7.7.

2011

BACHELOR 2010/11

MODELLSYSTEME IN DER MOLEKULARBIOLOGIE

Kleine Zusammenfassung / Ergnzung und Mitschrift aus der Vorlesung natrlich keine Garantie um durch die Prfung zu kommen aber hoffentlich bringts euch a bissal was ; ) | Liza

Modellsysteme in der Molekularbiologie Ringvorlesung WS 2011

Modellorganismus = von vielen verschiedenen Wissenschaftlern sehr extensiv untersucht, um eine definierte biologische Fragestellung/Phnomene zu verstehen. Man erwartet, dass die Ergebnisse und Entdeckungen von allgemeiner Bedeutung/Gltigkeit sind. Man whlt also bestimmte Organismen, die gesuchte Eigenschaften besonders deutlich aufweisen. bestimmte Aspekte sollen besonders gut entwickelt sein (Bsp. man untersucht Entstehung von Organen gnstig wenn Organismus durchsichtig man whlt bestimmte durchsichtige Fische) weiters sollten Stock Organismen vorhanden sein, damit diese nicht zu teuer weitergegeben werden Experimente sind durch MO kontrollierbar, Falsches kann aufgedeckt werden, genauso wie Betrug berprfbar ist Bsp) ATP Synthese bei Pro und Eukaryonten sehr hnlich! Mit MO werden auch Unterschiede (nicht nur Gemeinsamkeiten) untersucht. ESCHERICHIA COLI begeieltes (daher bewegliches) Bakterium 20 30 min Vermehrungszeit (37C) Kommt mit verschiedenen Umweltbedingungen gut klar ringfrmiges, doppelstrngiges DNA Molekl mit etwa 4300 Proteinen an ihm wurden DNA Replikation, Proteinsynthese, Operons etc. erforscht in Flssigkeit gezchtet, unter Schtteln (braucht O2, wenn nicht bildet sich Nhrstoffgradient wird an gewissen Stellen mehr verbraucht an gewissen Stellen in Probelsung werden Nhrstoffe weniger) kann Richtung problemlos ndern, Bewegung auch im Kreis mglich System in Bakterien, das Nhrstoffgradienten erkennt Bewegung in diese Richtung Chemotaxis Coli war 1. Organismus, der DNA sehr leicht aus Umwelt aufnehmen kann (von Plasmiden, Phagen) die DNA kann dadurch vermehr werden, sie muss aber zuerst auf die Plasmide und von dort in E. Coli bertragen werden fr Industrie wichtig: Proteinsynthese, allerdings bei E. Coli etwas andere Synthese als bei Eukaryonten; wird zur Herstellung von Medikamenten verwendet (z.B. Insulin) bestimmte Substanzen knnen gezielt produziert werden (Bsp. Aminosuren) auch gut studiert werden kann Verhalten der Individuen in einer Population (obwohl genetisch gleich Unterschiede in Verhalten, unterschiedliche Ausprgung von Proteinen, obwohl idente Gene) Topo Isomerase in E. Coli sehr gut untersucht worden Transport, Stoffwechselvorgnge ebenfalls

BACILLUS SUBTILIS kann resistente Dauerform bilden (Sporen) im Gegensatz zu E. Coli; bei schlechten Umweltbedingungen werden diese dann besser Keimung Untersuchungen: vom Keim zum fertigen Organismus wird als nicht pathogener MO gezchtet BCKERHEFE (Saccharomyces cerevisiae) eukaryot. Organismus Aufflligkeiten: Narben bud scars, Narben von Sprossen; Bildung eines bud eines Spross Fragestellungen die damit beantwortet werden knnen: Wie kommt Teil eines K erns in andere Zelle? Regenerationszeit: 90 120 min bei etwa 30C leicht kultivierbar, auch selektiv kultivierbar (in synthetischem Medium es knnen bestimmte Nhrstoffe weggelassen werden und so beispielsweise das Wachstum der Hefe hemmen durch Weglassen von Leucin; so kann auch Hefe gezchtet werden, durch Einschleusen von Plasmiden, die bei dieser konkreten Bedingung wchst) 2 Mating Types ( a und , MATa und MAT): unterscheiden sich nach auen nicht; wird a mit gepaart diploider Organismus 1 Chromosomensatz: 16 Chromosomen haploid (sowohl a als auch ) auch tetraploid kann eingefroren werden 30% der Gene der Hefe haben menschliche Homologe 12 Millionen Basenpaare 6300 verschiedene. Proteine in verschiedenen Mengen nicht pathogen, sehr geeignet fr genetische Screens es knnen sehr viele Organismen gleichzeitig gemessen werden alle Anfnge mit Hefe gemacht erstes richtiges Modellsystem Lebenszyklus haploide Zelle Spross Teilung (vegetativ) in a und a bei Mischung von a und : a Faktor und - Faktor werden gebildet wird jeweils anderer Faktor entdeckt Stop des Wachstums Bildung von kleiner Ausbuchtung hier kommt es zur Fusion Zygote Kernverschmelzung diploid bei meiotischer Teilung 4 haploide Ascosporen aus diploiden Individuen a a bei schlechten Bedingungen

