REPBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA LA UNIVERSIDAD DEL ZULIA FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS DIVISIN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS MAESTRIA EN MICROBIOLOGA

Entamoeba histolytica Y Entamoeba dispar DIAGNOSTICADAS MEDIANTE REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Y SU CORRELACIN CON LA PRESENCIA O NO DE MANIFESTACIONES CLNICAS EN LA COMUNIDAD DE SANTA ROSA DE AGUA.

Trabajo de Grado presentado ante la Divisin de Estudios para Graduados para optar al grado de Magster Scientiarum en Microbiologa.

Autor: Angela Mara Bracho Mora. Tutor: MgSc. Zulbey Rivero de Rodrguez. Co-Tutor: Dra. Nailet Arraz.

Maracaibo, Febrero 2007

Entamoeba histolytica Y Entamoeba dispar DIAGNOSTICADAS MEDIANTE REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Y SU CORRELACIN CON LA PRESENCIA O NO DE MANIFESTACIONES CLNICAS EN LA COMUNIDAD DE SANTA ROSA DE AGUA.

Autor: Lic. Bracho Mora, Angela Mara C.I: V-14.116.754 Direccin: Residencias El Nazareno Edif. 13 Apto B-1 Telfono: 0261-7560742 / 0416-4679904 Correo electrnico: angelitab60@hotmail.com ___________________________ Firma

_____________________ MgSc. Zulbey Rivero C.I.: 9.170.061 Tutor

_____________________ Dra. Nailet Arraiz C.I.: 7.465.186 Co-tutor

El jurado nombrado por el Comit Acadmico de la Maestra en Microbiologa, para evaluar el Proyecto de Trabajo de Grado, titulado Entamoeba histolytica Y Entamoeba dispar DIAGNOSTICADAS MEDIANTE REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Y SU CORRELACIN CON LA PRESENCIA O NO DE MANIFESTACIONES CLNICAS EN LA COMUNIDAD DE SANTA ROSA DE AGUA, presentado por la Lic. Angela M. Bracho M., C.I: 14.116.754, ante la Divisin de Estudios para Graduados como requisito para optar al grado de Magster Scientiarum en Microbiologa. Maracaibo, Febrero 2007.

Jurado Evaluador

____________________________ MgSc. Zulbey Rivero C.I: 9.170.061

______________________ MgSc. Leticia Porto C.I: 9.340.415

____________________________ Dra. Odelis Daz C.I: 5.837.920

INDICE GENERAL Resumen Abstract Introduccin Objetivos Generales Objetivos Especficos Materiales y Mtodos 1.- Tipo de investigacin 2.- Diseo de la Investigacin 3.- Poblacin de Estudio 4.- Sujetos de Estudio 5.- Diseo de Experimento 5.1.- Anlisis Parasitolgico - Muestras 5.2.- Anlisis de Biologa Molecular 5.2.1.- Materiales - Cepas Utilizadas - Oligonucletidos Utilizados - Enzimas y otros reactivos 5.2.2.- Mtodos 6 7 10 21 21 22 22 22 22 23 24 24 24 24 24 24 24 25 25

- Extraccin y purificacin de ADN genmico de Entamoeba sp. 26 - Ensayos de amplificacin por PCR - Electroforesis horizontal en geles de agarosa 5.3.- Evaluacin Clnica 6.- Anlisis Estadstico 26 28 29 29

Resultados y Discusin Conclusiones Recomendaciones Referencias Bibliogrficas Anexos ndice de Ilustraciones - Figura - Tablas ndice de Anexos

30 42 44 45 51

69 69 70

Bracho Mora, Angela Mara Entamoeba histolytica y Entamoeba dispar diagnosticadas mediante Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) y su correlacin con la Presencia o no de manifestaciones clnicas en la comunidad de Santa Rosa de Agua Universidad Del Zulia. Facultad Experimental de Ciencias. Divisin de Estudios para Graduados. Maestra de Microbiologa. Maracaibo, Venezuela. 2007. 70 p.

RESUMEN La identificacin diferencial de Entamoeba histolytica (patgena) y Entamoeba dispar (no patgena) es esencial para el tratamiento adecuado del paciente y con fines epidemiolgicos. Se diseo este estudio con el objetivo de determinar la prevalencia de Entamoeba histolytica y Entamoeba dispar. Para ello se estandariz y aplic un ensayo de PCR utilizando oligonucletidos especficos para cada especie. Un total de 204 muestras de heces de individuos de la comunidad de Santa Rosa de Agua, fueron analizadas a travs del examen directo con SSF (0,85%) y lugol, concentrado de formol-ter y tcnica de PCR. Al examen microscpico, 42 individuos (20,58%) presentaron formas evolutivas del complejo Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar; mientras que la tcnica de PCR evidenci un total de 47 casos positivos a estas amibas; de los cuales 22 eran portadores de E. histolytica (10,78%), 16 (7,84%) de E. dispar y 9 (4,41%) presentaron infeccin mixta. No hubo diferencia significativa al relacionar las variables sexo y presencia de E. histolytica y/o E. dispar, ni entre los grupos etarios. Se observ ausencia de casos de estas amibas, en los nios menores de 2 aos. El principal hallazgo clnico encontrado fue dolor abdominal, seguido de prurito anal y diarrea en los individuos infectados tanto con E. histolytica como por E. dispar. La elevada cantidad de individuos sintomticos parasitados con las amibas, que presentaban asociaciones con otras especies patgenas o potencialmente patgenas no permitieron atribuir la causalidad de los sntomas a E. histolytica. La frecuencia observada de E. histolytica 31/204, demuestra el carcter endmico de la amibiasis en esta comunidad. Palabras Clave: Entamoeba histolytica, Entamoeba dispar, Amibiasis, PCR. e-mail: angelitab60@hotmail.com

