IKA Works Inc, Wilmington,
NC, USA).
33







Fi gura 5. Di agrama de extraccin de los compuest os fenli cos
del peri carpio de chile ( C. annuum L. ).


10 g muest ra +
20 mL MeOHH
2
O
(70: 30 v/ v)
Cent ri fugar 17900 g
a 4 C por 15 mi n
Ext ract os a
20 C
Preci pi t ado +
20 mL MeOHH
2
O
(70: 30 v/ v)
Junt ar
Sobrenadant es
Fi l t rar sobrenadant e
(Fi l t ro # 2)
Lavado y Cort ado
Soni car 30 mi n
34

Posteriorment e, el homogenizado fue sometido a movimi ent os
ultrasni cos (Sonicador marca Branson 1510) por 30 mi n y cent rifugado a
17, 900 g (IEC L31 Thermo el ectrn) a 4 C por 15 min. La extraccin
met anl ica se repiti dos veces para asegurar la mxima extracci n de los
compuestos. Los sobrenadantes fueron mezcl ados y fil trados en papel
Whatman No. 2. Los extractos met anli cos fueron congel ados a 20 C hast a
su anlisi s (Chiti ndi ngu et al . , 2006; Abushit a et al . , 2000).

4. 4. Cuantifi cacin de Fenol es Tot al es

Las det ermi naci ones se realizaron espectrofot omt ri cament e utilizando
el mtodo de Folin-Ciocalt eau (Sun et al . , 2007). Est e mtodo est basado en
la oxidacin de los grupos fenlicos por l os cidos fosfomol bdi co y
fosfot ngsti co, formndose un complejo verde azul ado que se mide a 330 nm.

Para l a det erminacin del cont eni do de fenoles tot al es, se mezclaron 50
L de cada extract o met anlico con 3 mL de agua desioni zada y 250 L el
reactivo de Foli nCiocalt eu 1 N (Merck). El extract o se oxida por 5 min,
despus l a reaccin se neutraliza con 750 L de Na
2
CO
3
al 20% y 950 L de
agua desionizada. Despus de 30 minutos, se l ey l a abs orbanci a a 330 nm, en
un espect rofot metro UV-VIS (Vari an, model o Cary 100). Se us ci do
clorognico como estndar (Si gmaAldrich Co. , St Loui s, MO, USA). El
contenido de fenol es tot ales fue expresado en mg de cido clorognico/100g
de peso freso de l a muestra y fue el resultado de tres repeti ciones y con un
intervalo de concent racin de 0 a 1 mg/mL (Fi gura 6).

4. 5. Cuantifi cacin de Fl avonoi des Totales

Para la det erminaci n de fl avonoi des totales se si gui l a t cni ca descrit a
por Hel mja et al . (2007) a un mil ilit ro de ext ract o met anlico con 4 mL agua
35









Fi gura 6. Di agrama de cuanti fi caci n de fenoles tot al es
del peri carpio de chile ( C. annuum L. ).




50 L de extracto +
3 mL de agua desionizada +
250 L del reactivo de Folin
Ciocalt eu 1 N
Reposar 5 mi n
750 L de Na
2
CO
3
al 20% +
950 L de agua desi onizada
Vortex
Reposar (30 40 mi n)
Leer a 330 nm
36

dest ilada se l e aadieron 0. 3 mL de NaNO
2
(5 g/100 mL) y 0. 3 mL de una
solucin de AlCl
3
(10 g/100 mL). Despus de agit ar vi gorosament e (Fi gura 7),
se dej reposar por 1 min, se aadieron 2 mL de NaOH 1 M y se afor a 10
mL con agua destil ada. La mezcl a se l ey a 415 nm en un espect rofotmet ro
UV-VIS (Vari an, modelo Cary 100). Los result ados fueron expresados como
mili gramos equival entes de querceti na (Si gmaAldri ch Co. , St Loui s, MO,
USA) por cada 100 gramos peso fresco (mg EQ/ 100 g pf). Todos los anli sis
se realizaron por tri plicado. El cont eni do de fl avonoides se calcul en base a
la si gui ente ecuacin lineal :

Y = 1. 442X 0. 024 r = 0. 995

Donde: Y es l a absorbanci a medida y X es el cont enido de fl avonoi des
en mg quercetina/ g, con una concentracin de est ndar de 0 a 0. 6 mg/mL.