Wenn Lebensbedingungen besser werden Germination Bildung von vegetativen Formen Kultivierung in Kolben (unter Schtteln) oder Agar Platten Koloniebildung Bsp. fr Anwendung: Zelle a mit Marker X Zelle mit Marker Y bei Verschmelzung Bildung von Spross a/ Zelle X/Y Marker von Wildtype bei gleich dominanten Markern ruhen lassen schlechte Umweltbedingungen hervorrufen Glucose + Stickstoff entziehen Bildung von Tetrade (4 Sporen) knnen seziert werden 1 Ascus kann separiert + zerlegt werden 4 einzelne Zellen mit Abstand wieder Agarplatte zum Auskeimen Ergebnis: sofort sichtbarer Marker (durch Wachstumsschwierigkeiten kleinere Kolonien) einer der Marker dafr verantwortlich mit - statt + benannt weil hemmend Randon Spore Analyse: Zufallsanalyse eine Spore wird aus Tetrade entfernt + kultiviert Sehr einfach MUTAGENESE vollziehbar, weil sehr viele Stoffe und Umstnde fr Hefe mutagen wirken. Arbeit mit Temperatur Bestrahlung mit hoher Temperatur welche Kolonie ist nun temperatursensitiv Kolonie mit nicht bestrahlter Kolonie auf Agar Platte erwrmen resistente Kultur? temperatursensitive Mutanten kann bei hoher Temperatur wachsen oder nicht welche Genvernderung hngt damit zusammen? Suche von Komplementation durch gesunde Gene, die in Zelle eingefgt werden kann Temperaturresistenz wieder hergestellt werden DNA Fragment kann analysiert werden und so das Gen fr Temperatursensitive gefunden werden (wird heute allerdings nicht mehr so oft angewendet) DELETION/AUSTAUSCH YFG = your favourite gene; bestimmtes Stck (Gen oder Teil davon) Primer docken rechts und links vom Gen an (hier Kan MX Kanomezinresistenz) Primer verlngert (45 60 Nucleotide) Primer verlngert diese sind mit Regionen um YFG homolog PCR kann nun als lineares Fragment eingebaut werden Eigenschaft von Hefe: auch kurze Abschnitte sind sehr schnell integriert YFG kann schnell ersetzt werden FAGGING, PROTEINFUSION Kassette wird integriert wesentlich gleicher Vorgang YFP fusioniert mit GFP aber auch hier wird selektiver Marker gebraucht GFP muss wieder gefunden werden wenn am Endterminus Problem: Promotor wird unterbrochen, also muss zustzlicher Promotor angebunden werden, daher normalerweise am C Terminus angesetzt

Mitochondrial Import Machinery Mitochondrial preproteins with amino - terminal presequences must cross two membranes to reach the matrix of the organelle. Both outer and inner membranes contain hydrophilic high-conductance channels that are responsible for selective translocation of preproteins. The channels are embedded in dynamic protein complexes, the TOM complex of the outer membrane and the TIM23 complex of the inner membrane. Both channel-forming proteins, Tom40 and Tim23, carry specific binding sites for presequences, but differ in their pore size and response to a membrane potential. Studies with the TOM machinery show that other subunits of the translocase complex also provide specific binding sites for preproteins, modulate the channel activity and are critical for assembly of the channel. Yeast Two Hybrid System (Y2H) = Technik der Molekularbiologie zur Aufklrung von Protein-Protein-Interaktionen. Im Screening - Verfahren knnen in einem eher empirischen Ansatz mit einer cDNA - Bank als Prey mgliche Interaktionspartner identifiziert werden, oder aber es knnen bei dem so genannten Single mating mit diesem System gezielt die Interaktion fr bestimmte Proteine berprft werden. in-vivo-Methode Grundlage = ein zur Genregulation bentigtes Protein, ein so genannter Transkriptionsfaktor. In Saccharomyces cerevisiae bedient man sich normalerweise des Transkriptionsfaktors GAL4. Dieser besitzt zwei verschiedene Domnen, eine zum Binden an der DNA (Bindedomne, GAL4-BD) und eine, welche die Transkription aktiviert (Aktivierungsdomne, GAL4-AD). Obwohl die beiden Domnen sich normalerweise auf derselben Polypeptidkette befinden, sind diese auch dann wirksam, wenn sie von zwei unterschiedlichen Proteinen ber nonkovalente Protein-Protein-Interaktionen zusammengebracht werden. Dazu bedient man sich zweier in Hefe kompatibler Expressionsvektoren. Jedes der beiden Plasmide trgt jeweils ein fr das entsprechende Experiment konstruiertes Fusionsgen. Dieses kodiert im ersten Fall fr ein Hybridprotein, das aus der GAL4-BD besteht und an der sich die Aminosuresequenz anschliet, fr die ein potentieller Bindungspartner gefunden werden soll (Bait-Protein, Kderprotein). Das zweite Plasmid kodiert ein Hybridprotein, das sich aus der GAL4-AD und im Anschluss aus einem mglichen Bindepartner fr das Bait-Protein zusammensetzt (Prey-Protein, Beuteprotein). Beide Hefe-Zwei-Hybrid-Plasmide replizieren sich sowohl in Hefe wie auch in E. coli autonom (Shuttle-Vektoren). Ein Hefestamm wird mit beiden Plasmiden transformiert, der kein funktionierendes gal4Gen hat und ein oder mehrere Reportergene trgt, denen eine Bindestelle fr den GAL4Transkriptionsfaktor vorgeschaltet ist. Als Reporter dieser Interaktion fungieren Gene, die entweder bestimmte Aminosuren bzw. Basen herstellen knnen (z. B. Histidin, Uracil oder Adenin) oder eine optische Erkennung ermglichen (z. B. ein Farbumschlag katalysiert durch das lacZ-Gen). Wenn es zwischen Bait und Prey zu einer Interaktion kommt, resultiert daraus in der Regel eine funktionelle Rekonstitution des GAL4-