Bracho Mora, Angela Maria Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar diagnosed by Polymerase Chain Reaction (PCR) and the correlation with the presence of clinical symptoms in Santa Rosa de Agua community Universidad Del Zulia. Facultad Experimental de Ciencias. Divisin de Estudios para Graduados. Maestra de Microbiologa. Maracaibo, Venezuela. 2007. 70 p.

ABSTRACT Entamoeba histolytica (pathogen) and Entamoeba dispar (non pathogen) differential identification it is essential for an appropriate treatment of patients and for epidemical purposes. This study was design with the aim of determining Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar prevalence. For that, a PCR assay, using specific primers for each species was standardized and applied it. 204 stool samples from people of Santa Rosa de Agua community were analyzed through direct exam with SSF (0.85%) and lugol, formol-ether concentrate and PCR. In the microscopic exam, 42 individuals (20.58%) did presented evolutionary forms of the complex Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar; whereas PCR showed 47 positive cases to these amoebas; which 22 were carrying E. histolytica (10.78%), 16 E. dispar (7.84%) and 9 (4.41%) presented a mixed infection. There was not significant difference in the relation of gender and E. histolytica and/or E. dispar presence, neither among ages. There were no cases with these amoebas in the children younger than 2 years. The main clinical discovery was abdominal pain, followed by anal pruritus and diarrhea in the individuals infected with E. histolytica or E. dispar. The high quantity of infected symptomatic individuals with the amoebas and with other pathogen or potentially pathogen species, didn't allow attributing the causality of symptoms to E. histolytica. The frequency observed of E. histolytica 31/204, demonstrates the endemic character of the amibiasis in this community.

Key words: Entamoeba histolytica, Entamoeba dispar, Amibiasis, PCR.

e-mail: angelitab60@hotmail.com

DEDICATORIA A Dios por iluminarme y nuevamente me permite culminar otra meta ms. A mi madre Beatriz por guiarme durante toda la vida, darme su amor y compresin. A mi segunda madre Zulbey Rivero por su orientacin, constancia, apoyo y dedicacin no solo durante la realizacin del proyecto sino a lo largo de mi desarrollo personal y profesional. A mis sobrinos ngel, Bejangela y Mariangela (tesoro) para que les sirva de ejemplo para su vida futura. A mis amigas y colegas Rossalby, Mara Elena y Yessica por su ayuda y apoyo incondicional, las quiero mucho. Y por supuesto a mi padre ngel Bracho, aunque no este conmigo fsicamente siempre lo estar en mis pensamientos y todos mis logros sern dedicados a l.

AGRADECIMIENTOS Al Consejo de Desarrollo Cientfico y Humanstico (CONDES) por el financiamiento otorgado. A la comunidad de Santa Rosa de Agua y al Centro de Educacin Popular (CEP) por permitirnos entrar a estudiar su comunidad. Al Centro de Investigacin Endocrino-Metablicas Dr. Flix Gmez (CIEM), por facilitarnos su espacio fsico para procesar las muestras; en especial a las Lic. Francia Reyes y Lic. Netxibeth Rondn por su desinteresado aporte y colaboracin. A la Dra. Nailet Arraz, por su incondicional dedicacin y excelente orientacin. A la Dra. Haydee Urdaneta del Instituto de Inmunologa Clnica (IIC) de la Universidad de los Andes (ULA); por su generosidad al facilitarnos la cepa control de E. histolytica. A la Dra. Ivonne Qvarnstrom del Centro de Infecciones de Atlanta (CDC); por su generosidad al facilitarnos la cepa control de E. dispar. Al Laboratorio Regional de Referencia Virolgica (LRRV); por su colaboracin a lo largo de la realizacin del trabajo, en especial a los Lic. Ricardo Atencio y Lic. Leticia Porto. A las Profs. Lissete Sandrea, Marinella Calchi, Ellen Acurero, Iris Daz, Glenis Chourio y Adriana Maldonado, por la colaboracin en la recoleccin y procesamiento de las muestras. Al Dr. Gilbert Corzo por su orientacin y realizacin del anlisis estadstico. Y a todas aquellas personas que de una u otra manera ayudaron a la culminacin de este proyecto.

A todos Muchas Gracias!