4. 6. Identi fi caci n de los Compuestos Fenli cos por HPLC

El procedimi ento para l a identifi cacin de los compuest os fenlicos se
realiz de acuerdo al mtodo descrito por Ramamurt hy et al . (1992). Se
introduj eron 20 L de extracto met anli co (0, 05 g de muest ra fresca/mL de
met anol al 70%) a una col umna Supel cosilTM LC18 ( 30 x 0. 4 cm x 5 m
tamao de part cul a, Supelco, Bell efonte, PA, USA), en un equi po de
cromatograf a HPLC (Vari an, modelo ProStar 230), equipado con un detect or
de luz ultraviol et a (Vari an, modelo 9050). Los solvent es ut ilizados fueron:
agua mas 2% de aci do actico (solvent e A) y, ci do acti co: acet onit rilo:agua
(2:30:68, v/v) como solvent e B. La elusi n del anlisis se program si gui endo
el gradient e del solvent e de 10 a 100% de B en A a un fluj o de 1. 5 mL/mi n
durant e 30 minutos. La i denti ficacin de los di ferent es compuest os fenli cos
se ll ev a cabo comparndolos con los t i empos de ret enci n de l os est ndares
correspondi ent es.
37










Fi gura 7. Di agrama de l a cuant ifi cacin de fl avonoides
total es del peri carpio de chil e ( C. annuum L. ).








1 mL de extracto +
4 mL de agua desi onizada +
300 L de NaNO
2
al 5% +
300 L de Al Cl
3
al 10%
Reposar 1 mi n
2. 0 mL de NaOH 1M +
2. 4 mL de agua desi onizada
Vortex
Leer a 415 nm
38

Para l a cuantificacin se elaboraron curvas de calibraci n
(concent racin de 0-0. 2 mg/mL) para cada uno de los compuest os fenlicos
identificados. El ci do gli co, aci do cafei co, cat equina y epi catequi na fueron
cuanti fi cados a 280 nm (longitud de onda a l a cual presentan su absorbanci a
mxima), el resveratrol y el cido cl orogni co a 320 nm y el querceti n -3-
ruti nosi do conoci do como rutina (fl avonol) , lut eol ina (fl avona) a 360 nm
(Garc a-Al onso et al . , 2003). Los compuestos fenli cos de los extract os
met anl icos fueron analizados por tripli cado.

4. 7. Evaluacin de l a Capacidad Anti oxidante

Los mtodos ms ut ilizados son los que utilizan al cati n radi cal 2, 2 -
azino-bi s (3-etilbenzotiazol ina-6-sul fni co) (ABTS
-+
) y al radical 2, 2-difenil -
1-pi crilhi dracilo (DPPH
-
), segn lo descrito por Kuskosi et al . (2005). Ambos
present an una excelente est abili dad en ci ert as condiciones (escasa
luminosidad y t emperat ura ambiente) aunque tambi n muestran diferencias
(precisin y est abilidad ante las especi es reacti vas de oxi geno).

El DPPH
-
es un radi cal libre que puede obt enerse di rect amente sin una
preparacin previ a, mient ras que el ABTS
-+
tiene que ser generado t ras una
reaccin que puede ser qumi ca (dixido de manganeso, persul fato pot asi o).
Con el ABTS
-+
se puede medi r la acti vidad de compuestos de natural eza
hidroflica y li pofli ca, mi ent ras que el DPPH
-
solo puede di solverse en medio
orgni co (Kuskosi et al . , 2005; Gori nst ei n et al . , 2009).

4. 7. 1. Capacidad antioxidante equi val ent e a trolox (TEAC)

Est e mtodo evala la capaci dad anti oxidant e equi val ente de t rol ox
(TEAC, trolox equi val ent ant ioxidant capacit y) ; se basa en l a reduccin de l a
col oracin verde/ azul producida por l a reaccin del radi cal 2, 2-azi no-bis (3-
39

etilbenzotiazolina-6-sulfni co) (ABTS
-+
) con el antioxidant e present e en l a
muestra. Para generar el radical cat in ABTS
-+
se pesaron 19. 2 mg de ABTS
- +