Transkriptionsfaktors, was eine Expression der Reportergene zur Folge hat. Letzteres kann durch Wachstum auf entsprechenden Selektionsmedien nachgewiesen werden, z. B. auf einem Mangelmedium fr Histidin wachsen in der Folge nur Hefen, bei welchen Bait und Prey interagieren und so das Enzym zur Histidin-Synthese exprimieren. DNA MICROARRAY EXPERIMENT A DNA microarray consists of an orderly arrangement of DNA fragments representing the genes of an organism. Each DNA fragment representing a gene is assigned a specific location on the array, usually a glass slide, and then microscopically spotted (less than 1 mm) to that location. Through the use of highly accurate robotic spotters, over 30,000 spots can be placed on one slide, allowing molecular biologists to analyze virtually every gene present in a genome. The main advantage of microarrays is that the spots are single stranded DNA fragments that are strongly attached to the slide, allowing cellular DNA or RNA to be fluorescently labeled and laid overtop of the array. DNA or RNA in the overlaid sample will stick (through a process called hybridization) to a complementary spot on the array, that is, Gene-A will stick to a spot composed of a Gene-A fragment. By exposing the microarray to a fluorescently labeled sample the DNA that hybridizes will be identifiable as glowing spots on the array, while the spots that have nothing hybridized to them will not be visible. Two main types of commercial microarrays, oligonucleotide arrays (Affymetrix) and cDNA arrays (BD Biosciences and others), provide good examples of how this technology works. SYNTHETIC GENETIC ARRAY ANALYSE Synthetic lethality occurs when the combination of two mutations leads to an inviable identify genes whose products buffer one another or impinge on the same essential pathway. For the yeast Saccharomyces cerevisiae, we developed a method termed Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, which offers an efficient approach for the systematic construction of double mutants and enables a global analysis of synthetic lethal genetic interactions. In a typical SGA screen, a query mutation is crossed to an ordered array of approx 5000 viable gene deletion mutants (representing approximately 80% of all yeast genes) such that meiotic progeny harboring both mutations can be scored for fitness defects. This array-based approach automates yeast genetic analysis in general and can be easily adapted for a number of different screens, including genetic suppression, plasmid shuffling, dosage lethality, or suppression.

CAENORHABDITIS ELEGANS
Name von schlngelnder Bewegung Sydney Brenner Vater von C. elegans, beschftigt sich mit Grundprobleme der Biologie und suchte einen einfachen Organismus fr diese Studien. Wieso gerade C. elegans?

I. Relativ einfacher Organismus um Entwicklung zu studieren, vom befruchteten Embryo zu Erwachsenen, bis zum Tod - differenzierte Gewebe (Muskel, Darm, Haut, Nerven), wie im Menschen - im Gegensatz zu uns, Gre handhabbar, Haltung in riesigen Quantitten - eine kleine und invariante Anzahl an Zellen im Adulten (cell signaling, cell lineage) - mittelgroes, sequenziertes Genom, mit hoher Gendichte - kurzer Lebenszyklus erleichtert die Isolation von Mutanten und phenotypische Studien - weit verbreitet verwendeter multizellulrer Organismus, der sich einfrieren lsst - Stocks als Dauerlarven II. Wir knnen ber Gesundheit und Krankheit lernen - viele wesentliche Gene fr Entwicklung sind im Menschen auch vorhanden - Zelltodgene sind im Menschen konserviert (z.B Krebszellen gehen in den programmierten Zelltod - Gene die Krankheiten hervorrufen knnen im Wurm analysiert werden - Homologe Gene von Wurmparasiten knnen in C. elegans studiert werden III. Viele Wekzeuge wurden bereits entwickelt! - Einbringen exogener Gene - Gene knnen ausgeschaltet werden; Expressionsanalysen (microarrays, ChIP-Seq, -omics, etc) Lebenszyklus kurzer Lebenszyklus (2,5 Tage bei 25C), Lebensdauer ~ 18 Tage auf Petrischalen mit Agarflchen + E. Coli als Nahrung fr Wrmer gezchtet 4 Larvenstadien bei ungnstigen Bedingungen Dauerstadium zwischen L1 und L2 Larvenstadium; bei bergang von Dauer auf Larvenstadium Schlpfen holocentrische Chromosomen: Zentromerangriffspunkte fr Spindel ber ganzes Chromosom verteilt C. Elegans besitzt sehr kleines Genom, was ihn fr die Forschung optimal macht! Anatomie: Schlund, Gonade, einfacher Verdauungstrakt, Nervensystem, Epidermis, Uterus Mnnchen: markantes Merkmal Befruchtungsfcher (Spiculae), mit diesen wird jedes Tier abgetastet bis Weibchen gefunden wird Mnnchen sind sehr selten, mssen daher durch meiotic Non Disjunction hergestellt werden Hitzeschock verlieren zweites X Chromosom, Hermaphroditen werden erzeugt (knnen sich selbst befruchten, da zunchst von den Gonaden Keimzellen gebildet werden, die sich zu Spermien differenzieren und danach auf Oozytenproduktion umgestellt wird)

Entwicklung in Gonade: in L1: Vorluferzelle C1 + C2 teilen sich in weiteren Stadien, gehen dann in Spermatogenese Spermien gebildet und gelagert in Gonade an Eizellen vorbei obere Zellen differenzieren sich zu Eizellen (gelb in Abb.) werden nach unten zu den Spermien befrdert.

Zellinie ist vllig reproduzierbar, Anzahl der somatischen Zellen ist festgelegt fhrte zur Entdeckung von Apoptose John Sulston erstellte Lineage durch gezielte Frbungen im Wurm Embryogenese 1. Abschnitt - Teilungen erfolgen in einer Membran, bis er schlielich schlpft - 1. Zellteilung immer asymmetrisch: AB und P1 (Keimbahn) - dann Teilung zu Abp und Aba: dorsoventrale Achse festgelegt - P1 teilt sich zu EMS und P2 - Spindelrotation um 90C - alle folgenden P Teilungen sind asymmetrisch! - keine strenge Korrelation zwischen Grnderzelle u. Gewebe; Gewebe aus verschiedenen Grnderzellen; Ausnahme Keimbahn (P4), Gedrm (E) 2.Abschnitt - 100 min nach erster Teilung beginnt Gastrulation

- verschiede Zellen wandern z.B.: E Nachkommen sinken ins Innere des Embryos (12 Zellen wandern im Embryo) - weitere Zellteilungen folgen 3. Abschnitt - 350 min nach erster Teilung proliferative Phase beendet - Morphogenese - Muskelzucken - zylindrische Form - Kollagenkutikula - 760 min Pharynx beginnt zu pumpen - 800 min Wurm schlpft mit 558 Zellen (113 programmierter Zelltod) Induktion: Weiterleitung von Signalen zwischen den Zellen Beispiel fr Induktion Delta Notch Signaling: abgeschnittener Notch Teil wandert in Zelle, P1 Zelle hat Delta Liganden, AB Zelle hat Notch Rezeptor P granules werden dazu gebraucht, dass die befruchtete Zelle gebildet werden kann, sind stark in P1 Zelle (posterior) vertreten spter symmetrisch in beiden Tochterzellen vorhanden GFP Gene Florescence Protein aus C. elegans + einer Quallenart isoliert Transgenesis: in 5 10% d. Flle fremdeingebaute DNA wird in lngere Stcke zusammengefasst unc. Mutanten = uncoordinated, nicht bewegliche Wrmer, die nicht ins Dauerstadium bergehen knnenn