INTRODUCCIN

INTRODUCCIN Las parasitosis intestinales constituyen un grupo de enfermedades con una alta endemicidad, las cuales comprometen al individuo, a la familia y a la comunidad. Su frecuencia se relaciona con condiciones de insalubridad, tales como, carencia de agua potable, hacinamiento, deficiente saneamiento ambiental, inadecuadas normas higinicas, as como la pobreza extrema, entre otros. Estas condiciones representan los principales factores determinantes en la aparicin de estas enfermedades; es decir, no slo las carencias econmicas, sino las culturales afectan al individuo en su salud. El hombre puede sufrir diversas enfermedades infecciosas, entre las cuales se incluyen las parasitosis intestinales donde los agentes causales son helmintos y protozoarios de hbitat intestinal. Dentro de los protozoarios hay un gran nmero de especies que parasitan al hombre, pero entre los patgenos, uno de los ms conocidos es el productor de la amibiasis. El trmino amibiasis incluye todos los casos humanos de infeccin por Entamoeba histolytica, entendindose como infeccin en este contexto, la simple interaccin hospedero-parsito y no necesariamente la presencia de alteraciones patolgicas como consecuencia de la interaccin en cuestin. Independientemente o no de las manifestaciones clnicas, el que stas se presenten est supeditado a la interaccin entre el parsito, el hospedero y diversas peculiaridades del medio ambiente, ya que dependiendo de la correlacin de fuerzas entre los agentes que intervienen en dicha interaccin, una infeccin amibiana puede permanecer limitada a la luz del intestino (amibiasis asintomtica) o transformarse a corto o largo plazo, en una infeccin que invade la pared y a su vez se constituye en el punto de partida para el desarrollo de diferentes cuadros clnicos en otras partes del cuerpo humano (1). Los primeros estudios sobre esta amiba datan de 1875, en las revisiones efectuadas por Lsch y posteriormente por otros investigadores como Butschlii, Casagrandi, Barbagallo, Councilman, Quicke y Roos. Aunque en principio no fue nombrada como la conocemos actualmente, si se refiri como una especie de amiba patgena. En el ao

1893, Schaudinn estableci las diferencias de esta especie con la de otras amibas que fueron encontradas en personas sanas y concluy denominndola E. histolytica (2). La amibiasis contina siendo un problema de salud pblica significativo a nivel mundial, y representa una de las principales causas de muerte por protozoarios segn la OMS. Esta infeccin es cosmopolita; pero sus mayores prevalencias se reportan en Amrica Central, Amrica del Sur, frica e India. Se ha estimado que 500 millones de individuos son infectados por E. histolytica y de estos, 40 millones desarrollaran la enfermedad invasiva, causando al menos 100,000 muertes por ao, la mayor parte de estas son secundarias a las complicaciones extra-intestinales como el absceso heptico
(3,4)

. La amibiasis intestinal asintomtica constituye la forma ms comn de la infeccin

amibiana, ya que, representa el 90% de los casos. En los pacientes con este tipo de presentacin de la amibiasis, los trofozotos de E. histolytica permanecen en la luz intestinal sobreviviendo como comensales, alimentndose de detritos celulares, sin comprometer la pared del colon
(1,2)

. Estos portadores sanos generalmente eliminan

nicamente quistes, por lo que representan un gran papel desde el punto de vista epidemiolgico, pues son la principal fuente de diseminacin de la infeccin. La ausencia de sntomas en estos individuos se explica porque los parsitos viven en la luz del colon y no invaden mucosa (5). En cuanto a los casos sintomticos, puede dividirse en dos grandes grupos; la amibiasis intestinal sintomtica aguda o crnica, donde se puede presentar: dolor abdominal, clicos, diarrea con o sin sangre, moco y/o pus (disentera), nuseas, vmito y tenesmo. En segundo trmino, se encuentra la amibiasis extraintestinal, donde los trofozotos de la amiba luego de atravesar el intestino se diseminan a otros rganos del cuerpo humano, tales como hgado, pulmn, cerebro, tracto genitourinario, rea perianal y piel en general; y en este caso, las manifestaciones clnicas dependern del rgano afectado por el parsito
(4,6-8)

. Se ha observado que el absceso heptico

amibiano es la presentacin ms comn de la amibiasis extraintestinal (9).

Dentro de la denominada amibiasis intestinal sintomtica, pueden identificarse varias formas clnicas. Los dos sndromes ms importantes causados por la infeccin invasora de E. histolytica son: la colitis amibiana disentrica y la colitis amibiana no disentrica
(2)

. Adems pueden presentarse complicaciones de los cuadros intestinales,

tales como la colitis fulminante llamada tambin colitis gangrenosa, la perforacin intestinal y el ameboma. Otro cuadro de amibiasis intestinal invasora, mucho menos frecuente, es el de apendicitis amibiana citar el Sndrome Hemoltico Urmico (11). Al comienzo de la dcada de los setenta, gracias a los trabajos de Martnez-Palomo y varios grupos de investigadores mexicanos, se identificaron diversas propiedades funcionales del parsito capaces de incrementar su patogenicidad; con base a estas propiedades funcionales se subdividi a la especie E. histolytica en dos tipos: uno con capacidad de inducir enfermedad y otro sin potencialidad patgena
(12) (10)