y se disolvi eron en 5 mL de agua destil ada. Post eri ormente se agregaron 88
mL de una soluci n de persul fato de pot asio (0. 0378 mg/mL). La solucin se
homogeniz y se incub en oscuridad a t emperat ura ambiente (25 + 1 C)
durant e 16 h. Una vez formado el radi cal ABTS
-+
, ste se di luy con et anol
hast a obt ener un valor de absorbancia alrededor de 0, 70 + 0, 1 a 754 nm
(espectrofotmet ro UV-VIS Vari an, modelo Cary 100). Los extractos
met anl icos filt rados (0. 1 mL de extracto) se col ocaron cada uno en una celda
y se mezcl aron con 3. 9 mL del radical recin generado. Se l ey la absorbanci a
al i nicio (Abs
i
) y a cada mi nuto hast a l os 7 minutos de reaccin (Abs
f
) (Fi gura
8). El di ferenci al de absorbancia (abs
i
abs
f
) se transform a porcent aj e de
inhibi ci n y se cal cul l a acti vidad ant ioxidant e en milimoles equival ent es
Trolox (mmol es ET)/ gramo peso fresco ( g pf), medi ant e una curva de
calibraci n (concent raci n de 0-0. 25 mg/ mL) de Trolox (anl ogo soluble de l a
vitamina E) (Kuskoski et al . , 2005).

4. 7. 2. Capacidad antioxidante por mtodo DPPH
-


El radi cal 2, 2-difeni l -1-pi crilhi dracilo (DPPH
-
) se reduce en presenci a
de ant ioxidant es manifest ndose un cambi o de color (de morado a amarillo) en
la solucin. Para el ensayo fot omt ri co (Fi gura 9) se mezclaron 3. 9 mL del
radi cal DPPH
-
(0. 025 mg/mL metanol ) con 0. 1 mL de cada uno de las
diluciones de los extract os met anli cos (concent raci n 0. 25 g/mL). La
reaccin se ll ev a cabo por 30 mi n y posteriorment e se l ey a 515 nm en un
espect rofotmet ro UV-VIS (Vari an, modelo Cary 100). La absorbanci a de l as
muestras se mi di en funci n del ti empo hast a que l as di ferenci as fueron
menores a 0. 003. Los cambi os en l a absorbanci a al ini cio y fi nal de la
reaccin fueron transformados a porcent aje de inhibi ci n (Materska y
Perucka, 2005).
40










Fi gura 8. Di agrama del mt odo de cuanti ficaci n de la capacidad antioxidant e
del peri carpio de chile (C. annuum L. ) por medio de l a i nhibici n
del cati n radi cal ABTS
-+
.




19. 5 mg del radi cal ABTS +
5 mL de agua bidestil ada Soln.

37. 8 mg de persul fat o de pot asio +
1 mL de agua bidestil ada Soln.
Soln. + 88 L de Soln.
dej ar reposar en oscuridad Sol n.
(12 16 h) a T
amb
.
1 mL Soln. +
88 mL de et anol Soln.
Leer inmediat ament e a
754
nm

3. 9 mL Soln. +
0. 1 mL extracto (cel da)
41










Fi gura 9. Di agrama del mtodo de cuant i ficacin de l a capaci dad anti oxidante
del peri carpi o de chil e ( C. annuum L. ) por medi o de l a
est abil izacin del radical l ibre DPPH
-
.








2. 5 mg del radi cal DPPH
y aforar 100 mL MeOH
Homogenizar
3. 9 mL Soln. radi cal +
0. 1 mL extracto (tubo)
Reposar 30 min
Leer a 515 nm
42

4. 8. Det erminacin de l a Inhi bi cin de l a Oxidacin de Col est erol

Para la det erminaci n de la inhibi cin de l a oxidacin de colesterol
fueron col ocados 50 L de extract o met anlico de cada cult ivar de chi le ( C.
annuum L. ) y 1 mL de una solucin de colesterol (0. 1 mg/mL hexano) en un
tubo de prueba de 13 100 mm para homogenizarse por 30 s. La mezcla fue
calentada en un bao de arena a 175C por 20 min. Posteriorment e, el
col est erol fue resuspendido en 1 mL de acetona y homogenizado por 30 s. La
solucin fue t ransferida a un vi al de 2 mL para det erminar l a concent racin de
col est erol remanent e (Sun et al . , 2007). Se utiliz un equipo cromatogrfi co
(HPLC) Vari an ProStar 230 con un det ector UV-VIS 9050 y una col umna C18
(30cm4. 6mm 5-m tamao de part cul a, Supel co, Bell efonte, PA, USA). La
fase mvi l fue acet ona-met anol (10: 90 v/v) a un fl ujo de 0. 8 mL/min. La
longit ud de de onda para l a cuanti fi cacin de colesterol fue 205 nm. El
porcent aj e remanente de col est erol en cada t ubo fue obt enido por l a
comparaci n de l a concent racin remanent e y l a concent racin ori gi nal . El
control fue considerado al tubo de prueba con l a sol ucin de col est erol sin
extract o (Sun et al . , 2007).