DROSOPHILA
kein Schdling Kosmopolit Verbreitungsgebiete wie Mensch in Amerika erst relativ junge Arten, schnelle Besiedelung, sehr anpassungsfhig holometaboles Insekt = Metamorphose von Larve bis ausgewachsenes Tier (drittes Larvenstadion ~ 3 Tage Puppenphase 3 Tage ist nach Schlpfen in 3 4 Stunden geschlechtsreif) - deutlicher Geschlechtsdimorphismus an Frbung, Gre, Vorhandensein von Geschlechtskmmen am 1. Beinpaar zu erkennen - kein Patentschutz bei Drosophila Mutationen heterozygote Mutationen durch Inzucht homozygot (rezessiv) White Mutation Drosophila mit heller Pigmentierung weisen groe Resistenz gegen X Rays auf (tolerieren bis zu 400 Rad) somatische Zellen sind groteils nicht mehr teilungsfhig bei ausgewachsenen Tieren mutieren nicht mehr

chemische Mutagenese funktioniert ebenfalls sehr gut; in 50er: genetische Parasiten jumping genes (parasitische DNAs) knnen Positioon im Genstrang verndern Schmarotzer, die versuchen ihre Genzahl zu erhhen; knnen z.B. Punktmutationen initiieren (bspw. Chromosomenbrche) Tansposable Elements TE content bei Mensch 50% des Genoms stammt von Transposon natrliche Mutationen 0.2 0.4% Transposons springen gerne in regulierende Sequenzen hypomorphe milde, nicht lethale Effekte Hitchhock (Temperaturbestrahlung) Puff Bildung im Gen Applying Transposon for Mutagenesis and Functional Genetics 1. Gene Disruption - hopomorphic mutation = A type of mutation in which the altered gene product possesses a reduced level of activity, or in which the wild-type gene product is expressed at a reduced level. - often inserted in regulatory seuqences - loss of function mutation 2. Mutation Rescue Screen - prepare a transgene with a P element - injecting this transgene in the Drosophila embryo - the growing fly has gametes with transformed DNA in its genome 3. Ectopic over expression gain of function

4. P LacZ enhancer trap Gene expression in situ An enhancer trap is a transgenic construction for the identification of enhancers, produced by the fusing of two proteins, genes for which are inserted into the genome. The enhancer trap structure contains a mobile element (necessary for random insertion in the genome) usually some sort of P element (a promoter that must be sensitive to the enhancer) and a reporter gene. The reporter gene is necessary for identification of the spatial regulation by enhancers. The most common and basic enhancer traps are: P[ lacZ ] from the bacterium E. coli and P[ GAL4 ] from yeast. The enhancer trap also uses some sort of visible marker that allows the new insertions to be recognized such as the white gene, resulting in a red eye color in Drosophila or ampicillin resistance for E. coli. There exists a large number of fly stocks containing GAL4 insertions and an equally large number of fly stocks containing an UAS DNA sequence followed by a gene of interest. The beauty of this arrangement is that the expression of a large number of genes with different GAL4 "drivers" is possible. Rather than generating transgenic flies with the enhancer linked directly to the gene of interest (this takes about a year, if you are starting without the appropriate DNA construct), you simply mate (cross) one transgenic fly with another transgenic fly. 5. RNAi - mediated gene knock - down RNA-based, mRNA-targeted therapeuticals specifically target and degrade mRNA using a naturally occurring cellular mechanism, called RNA interference, that regulates the expression of genes. RNA interference (RNAi) is a highly promising therapeutic approach for those diseases where aberrant protein production is a problem. RNAi can also be applied to inhibit the expression or replication of pathogenic viruses, such as HIV and hepatitis C virus. RNA interference is an apparently ancient defense mechanism against foreign double stranded RNA (dsRNA). In RNAi response, RNAs of 21 - 23 nucleotides in length, called small interfering RNAs (siRNAs), are snipped from longer dsRNA chains by an enzyme called Dicer. The antisense strand of the siRNA is used by an RNA-induced silencing complex (RISC) to guide messenger RNA (mRNA) cleavage, so promoting mRNA degradation.

Polytene chromosomes are giant chromosomes common to many dipteran (two-winged) flies. They begin as normal chromosomes, but through repeated rounds of DNA replication without any cell division (called endoreplication), they become large, banded chromosomes. For unknown reasons, the centromeric regions of the chromosomes do not endoreplicate very well. As a result, the centromeres of all the chromosomes bundle together in a mass called the chromocenter. Polytene chromosomes are usually found in the larvae, where it is believed these manyreplicated chromosomes allow for much faster larval growth than if the cells remained diploid. Simply because each cell now has many copies of each gene, it can transcribe at a much higher rate than with only two copies in diploid cells. used for: gene localization studying Drosophila gene expression, in situ! Drosophila Melanogaster Genome - sequence completed in 2000 - 180 million bp - ~ 14000 genes - diploid, 3 autosomes, X and Y (2n =8) - ~ 50% of genes have human homologues - ~ 60% of known disease causing genes in humans have Drosophila homologues Advantages of Drosophila + 2 week generation time + easy and cheap culture conditions + small (4mm long) + easy genetics + robust genome = tolerates high dosages, large deletions, etc. + complete genetic/molecular toolbox, knock-in, knock-out + inducible TE system (P element) + polytene chromosomes, in vivo protein/DNA interaction + well studies ecology, phylogeny and evolution + species rich (> 1.500 species) + already 12 complete genomes available (>40 MY) + stock and species center + non-pathogenic and non-commercial + open scientific community Disadvantage of Drosophila - cannot freeze - homologous recombination difficult