. Se han reportado casos clnicos

excepcionales como consecuencia de la disentera amibiana, entre los que se puede

. Ms adelante,

gracias a las investigaciones de Sargeaunt, se descubrieron diferencias en el patrn electrofortico isoenzimtico que permitieron subdividir la especie en diversas cepas (zimodemos) y, a su vez, clasificar cada cepa en patgena o no de acuerdo con sus propiedades funcionales (13). Durante los ltimos quince aos E. histolytica se clasific en dos variedades, patgena y no patgena, de acuerdo con el patrn electrofortico de sus enzimas
(14)

sin embargo, es definitivamente en el ao 1997, en el XIII Seminario sobre la Amibiasis en la Ciudad de Mxico, cuando los expertos reconocieron la existencia de dos especies diferentes de Entamoeba: E. histolytica como la especie causante de enfermedad invasiva y extra-intestinal y E. dispar como la especie no patgena
(3)

. La

aceptacin de la existencia de estas dos especies permite aclarar en parte, una gran cantidad de controversias y confusin que se generaron en el tiempo, en cuanto a la relacin parsito-hospedador, pues era notoria la discrepancia entre el nmero de individuos infectados y la baja frecuencia de la enfermedad, que afecta solo al 10% de los parasitados por E. histolytica (15).

Hasta la fecha, no se ha documentado que E. dispar cause colitis o absceso heptico o de algn otro tipo; por tal motivo la colonizacin por E. dispar no necesita ser tratada y afortunadamente es mucho ms comn que la infeccin producida por E. histolytica. Por el contrario, E. histolytica es la responsable de todos los casos referidos de colitis y absceso heptico; as como tambin puede observarse causando una colonizacin asintomtica en muchos individuos
(16)

. E. dispar, nunca es invasiva

en los seres humanos y no se asocia con ningn sntoma gastrointestinal, incluso en pacientes homosexuales infectados con el Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH). En estos pacientes, la infeccin con E. dispar es bastante frecuente y ha sido imposible hallar manifestaciones histopatolgicas de enfermedad causada por este protozoario
(17)

. La aceptacin de la existencia de E. dispar cambia drsticamente la epidemiologa

de la amibiasis y conlleva a que las estimaciones sobre la prevalencia de E. histolytica a nivel mundial sean reinterpretadas. Al considerar las apreciaciones de la OMS, donde el 10% de la poblacin mundial estara infectada por E. histolytica, podra predecirse que 500 millones de personas en el mundo se infectan anualmente (donde solamente el 10% de los parasitados desarrolla la enfermedad)
(18)

. A la luz de la existencia de dos

especies dentro de los que clsicamente se conoca como E. histolytica, se puede estimar que el 90% de esos 500 millones de personas, podran estar infectados por E. dispar y el restante 10% verdaderamente por E. histolytica, donde solo uno de cada diez desarrolla la enfermedad
(19-21)

. De modo tal, que la prevalencia de Amibiasis se

reducir fundamentalmente, cuando se puedan efectuar tcnicas discriminatorias de ambas especies a todo paciente sospechoso. Esta deteccin especfica de E. histolytica producir una disminucin de tratamientos anti-amibianos innecesarios (15). La amibiasis intestinal debe diferenciarse clnicamente de muchas enfermedades que presentan sintomatologa semejante, en especial de otras enfermedades infecciosas que producen diarrea; sobre todo en caso de existir disentera, debe descartarse la disentera bacilar o Shigelosis. Esta ltima, se presenta con mayor frecuencia que la disentera amibiana y lleva ms rpidamente al paciente a la deshidratacin. El estudio microscpico de las materias fecales define el diagnstico, al demostrar la presencia de trofozotos en la disentera amibiana o la abundancia de

leucocitos macrfagos en la Shigelosis, en la cual el coprocultivo confirma el agente etiolgico (5). El diagnstico clnico de amibiasis se confirma mediante examen coprolgico, generalmente con la observacin microscpica de quistes y/o trofozotos caractersticos en las heces o con menos frecuencia la biopsia de tejido mucoso
(22)

. Sin embargo, el

examen microscpico del material fecal tiene varias limitaciones, la ms importante de ellas es la incapacidad de distinguir E. histolytica y E. dispar debido a que son morfolgicamente idnticas. Adems, en nuestro continente es muy comn el poliparasitismo a expensa de varios protozoarios, por lo que, en las muestras fecales es frecuente encontrar la presencia de quistes de otras especies de amibas comensales tales como: Entamoeba coli, Entamoeba hartmanni, Iodamoeba butschlii o Endolimax nana, que requieren de la visualizacin por parte de un personal bien entrenado para un diagnstico preciso. En Venezuela, como en otros pases en va de desarrollo, las infecciones intestinales parasitarias presentan prevalencias superiores al 50% y son en la mayora de los casos infecciones mixtas. Este hecho trae una gran complejidad al estudio de las infecciones intestinales parasitarias, en particular al estudio de la infeccin y la enfermedad debido a E. histolytica y E. dispar (23). A travs del examen microscpico habitual, solo puede confirmarse la presencia de E. histolytica cuando la muestra presenta trofozotos hematfagos (24). La epidemiologa de Entamoeba puede ser estudiada cultivando sus trofozotos y ejecutando tcnicas de anlisis de isoenzimas; pero stas son laboriosas, costosas y consumen mucho tiempo, por lo que no son practicadas de rutina por laboratorios de diagnstico. La deteccin de anticuerpos contra amibas en suero de paciente ha sido reportada como una buena herramienta para el diagnstico de la infeccin por E. histolytica, sobre todo en los casos de amibiasis extraintestinal. Sin embargo, con los test serolgicos, se hace dificil distinguir infecciones pasadas de recientes en individuos que emigren o residan en reas endmicas (17). Las limitaciones del examen microscpico, de manera particular los falsos diagnsticos de amibiasis que frecuentemente se generan y la imposibilidad de discriminar entre infeccin por E. histolytica e infeccin por E. dispar, han conducido al