4. 9. Extraccin de l os Capsai ci noides

Para l a extraccin de l os capsai cinoides se mezcl 1 g de muest ra
liofil izada y pul veri zada (li cuadora Ost er Pro) de cada uno de l os culti vares
de chil e con 10 mL de acetonit rilo al 100%. La mezcl a se cal ent a 80C por
4 h. Post eriorment e, la mezcl a fue cent ri fugada (17, 900 g) a 4C por 15 mi n.
El sobrenadante fue filt rado utilizando membranas para j eringas de 17 mm y
tamao de partcul a de 0. 2 m (Est rada et al . , 2000). Los extract os fueron
almacenados a -20C hasta su anlisis por HPLC (Fi gura 10).



43









Fi gura 10. Di agrama de ext raccin de capsai cinoides del pericarpio
liofilizado de chile (C. annuum L. ).











1 g muest ra l i ofi l i zada +
10 mL acet oni t ri l o 100%
Cal ent ar a 80C (4 h )
Cent ri fugar 17900 g
a 1 C por 15 mi n
Ext ract os a
20 C
Fi l t rar Sobrenadant e
(Papel Fi l t ro # 2)
44

4. 10. Cuantifi cacin de Capsai ci noides por HPLC

Para l a cuanti ficaci n de capsai cinoides se uti liz un cromatgrafo
HPLC equipado con una bomba isocr ti ca (Varian, ProStar 210), un det ector
UV-VIS (Vari an, model o 9050) y una col umna Supel cosil C18 (30cm 4. 6mm
5-m t amao de part cul a, Supelco, Bellefont e, PA, USA). La fase mvil fue
met anol agua (70:30 v/v) a un fluj o de 1. 0 mL/min, inyectando de 20 L. La
longit ud de onda para l a identi fi caci n y cuanti fi caci n de capsai ci noides fue
de 280 nm (Tanaka et al . , 2009). El conteni do de capsai cinoides (Fi gura 11)
en l as muest ras fueron identifi cados y cuanti fi cados por l a co mparaci n de los
tiempos de retencin y l as reas de l os est ndares de capsai cina (0 -0. 2
mg/mL) y di hidrocapsai ci na (0-0. 196 mg/ mL) (Si gmaAl dri ch Co. , St Louis,
MO, USA).

4. 11. Extraccin de Carot enoides

Para l a extracci n (fraccin ol eosa) de carotenoi des se tom 1 g de
muestra liofilizada de cada morfoti po de chil e en estudio, se l e adicionarn 10
mL de t etracloruro de carbono-metanol (80: 20 v/v) y se mezcl en un Ult ra-
Turrax T 25 basic S1 (IKA Works Inc, Wilmington, NC, USA).
Posteriorment e, el homogenizado fue sometido a movimi entos ult rasni cos por
30 min y cent ri fugado (17, 900 g) a 1 C por 15 min. La extracci n se repiti
dos veces para asegurar l a mxima extraccin de l os compuest os.

La fase ol eosa fue separada en un embudo de separacin y reflujada con
N
2
hast a sequedad. Los extractos sli dos fueron congel ados a 20 C (Fi gura
11). En el moment o del anlisi s cromatogrfi co fueron resuspendidos en 1 mL
de acetona (Chitindi ngu et al . , 2006; Abushit a et al . , 2000).


45








Fi gura 11. Di agrama de extracci n de carotenoides del
peri carpio liofil izado de chil e ( C. annuum L. ).





1g muest ra l i ofi l i zada+
10mL CCl
4
: MeOH (80: 20 v/ v)
Soni car 30 mi n
Cent ri fugar 17900 g
a 1 C por 15 mi n
Junt ar sobrenadant e
Preci pi t ado + 10mL
CCl
4
: MeOH (80: 20 v/ v)
Ext raer fase ol eosa
y refl uj ar con N
2

Ext ract os a
20 C
46

4. 12. Cuantifi cacin de l os Carot enoides por HPLC

La i dentificacin y cuanti fi caci n de los carotenoi des se realiz a 450
nm, utilizando un cromatgrafo HPLC equi pado con una bomba ternari a
(Varian, modelo ProStar 230), un det ect or UV-VIS (Varian, modelo 9050) y
una columna Supel cosi l C18 (30 cm4. 6 mm 5-m tamao de part cul a,
Supel co, Bell efont e, PA, USA). La fase mvil (Tabl a 6) ut ili zada fue acet ona-
agua con una rampa de elucin a un fl uj o de 1. 5 mL/mi n (Minguez-Mosquera
y Hornero-Mndez, 1993).