Fruitless master control gene of male specific sexual behavior in Drosophila Male courtship behaviour in Drosophila: - male orients toward and follows female - male taps female with his forelegs - male sings a species specific courtship song by extending and vibrating one wing - male licks female genitalia - male curts his abdomen for copulation fixed pattern of events

PFLANZLICHE MODELLORGANISMEN Polymorphismus: Restriktionsfragment-Lngenpolymorphismen (RFLPs) sind Unterschiede der DNA-Sequenz homologer Chromosomen. Einige von ihnen fhren zu Vernderungen des Restriktionsschnittstellen-Musters. Dieses kann als Bandenmuster sichtbar gemacht werden. Die RFLP-Analyse hat viele Anwendungen, zum Beispiel bei der Genomkartierung in der Grundlagenforschung oder bei der Diagnose von Erbkrankheiten. Die Lnge eines Restriktionsfragments wird durch Mutation beeinflusst, bei der eine Erkennungssequenz fr ein Restriktionsenzym entsteht oder verloren geht. RFLPs dienen u.a. als genetische Marker bei der Genkartierung, da sie umso wahrscheinlicher zusammen vererbt werden, je nher sie zusammen liegen. Sie werden darber hinaus auch zur Suche nach Quantitative Trait Loci, also Chromosomenabschnitten mit Einfluss auf die Ausprgung eines quantitativen Merkmals, sowie in Southern Blots genutzt. Genetic Control of Flowering Time in Arabidopsis: The genetic variation present among a large number of mutants with an earlyor late flowering phenotype, affecting the control of both environmental and endogenous factors that influence the transition to flowering, is described. The genetic, molecular, and physiological analyses have led to identification of different components involved, such as elements of photoperception and the circadian rhythm. Furthermore, elements involved in the signal transduction pathways to flowering have been identified by the cloning of some floral induction genes and their target genes.

FISCHE ALS MODELLSYSTEME Entwicklungsbiologie: - externe Entwicklung - schnelle Entwicklung - Transparenz

Zebrafisch (Danio rerio) wichtige Stadien + Prozesse: - Blastula - Epibolie: Umschlieung des Dotters - Gastrulation: Differenzierung der Keimbltter - Tailbud Stadium: Neuralplatte - Somitogenese: Segmentierung des Rumpfes - Pharyngula: vollendete Organogenese, geschlossenes Neuralrohr, Phylotypiaches Stadium der Wirbeltiere - Adult: keine genetische Geschlechtsbestimmung Bestimmung erfolgt innerhalb des ersten Lebensmonats

wichtige Daten: Generationszeit: 3 4 Monate Nachkommen pro Weibchen: ~ 200 / Woche Organogenese: 1dpf Embryonalentwicklung: extern Gene (1n): ca. 30000 Genom (1n): 1,4 Gbp Chromosomen (1n): 25 RNA-IN SITU HYBRIDISIERUNG: Detektion eines speziellen Transkripts durch eine Antisense-RNA (Die Antisense-RNA (aRNA) ist eine einzelstrngige RNA, die komplementr zur Messenger-RNA (mRNA) ist. Die mRNA wird vom nicht-kodierenden Strang (Matrizenstrang) der DNA transkribiert. Wird auch der komplementre Strang transkribiert, entsteht eine zur mRNA komplementre aRNA. Die aRNA inhibiert durch Basenpaarung mit der komplementren mRNA deren Translation in der Zelle. Damit wird die Genexpression einzelner Gene reguliert. Antisense-RNA stellt eine natrliche Mglichkeit der Genregulation der Proteinbiosynthese dar.) Im Gewebe: Detektion von Zellen, die ein bestimmtes Transkript herstellen.

No tail (ntl): spezifische Expression in der sich entwickelnden Chorda dorsalis (Notochord) retinal homeobox 3 (rx3): spezifische Expression in der Anlage der Retina und des Hypothalamus Paired homeobox 2 (Pax2): Expression in verschiedenen Anlagen, u.a. Ohrvesikel, Auge, Mittelhirn, Schilddrse fli1: spezifische Expression in den Endothelien der Blutgefe (intersegmental blood vessels) Genexpressionsmusterwerden systematisch erfasst und durchsuchbar gemacht auffindbar z.B. in online - Gendatenbanken Ernst Haeckel Biogenetische Grundregel (Ontogenese rekapituliert Phylogenese) Stundenglas-Modell (Hourglass model): Bestimmte Embryonalstadien hneln sich strker als (a) Adulte und (b) frheste Entwicklungsstadien

In welchem Stadium der Fischentwicklung werden tendenziell eher alte Gene exprimiert? George Streisinger etablierte die Fische (Zebrafisch und Medaka) als Modellsysteme.

1. Diploider Screen

2. Parthenogenetischer Haploid - Screen PARTHENOGENESE (von griechisch parthenos, "Jungfrau" & genesis, "Entstehung, Zeugung"): eine asexuelle Form der Fortpflanzung ohne Beisteuerung des mnnlichen Chromosomensatzes (auch GYNOGENESE (von griechisch gyne, "Frau")).

lebensfhig bis ca. 3 Tage einige typische Defekte (Augen, Ohrvesikel) Limitationen 3. Parthogenetischer Diploid Screen Zum Zeitpunkt der Befruchtung befindet sich die Zebrafisch-Oocyte noch vor der Meiose II:

Jede Oocyte enthlt noch einen diploiden Chromosomensatz. Wird die Cytokinese verhindert, entsteht eine diploide Zygote.