desarrollo de procedimientos que permitan la deteccin de ciertos componentes de la especie amibiana presente (24). En los principios de la dcada de los noventa, se desarrollaron las primeras aproximaciones en los procedimientos para la deteccin de componentes antignicos de E. histolytica. Estas fueron realizadas con el empleo de anticuerpos policlonales, los cuales son sueros de pacientes con alguna forma de amibiasis invasiva o antisueros anti- E. histolytica obtenidos en animales de experimentacin (25). En 1992, se report el desarrollo de un ensayo inmunoenzimtico para la deteccin en heces de histolisaina, proteasa excretada por E. histolytica y E. dispar
(26)

. Este

procedimiento, denominado ENZYMEBA, tiene la particularidad de que el propio parsito aporta la enzima que detecta su presencia, a diferencia de los sistemas inmunoenzimticos (ELISA) clsicos, no se requiere de un segundo anticuerpo conjugado a una enzima reveladora. ENZYMEBA, aunque permite demostrar la infeccin amibiana con el examen de una sola muestra por paciente, no distingue entre infecciones por E. histolytica y E. dispar. Por lo cual su mayor utilidad sera en la discriminacin de la presencia del complejo E. histolytica y E. dispar del resto de las amibas. En relacin a la deteccin de antgenos de estas amibas, pueden ser utilizados anticuerpos monoclonales (MAb) dirigidos contra la lectina de adherencia, inhibible por galactosa y N-acetylgalactosamina, para distinguir entre E. histolytica y E. dispar
(27,28)

. Los anticuerpos monoclonales dirigidos a epitopes 1 y 2 se unen a lectinas de

ambas especies (estos detectan la presencia de cualquiera de las dos o ambas), este kit se denomina Entamoeba Test; mientras anticuerpos monoclonales contra los epitopes 3 al 6 reconocen solo la lectina de E. histolytica. Usando anticuerpos antilectina policlonales para capturar la lectina, es posible detectar especficamente a E. histolytica en las heces de pacientes con disentera amibiana. Este es el fundamento de la tcnica inmunoenzimatica disponible comercialmente con el nombre de E. histolytica II Test
(29)

. Este procedimiento permite identificar especficamente a E.

histolytica, pero no reconoce a E. dispar.

Recientemente ha sido posible identificar estas especies, mediante mtodos ms sensibles basados en la deteccin del ADN amibiano en las heces, valindose de las innumerables ventajas de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y otras tcnicas de biologa molecular que no solo son sensibles y simples, sino tambin fcilmente reproducible y rpidas
(1,30)

. Partiendo de un adecuado diagnstico realizado

por personal especializado, cabe destacar la gran importancia de distinguir entre ambas especies debido a que esto permite una aplicacin correcta del tratamiento y a su vez evitar la diseminacin de las formas evolutivas infectantes por parte de los portadores asintomticos. En la ltima dcada ha sido posible demostrar que los antgenos de superficie de las cepas patgenas son diferentes de los de las cepas no patgenas y que igualmente existen secuencias en el ADN especficas de especies que facilitan los estudios epidemiolgicos mediante la reaccin en cadena de la polimerasa, lo que tambin permiten establecer esta diferencia (30). La diferenciacin de las especies E. histolytica y E. dispar, mediante caracterizacin molecular durante la dcada pasada del siglo XX, condujo a una reconsideracin sobre la epidemiologa de la amibiasis, con relacin a la prevalencia y morbilidad de las infecciones en la poblacin mundial particularmente en aquellas regiones geogrficas con altas tasas endmicas (23). En la bsqueda de la prevalencia real de E. histolytica diversos investigadores a nivel mundial han realizado varios estudios de prevalencia y diferenciacin de ambas especies, utilizando tcnicas moleculares. En el ao 1996 se report, una tcnica de reaccin en cadena de polimerasa mltiplex utilizando oligonucletidos dirigidos a secuencias de elementos extra-cromosomales P145 de E. histolytica y B133 de E. dispar
(26)

. De los 52 pacientes diagnosticados a travs del examen microscpico y

ENZYMEBA, con el complejo Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar, 49 fueron positivos mediante PCR (49/52) y de ellos, 36 (75,5%) mostraron infeccin por E. dispar, mientras 24,5% (13), presentaron infeccin mixta por E. histolytica y E. dispar se reporto una especificidad de 100% y una sensibilidad de 94%, para el ensayo de PCR.