Tabla 6. Rampa de el usin para la identi fi caci n de carot enoides.
Tiempo(min) % Acetona % Agua
5 75 25
5 95 5
7 95 5
5 100 0
5 75 25
M nguez- Mosquer a y Hor ner o- Mndez, 1993

El cont enido de carot enoides fue identifi cado y cuantifi cado en l as
muestras por la comparaci n de los ti empos de ret enci n y l as reas de los
est ndares de |-caroteno, lut ena, cl orofil a-a y clorofil a-b (Si gmaAldri ch
Co. , St Louis, MO, USA) .

4. 13. Extraccin de Tocoferol es

Los tocoferol es se extraj eron a parti r de 10 g de muest ra fresca de chil e
con 20 mL t etracloruro de carbono-met anol (60: 40, v/ v), l os cual es fueron
homogenizados en un Ultra-Turrax T 25 basi c S1 (IKA Works Inc,
Wilmington, NC, USA). Posteriorment e, el homogenizado fue sometido a
movimi ent os ultrasnicos por 30 min y cent ri fugado (17, 900 g) a 1 C por 15
47

min. Los sobrenadantes fueron col ocados en un embudo de separaci n para
obt ener l a fase ol eosa con los t ocoferol es. La fracci n ol eosa fue reflujada
con N
2
hast a sequedad. Los ext ractos slidos fueron congelados a 20 C
(Fi gura 12). En el moment o del anl isis por HPLC los extractos fueron
resuspendidos en 1 mL de hexano (Chiti ndingu y col. , 2006; Abushit a et al . ,
2005).

4. 14. Cuantifi cacin de l os Tocoferol es por HPLC

Para l a determinacin de los tocoferoles se utiliz el mt odo ofi ci al Ce
8-89 (AOCS, 2009). Se us un equipo de cromatograf a HPLC equi pado con
una bomba isocrati ca (Vari an, modelo ProSt ar 210), un det ector UV-Vi s
(Varian, modelo 9050), una precolumna Si -60 conect ada en seri e a una
col umna Supel cosil Si -60 (25 cm 4. 6 mm 5-m t amao de part cul a,
Supel co, Bell efont e, PA, USA). La fase mvil utilizada fue hexano -
isopropanol (99. 5: 0. 5 v/v) a un fluj o de 1. 0 ml/min. El vol umen de inyeccin
fue de 20 L. La identi fi caci n y cuant i ficacin de los tocoferol es fueron a
una longitud de onda de 292 nm, con un ti empo de eluci n de 30 min.

El cont enido de tocoferoles en l as muest ras fueron identifi cados y
cuanti fi cados por l a comparacin de los tiempos de ret encin y l as reas de
los est ndares de o- tocofeol , - t ocoferol y o- tocoferol (Si gmaAldri ch Co. ,
St Louis, MO, USA). La pureza de los estndares fue defini da utilizando los
coefici entes de extincin (E 1%) .

4. 15. Anlisis Est adst ico

Los datos fueron analizados por un anl isis de vari anza y comparacin
de medias por l a prueba de Tukey (P<0, 05). Se correl acion los nivel es de
fenol es tot al es y flavonoides tot al es con l a capaci dad anti oxidant e medida por
48









Fi gura 12. Di agrama de ext raccin de t ocoferol es del per i carpio
li ofil izado de chil e (C. annuum L. ).




10g muestra fresca + 10mL
CCl
4
:MeOH (60:40 v/v)
Sonicar 30 min
Centrifugar 17900 g
a 1 C por 15 min
Juntar sobrenadante
Precipitado + 10mL
CCl
4
:MeOH (60:40 v/v)
Ext raer fase ol eosa
y refl uj ar con N
2

Extractos a
20 C
49

ABTS
-+
y DPPH
-
. Para el anlisi s estad sti co el programa el programa
est ad stico Si gmast at 3. 5 (Point Richmond, CA, USA) .