Cytokinese = letzter Schritt nach Telophase um die Mutterzelle in 2 voneinander unabhngige Kompartimente zu unterteilen. Zellteilung

Genetische Screens im Zebrafisch haben vor allem zur Entdeckung einer Reihe von Genen beigetragen, die in der Embryonalentwicklung des Zebrafischs und anderer Wirbeltiere eine kritische Rolle spielen. no tail (ntl): Verlust der Chorda dorsalis und der Identitt des ventralen Neuralrohrs Identifikation in einem haploid Screen one-eyed pinhead (oep): Zyklopaugen retinal homeobox 3 (rx3): Verlust der Retina und spezieller Zellen im Hypothalamus pax2a (no isthmus/noi): verschiedene Effekte, u.a. Verlust der Mittel-Hinterhirn-Grenze und der Schilddrse

Forward Genetics: (dazu gehren die eben besprochenen Methoden)

Reverse Genetics: 1. Zink Finger Nucleasen Design spezifischer Restriktionsenzyme (Zinc Finger Nucleasen) fr einen Sequenzabschnitt in einem speziellen Genlokus.

Beispiel: gezielte Mutation des no tail (ntl)-Gens 2. Morpholino Antisense Oligonukleotide MORPHOLINOS (abgeleitet vom chemischen Terminus Morpholino-Ring): Oligonukleotide mit Morpholino-Rckgrat > Nuklease-resistente Wirkung: Interferenz mit (a) Splicing von primren Transkripten (b) Translation von mRNA

Morpholino Oligos oder kurz Morpholinos sind Nukleinsure-Analoga, die als Werkzeuge in der Molekularbiologie verwendet werden, um einen Knockdown (= nur teilweises Abschalten der Funktion eines Genes bezeichnet) von Genen zu erzielen. Die synthetischen Molekle, die durch strukturell vernderte Nukleinsure-Bausteine synthetisiert werden, werden auch als PMOs (phosphorodiamidate morpholino oligo) bezeichnet. Sie werden in antisense-RNA-Experimenten eingesetzt und hemmen durch die Bindung an die komplementre mRNA entweder die Translation oder das Splicing der pr-mRNA und damit die Bildung eines Proteins. Ihre Wirkungsweise ist also vergleichbar den siRNAs, jedoch besitzen Morpholinos eine hhere Stabilitt und damit lngere Halbwertszeit, da sie keine RNase-Substrate darstellen und daher weniger schnell abgebaut werden als antisense-RNA. Nachteil ist jedoch, dass eine Transfektion (= Einbringen von Fremd-DNA in eukaryotische Zellen, mit Plasmiden) der Morpholinos schwierig ist, daher wird meist auf Injektion zurckgegriffen. Vor allem im Zebrafisch-Modellsystem werden Morpholinos hufig eingesetzt, um die Funktion von Genen in der frhen Embryonalentwicklung zu analysieren. 3. SHRNA Der RNAi - Pathway ist alt und konserviert. Initiiert durch verschiedene Ausgangsmolekle dsRNA, siRNA, shRNA.

Design: micro-RNA-hnlicher RNA-Stemloop gegen ein Target-Gen. Injektion des Expressionskonstrukts, Knock Down des entsprechenden Target Gens.

A small hairpin RNA or short hairpin RNA (shRNA) is a sequence of RNA that makes a tight hairpin turn that can be used to silence gene expression via RNA interference. shRNA uses a vector introduced into cells and utilizes the U6 or H1 promoter to ensure that the shRNA is always expressed. This vector is usually passed on to daughter cells, allowing the gene silencing to be inherited. The shRNA hairpin structure is cleaved by the cellular machinery into siRNA, which is then bound to the RNA-induced silencing complex (RISC). This complex binds to and cleaves mRNAs which match the siRNA that is bound to it. shRNA is transcribed by RNA polymerase III. shRNA production in a mammalian cell can sometimes cause the cell to mount an interferon response as the cell seeks to defend itself from what it perceives as viral attack. This problem is not observed in miRNA, which is transcribed by RNA polymerase II (the same polymerase used to transcribe mRNA). shRNAs can also be made for use in plants and other systems, and are not necessarily driven by a U6 promoter. In plants the traditional promoter for strong constitutive expression (in most plant species) is the cauliflower mosaic virus 35S promoter (CaMV35S), in which case RNA Polymerase II is used to express the transcript destined to initiate RNAi.

Keimbahn Transgenese: Stabile Integration von DNAKonstrukten in das Zebrafisch-Genom, via Transposons, via Retroviren, via Endonucleasen (SceI). Integration von kleineren DNAKonstrukten bis hin zu BACs (bacterial artificial chromosomes, 150kB). Zellautonomie und die Entdeckung induktiver Signale: Bei autonomer Entwicklung entwickeln sich die Zellen unabhngig von anderen (entspricht Mosaikentwicklung). Ursache dieser Zellautonomie ist ein Mosaik von Determinanten (= Bestandteile einer Eizelle) welche den Zellen, in die sie whrend der Embryonalentwicklung gelangen, ihren Entwicklungsweg bestimmen (ist also schon "vorprogrammiert"). Oft handelt es sich dabei um mtterliche (= maternale) mRNA, die in bestimmten Regionen der Eizelle verteilt ist. Sichtbar wird das, wenn der Phnotyp der Nachkommen von der Mutter bestimmt wird, d.h. die 1. Mendelregel (= "Reziprozittsregel") trifft nicht zu. Zell Mosaike als Mittel der Untersuchung: Hat die Zell-spezifische Inaktivierung von Faktor X einen Einfluss auf Nachbarzellen, oder nur auf die Zelle selbst? Hat die ektopische Expression von Faktor X einen Einflu auf Nachbarzellen, oder nur auf die Zelle selbst? Bsp. fr Fragestellungen Mittel zur Herstellung von Zellmosaiken: Genetische Methoden (wie in anderen Modellsystemen) z.B. ber Zell-spezifische Promotoren ektopische Expression von Genen Zell-spezifischer Knock-Down (shRNA). Klassische Embryologie (Besondere Strke des Fischsystems) z.B. Zell- oder OrganTransplantation Zelltransplantation: Universelle Methode schnelle Experimente (BlastulaTransplantation: 3h) beliebig kombinierbar. Donor >> Host mutant >> Wildtyp Wildtyp >> mutant berexpression >> Wildtyp Morpholino-Knockdown >> Wildtyp shRNA-Knockdown >> Wildtyp Beispiel no tail (ntl): Ist die Mutation zell-autonom? oder nicht-zellautonom? Haben mutante Zellen das Potential, zu (a) Chorda (b) Neuralrohr zu werden?