Por otro lado, un estudio realizado en Bangladesh, donde se analizaron 98 muestras de heces a travs de varias tcnicas, reportaron que mediante la Reaccin en Cadena de Polimerasa (PCR) utilizando tcnicas de amplificacin de genes de ARN ribosomal, se obtuvo un 12,2% de prevalencia de coinfeccin E. histolytica/E. dispar, 22,4% de E. dispar y 46,9% de E. histolytica (31). Para el ao 2000 en Grecia, Evangelopoulos y cols.
(32)

, utilizaron tres mtodos

(microscopa, ELISA y PCR) para determinar la prevalencia de las amibas en una poblacin de 322 individuos. A travs de la tcnica de PCR anidado utilizando primers especficos de fragmentos de 427 pb (E. histolytica) y 195 pb (E. dispar); 27 individuos con E. dispar (8,4%) y solo 1 E. histolytica (0,3%). Snchez-Guillen y cols. estudiaron 47 pacientes en una regin de Mxico (2002), con variantes clnicas de amibiasis, entre estas; amibiasis intestinal aguda (AIA), amibiasis intestinal crnica (AIC) y pacientes asintomticos (AS), incluyendo un grupo control; para determinar la presencia de E. histolytica y E. dispar mediante PCR colorimtrico (PCR-SHELA). De los 11 pacientes con (AIA): 7 tenan E. histolytica, 2 E. dispar y 2 fueron negativos; en los 13 casos con (AIC) 9 tenan E. dispar y 4 fueron negativos. De los 13 con (AS) 2 tenan E. histolytica, 9 tenan E. dispar y 2 fueron negativos (33). Gonin y Trudel (34), determinaron a travs de tcnicas de microscopa, ELISA y PCR, la prevalencia amibiana en un total de 95 muestras en Canad durante el ao 2003. Mediante la tcnica de PCR se obtuvieron 2 muestras positivas para E. histolytica, 66 para E. dispar y 27 negativas para ambas amibas. Confirmndose as que la infeccin por E. dispar es significativamente mayor a la de E. histolytica. Pinheiro y cols., (2004) realizaron un estudio en Brasil, donde la prevalencia fue establecida usando kits de deteccin de antgeno para E. histolytica y mediante tcnicas de PCR. Por ensayo inmunoenzimatico todas las muestras fueron negativas para la presencia de adhesina especfica de E. histolytica, mientras que de las 31 muestras analizadas a travs del PCR, 23 fueron positivas para E. dispar (74.19%) y no se observ amplificacin de E. histolytica (35).

Para el ao 2005; Ramos y cols. analizaron 290 muestras de heces en una comunidad rural de Mxico, a travs de la tcnica de PCR; donde 33 (11,4%) fueron positivas para E. histolytica; mientras que 21 (7,2%) fueron positivas para E. dispar y ambas especies de Entamoeba fueron detectadas en 7 muestras (2,4%) (36). Para el mismo ao Qvarnstrom y cols. realizaron un estudio en los Estados Unidos en pacientes sospechosos de amibiasis, los cuales eran civiles con historia de haber viajado fuera de E. U., inmigrantes y refugiados. De un total de 38 muestras analizadas por PCR convencional, usando los oligonucletidos dirigidos al gen de la sub-unidad ribosmica menor, (29 de heces y 9 de absceso heptico), 10 fueron positivas para E. histolytica (4 de aspirado heptico y 6 de heces), 16 heces para E. dispar y 1 para ambas especies (37). A pesar de la sensibilidad y especificidad del PCR convencional, algunos investigadores han estudiado la utilidad de la realizacin de tcnicas de PCR en tiempo real para el diagnstico de la amibiasis. Blessman y cols. (2002), realizaron un estudio de comparacin de PCR en tiempo real con microscopa y serologa en un total de 491 individuos. La tcnica de PCR fue significativamente ms sensible que microscopa o cultivo. Adems, observaron que todas las muestras positivas por microscopa, 22/25 (88%) de las muestras positivas por cultivo fueron tambin positivas por PCR. Por otro lado, esta tcnica revel un nmero adicional de casos de infeccin por E. histolytica y E. dispar que los otros mtodos no haban detectado (38). Recientemente en el 2006; Calderaro y cols, estudiaron 40 muestras a travs de PCR tradicional y PCR en tiempo real encontrando 6 pacientes positivos (5,5%) para E. histolytica, y 9 pacientes positivos (8,3%) para E. dispar por ambos ensayos. Aunque ambos mtodos presentaron sensibilidades y especificidades similares, el PCR en tiempo real presenta las siguientes ventajas: menos laborioso, se realiza en un sistema cerrado y se obtienen los resultados en 3 horas, en comparacin al PCR tradicional
(39)

sin embargo el equipo y los reactivos son muy costosos lo cual limita su uso generalizado. As mismo, Visser L y cols.; evaluaron a 283 pacientes a travs de examen de heces directo, concentrado, deteccin de antgenos en heces, PCR en

tiempo real y Serologa utilizando al PCR en tiempo real como la tcnica de referencia, obteniendo 19 pacientes (6,7%) con E. histolytica y 258 (91,2%) con E. dispar (40). En nuestro pas se efectu un estudio molecular y epidemiolgico de Entamoeba histolytica y Entamoeba dispar en pacientes con diarrea mediante la tcnica PCR anidado, en el cual se obtuvo una prevalencia de 6,31% para E. histolytica y un 4,44% para E. dispar
(41)

. A nivel regional, hasta ahora no se han descrito estudios

epidemiolgicos con estas tcnicas moleculares de alto poder discriminatorio; sin embargo, por medio de tcnicas convencionales como microscopa se han encontrado elevadas prevalencias del complejo E. histolytica/E. dispar. Rivero y cols., (2001) estudiaron la prevalencia de parsitos intestinales en escolares de 5 a 10 aos de un instituto del municipio Maracaibo, Edo. Zulia Venezuela y observaron mediante el examen microscpico, que el 15,7% de los escolares presentaban el complejo E. histolytica/E. dispar en sus heces
(42)

. Mora y cols., (2005)

determinaron en el estado Sucre la prevalencia del complejo E. histolytica/E. dispar, en pacientes son sntomas gastrointestinales, encontrando en un total de 400 personas estudiadas, 64 pacientes (16%) con el complejo E. histolytica/E. dispar
(43)

. Daz y

cols. (2006), al estudiar una comunidad indgena del Edo. Zulia, encontraron 20 muestras positivas (21,98%) para el complejo E. histolytica/E. dispar, de un total de 91 individuos de la etnia Yukpa (44). Para distinguir entre ambas especies de amibas se hace necesaria la utilizacin de tcnicas especiales; pero lamentablemente las deficientes infraestructuras y bajos presupuestos limitan la aplicacin de dichas tcnicas con propsitos de rutina en los laboratorios pblicos. Esta dificultad ha impedido establecer la verdadera prevalencia de la amibiasis en nuestra regin, situacin que debe ser esclarecida, ya que, segn reportes del anuario epidemiolgico del Edo. Zulia ao 2001
(45)

, se seala a la
(46)

Amibiasis dentro de las 25 principales causas de morbilidad en varios municipios de este Estado. Por otro lado, es importante destacar que para el ao 2005 , la mortalidad por amibiasis a nivel nacional fue de 114 individuos. Por ello, es indispensable la realizacin de estudios que permitan determinar la verdadera prevalencia de E. histolytica, y a su vez relacionarlo con la presencia o no de

manifestaciones clnicas, para la aplicacin de un tratamiento adecuado y oportuno, lo cual podra contribuir a una disminucin de la morbi-mortalidad por E. histolytica y de la propagacin del patgeno. OBJETIVO GENERAL Diagnosticar E. histolytica y E. dispar mediante la tcnica de Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) y su correlacin con la presencia o no de manifestaciones clnicas.

OBJETIVOS ESPECFICOS Determinar la prevalencia de E. histolytica y E. dispar. Identificar las manifestaciones clnicas asociadas a la presencia de cada una de las especies. Correlacionar las manifestaciones clnicas con la presencia de cada una de las especies.

MATERIALES Y MTODOS

MATERIALES Y MTODOS 1.- Tipo de Investigacin Se realiz una investigacin descriptiva, que segn Sabino (1992) (47) es aquella que describe fenmenos o situaciones y cuya preocupacin primordial radica en describir algunas caractersticas fundamentales de conjuntos homogneos de fenmenos, utilizando criterios sistemticos que pone de manifiesto su estructura o comportamiento. 2.- Diseo de la Investigacin Se efectu un diseo no experimental, que de acuerdo a Hernndez y cols. (1991)
(48)

; es aquel que se realiza sin manipular deliberadamente variables, es decir, donde no

se modifican intencionalmente las variables independientes, lo que se hace es observar fenmenos tal y como se dan en su contexto natural, para despus analizarlos. 3.- Poblacin de estudio El estudio fue realizado en el periodo de Enero a Julio de 2006, en la comunidad de Santa Rosa de Agua del Municipio Maracaibo, parroquia Coquivacoa, Estado Zulia (Anexo N 1). Santa Rosa se ubica en la regin Nor-este del municipio; dicha comunidad est dividida geogrficamente en dos reas: tierra y agua, esto significa que algunas viviendas estn construidas sobre tierra firme y otras sobre el agua (palafitos). La poblacin total de Santa Rosa, segn el ltimo censo efectuado en el ao 2001, era de 6.516 habitantes
(49)