Mutante Zellen knnen auch im Wildtyp - Kontext keine Chorda bilden >> zell-autonome Funktion. Sie knnen aber zur Bodenplatte des Neuralrohrs beitragen >> dieser Phnotyp ist also nichtzellautonom (Hinweis auf ein induktives Signal von Chorda auf Neuralrohr). Beispiel: Einfluss einer bestimmten Signalmolekl-Klasse (Fgf-Signale) auf die Projektion der retinalen Ganglien-Zellen ins Gehirn:

Neurobiologie Bsp. Fluchtantwort als einfacher neuronaler Schaltkreis Charakteristika: schnell (ms-Bereich) gerichtet (von der mechanischen Reizquelle fort) stereotypisch (Erstbeschreibung im Karpfen und Lungenfisch)

Mauthner Zellen sind extrem groe Neurone mit langen kontralateralen Projektionen.

Kritische Rolle dieser Zellen bei der Fluchtantwort:

Jeder Fisch hat zwei Mauthner-Zellen, im unteren Teil des Hirnstamms liegt auf der linken Seite und auf der rechten Seite. Jede Mauthner-Zelle hat ein Axon, das ber gekreuzte innervierende Neurone gleichzeitig Gehirn-Ebene und Rckenmark mit zahlreichen Verbindungen ausstattet. Die Synapsen, welche durch eine Mauthner-Zelle generiert werden, werden so mchtig, dass ein einzelnes Aktionspotential Anlass zu einem groen Verhaltensreaktion gibt: innerhalb von Millisekunden wenden die Fische ihren Krper in eine C-Form, was einen Rcksto erzeugt, der sie so schnell vorwrts treibt. Funktionell ist dies eine schnelle Flucht Reaktion. Am einfachsten ist sie durch eine starke Schallwelle oder Druckwelle auszulsen, die auf das Seitenlinienorgan des Fisches auftritt. Mauthner Zellen sind nicht die einzigen identifizierten Neurone im Fisch es gib etwa 20 weitere Arten, darunter einige "Mauthner-Zellen Analoga" in jedem spinalen segmentalen Kern. Obwohl eine Mauthner-Zelle in der Lage ist eine Fluchtantwort von ganz alleine herbeizufhren, ist das gewhnliche Verhalten anderer Arten von Zellen in der Regel auschlaggebend, um die Gestaltung der Amplitude und Richtung der Reaktion zu bestimmen. Mauthner-Zellen wurden als Befehl Neurone beschrieben. Ein Befehl Neuron ist eine besondere Art der identifizierten Neurone, wie eine Nervenzelle, die in der Lage ist, ein spezifisches Verhalten von selbst definiert auszusenden. Solche Neuronen erscheinen am hufigsten in den schnellen Flucht Systemen verschiedener Spezies der Tintenfische. Riesenaxone und Tintenfisch Riesen Synapsen, werden fr bahnbrechende Experimente in der Neurophysiologie wegen ihrer enormen Gre verwendet, auch wegen der schnellen Flucht Schaltung des Tintenfisches. Es hat sich jedoch gezeigt, dass das Konzept eines Befehl Neurons umstritten ist, weil Studien zeigen, dass einige Neurone, die zunchst in die Beschreibung passen zu schienen, nur in einer begrenzten Anzahl von Fllen eine Reaktion auslsen knnen. Optogenetik Modifikation von Neuronenaktivitt durch Licht Channelrhodopsin: ein photo konvertierbares Werkzeug der Optogenetik natrliches Vorkommen in der Grnalge Chlamydomonas reinhardtii

Depolarisierung der Zellmembran neuronale Aktivierung

Wenn man dieses Protein in einen transparenten Fisch einbringt und gezielt in speziellen Neuronen aktiviert, kann man die Funktion dieser Neuronen fr ein gegebenes Verhalten testen. z.B. auch fr die Fluchtantwort des Zebrafisches Stabile Markierung von Sensorischen Neuronen mit (a) Channelrhodopsin (b) EGFP Erzeugt die Aktivierung dieser spezifischen Neuronen eine Fluchtantwort?

MARINE MODELLSYSTEME Welche Probleme bringt ein Fokus auf wenige Modellsysteme mit sich? - Jede Art hat Besonderheiten (zB. Bestimmte Entwicklung, Lebensweise, Zellbiologie, Sinnesorgane)

- Viele spannende und grundstzliche biologischen Phnomene sind mit den typischen modernen molekularen Modellsystemen nicht abgedeckt. Das bedeutet also, dass sich Modellsysteme in der Biologie stndig wandeln. Marine Modellsysteme: weniger molekulare Methoden etabliert, als z.B. Maus, Hefe, C.elegans oder D. melanogaster, aber wichtig fr Verstndnis der Evolution, Chronobiologie marine kologie (Plankton!) Platynereis dumerilii: einfaches Nervensystem typisches Strickleiternervensystem der Wirbellosen einfach und preiswert kultivierbar Inzuchtstmme typischer Lebenszyklus eines marinen Wirbellosen groe, synchron entwicklende Gelege Genomgrsse: 1 Giga Basenpaare transparente Embryonen Mikroinjection mglich Platynereis Lebenszyklus:

Metamophose zu weiblichen und mnnlichen Tieren. Platynereis kann funktionell manipuliert werden was wiederum wichtig ist fr:

 Verfolgung von Zellentwicklungsschicksalen Transgenese funktionale Tests (z.B. Morpholinos, RNA Interferenz, Zink - finger vermittelte Mutationen) Pdu-tuba4.4k:GFP spiegelt die Expression des endogenen Gens wieder (Fluoreszierendes Gen Warum gerade dieser Modellorganismus? Menschen und Platynereis verndern sich besonders langsam.

Was bedeutet das fr evolutionre Studien? Bsp. Augen gibt es in allen groen Tiergruppen. Augentypen sind morphologisch sehr unterschiedlich (Zelltypen, Zellzahl, Zusammensetzung, Aufbau). Es existieren 2 Typen von Photorezeptorzellen, der zilire Typ und der rhabdomere Typ. Trotz aller Unterschiede erstaunliche hnlichkeiten bei der Augenentwicklung von Taufliege und Wirbeltieren! Das pax6 Gen von Maus und Taufliege kann ektopische (= nicht am physiologischen Ort befindliche) Augen induzieren. Langsam evolvierende Spezies knnen dazu beitragen, das Rtsel um die Entwicklung der verschiedenen Augentypen zu lsen. Opsine:

Zwei getrennte Opsinfamilien sind so alt wie alle Bilateria. (blau = Ecdysozoa, rot = Lophotrochozoa, grn = Deuterostomia) Zwei Zelltypen (rhabdomer vs. zilir) und zwei Opsinfamilien: Kann man das korrelieren? Zwei Photorezeptorgruppen standen am Anfang der Evolution von Bilateria:

Gene, Zelltypen, Organe und viele andere Strukturen knnen im Verlauf der Evolution verloren gehen durch Mechanismen der Organevolution Duplikation, Modifikation, Zellwanderungen und Zelltypverlust. Es kommt also auf den richtigen Vergleich zwischen den Spezies an um Erkenntnisse zu gewinnen. In welchen anderen Bereichen bieten marine Modellsysteme Erkenntnisse? Die Biologie der inneren Uhr: Chronobiologie Biologischer Rhythmus = periodische Wiederkehr spezieller Zustnde, z.B. Schlaf- / Wachzyklus Biologische Uhr = innerer Mechanismus in Organismen, der den Rhythmus kontrolliert! Klassische genetische Modellsysteme zeigen diese Rhytmen nicht! Zircadiane Rhythmen: Molekulare Mechanismen bekannt bei: Prokaryonten, Tieren, Pflanzen, Pilzen Saisonale Rhythmen: Molekulare Mechanismen bekannt bei: Tieren, Pflanzen andere Rhythmen: halb-tiden tiden halb-monatlich

 monatlich jhrlich 1.) Kein Molekl einer lunaren Uhr ist bisher bekannt. 2.) Ungeklrt, wie verschiedene Rhythmen in einem Organismus koordiniert werden knnen! Lunarperiodizitt: ein gut dokumentiertes Phnomen in Platynereis dumerilii Das Leben im Rhythmus der Gezeiten: Clunio marinus (Chironomidae, Diptera), Gezeitenzone der Europische Atlantikkste Schlupfrhythmen der erwachsenenMcken: 1) Seasonal 2) Circalunar 3) Circadian Circalunare und circadiane Rhythmen werden durch innere Uhren kontrolliert. Wie weist man die innere Uhr nach? 1.) Rhythmus durch uere Stimuli bedingt 2.) Rhythmus luft auch ohne uere Stimuli (Dunkel-Dunkel Experimente), durch uere Stimuli mit Umwelt synchronisiert Der circalunare Rhythmus von Platynereis wird durch eine innere Uhr kontrolliert:

Diesbezglich stehen fr die Wissenschaft noch viele offene Fragen zur Verfgung: Wie wird das Mondlicht wahrgenommen? Wie interagieren zirkadiane und zirkalunare Uhren? Wie funktioniert die zirkalunare Uhr aufmolekularer Ebene? Wie funktioniert die lokale Adaptationder circadianen Uhr bei Clunio? Diatomeen = Kieselalgen (>105 Arten) - Zellenhlle (Frustel): Siliziumdioxid (Anhydrid der Kieselsure: SiO2 n H2O)+

- entstanden durch sekundre Endosymbiose (ca. vor 1 Mrd. Jahre) (Grnalge verschmilzt mit Rotalge 2 Plastiden vorhanden chimrer Plastid entsteht Diatomeen, Braunalgen und weitere Algen) - Kieselalgen sind Teil des marinen Phytoplankton - photosynthetisch aktive Meeresorganismen: <1% der gesamten photosynthetischen Biomasse der Erde - eukaryotische Phytoplanktonarten: Diatomeen, Coccolithophoriden, Dinoflagellaten - aber: photosynthetische Meeresorganismen: ca. 50% der jhrlichen Primrproduktion von Biomasse 3 Diatomeenspezies dienen als Molekulare Modellsysteme: Thalassiosira pseudonana (32.4 Mb) Koordiniert durch Ginger Armbrust Phaeodactylum tricornutum (27.4 Mb) Koordiniert durch Chris Bowler Fragilariopsis cylindrus (98 Mb) Koordiniert durch Thomas Mock P. tricornutum lsst sich einfach kultivieren (vergleichbar mit E.coli oder S. cerevisiae) Existente molekulare Resourcen fr Phaeodactylum: - Phaeodactylum Digitale Gene Expressionsdatabank - Genetische Transformationen: berexpression, Knockout (RNAi), Subzellulre Lokalisation (z.B. ber GFP) - Mikroarrays - Vergleichende genomische Sequenzanalyse Gene Gun: DNA beschichtete Gold- oder Wolframpartikel werden mit Helium-vermitteltes Partiklebombardement auf die Diatomeenzellen auf einer Agarplatte geschossen. Ein GFP: Talin Fusionsprotein zur Beobachtung zellulrer Prozesse Diatomeen als Modell fr lichtregulierende Prozesse. Studium d. Photosynthese: Kieselalgen besitzen Photosysteme von Grn- und Rotalgen. Wie genau betreiben diese Organismen also Photosynthese? Die Qualitt und Quantitt des Lichts im Meer gibt Auskunft ber: Tageszeit Saison Bewlkung Tiefe Kstenentfernung Turbulenzen

Die Photorezeptoren in Diatomeen bestehen aus Apo Proteinen + Chromophoren.

Es kam zur Entdeckung einer enormen Vielfalt an Lichtrezeptormoleklen in den Diatomeen.