. La comunidad combina actividades econmicas

tradicionales como la pesca artesanal, la siembra, la cestera y la construccin de embarcaciones con actividades tursticas. El paisajismo y la arquitectura del lugar, aunados a la cocina tpica son elementos de gran potencial turstico. Con el paso del tiempo la poblacin ha construido su hbitat sobre el relleno; pero conservando el palafito en zona lacustre como elemento representativo de su espacio habitable. Se trata de viviendas auto-construidas realizadas con materiales propios de la regin, que presentan en la actualidad un nivel de deterioro importante. A la poblacin de Santa Rosa de Agua se le puede caracterizar tambin por su pobreza, materializada en la deficiencia e insuficiencia de servicios, redes e infraestructura, equipamiento y viviendas. Otros factores de carcter social implcitos son, el limitado acceso de la

poblacin a los servicios educativos y de salud, desempleo, hacinamiento, inseguridad y desnutricin infantil, entre otros. A lo que habra que agregar, la contaminacin de sus espacios acuferos, que representan un problema creciente de salud publica para quien vive en permanente simbiosis con el agua del lago de Maracaibo (Anexo N 2) (49). Se seleccionaron para el estudio dos sectores de viviendas construidas sobre agua (palafitos) que presentaban las peores condiciones higinico-sanitarias de toda la comunidad de Santa Rosa de Agua. Estos sectores son conocidos como Brisas del Lago y Manaure (Anexo N 3). 4.- Sujetos de estudio Santa Rosa es una comunidad organizada, posee el Centro de Educacin Popular Jess Rosario Ortega (CEP), una edificacin propia que incluye emisora de radio comunitaria, comedor, biblioteca, consultorio, laboratorio y sala de computacin. Los promotores sanitarios formados en dicho centro, participaron en el proceso de informacin a la comunidad y bsqueda de los individuos que participaran en el proyecto. Como criterio de inclusin se exigi el no haber ingerido medicamentos antiparasitarios seis meses antes de la toma de la muestra. Una vez realizada la campaa informativa, a los representantes de cada familia se les solicit su consentimiento por escrito para participar en el estudio, mediante la firma de un instrumento que haca de su conocimiento la naturaleza y fines de la investigacin (Anexo N 4). El grupo de estudio incluy 204 individuos de ambos sexos y todas las edades. Los individuos fueron estratificados por grupos etarios, de la siguiente manera: RECIN NACIDO: 1-28 das, LACTANTE MENOR: 1-11 meses, LACTANTE MAYOR: 12-23 meses, PREESCOLAR: 2 -6 aos, ESCOLAR: 7-12 aos, ADOLESCENTES: 1319 aos, ADULTO JOVEN: 20-39 aos, ADULTO MEDIO: 40-64 aos, ADULTO MAYOR: 65 aos
(50)

. Posteriormente al estudio los individuos parasitados recibieron

tratamiento antihelmntico en forma gratuita.

5.- Diseo de Experimento 5.1.- Anlisis Parasitolgico Muestras Se recolect un espcimen fecal por individuo, quienes fueron escogidos aleatoriamente entre las familias de la comunidad. A cada individuo se le entreg un envase recolector plstico nuevo, limpio, de boca ancha y tapa de rosca y se les explic las recomendaciones necesarias para la correcta recoleccin de la muestra fecal. Las muestras fueron enviadas al Laboratorio de Parasitologa de la Escuela de Bioanlisis de la Universidad del Zulia para su procesamiento. A cada muestra se le realiz dos mtodos copro-parasitolgicos: Examen macroscpico y microscpico de las heces con solucin salina y lugol para evidenciar la presencia de las diferentes formas evolutivas de los parsitos, y concentrado de heces con formol-ter molecular (PCR) para la deteccin de E. histolytica y E. dispar. 5.2.- Anlisis de Biologa Molecular 5.2.1.- Materiales Cepas utilizadas Se utilizaron cultivos de cepas de referencia de Entamoeba histolytica IULA:1092:1 (MMM). El ADN genmico extrado de esta cepa de referencia fue utilizado como controles positivos en todos los anlisis. Oligonucletidos utilizados Para la amplificacin de secuencias del genoma de Entamoeba histolytica y Entamoeba dispar, se utilizaron dos pares de oligonucletidos dirigidos a la secuencia del gen SREHP, cuya especificidad ha sido reportada previamente
(36) (51)

(Anexo

N 5). El resto de la muestra fue congelada para efectuar posteriormente el anlisis

. El gen SREHP
(52)

codifica para una protena antignica rica en serina en ambas especies

y la

identidad de los oligonucletidos utilizados fue confirmada por alineamiento de sus secuencias utilizando el programa Blast y las Bases de Datos del Centro Nacional de Informacin Biotecnolgica de EEUU (NCBI)
(53,54)

. En la Tabla N I se muestra el

nombre, la secuencia de los oligonucletidos utilizados, el cdigo de acceso de la secuencia a la base de datos y el producto esperado de la amplificacin para cada par

de oligonucletidos. Los oligonucletidos fueron sintetizados por Maxim Biotech, INC. USA. Tabla N I. Oligonucletidos utilizados Nombre del oligoNT SRPEh5 SRPEh3 SRPEd5 SRPEd3
Descripcin Tamao del producto de PCR

Secuencia de nucletidos

Cdigo de acceso

5 CCT GAA AAG CTT GAA GAA GCT G 3 5 AAC AAT GAA TGG ACT TGA TGC A 3 5 GTA GTT CAT CAA ACA CAG GTG A 3 5 CAA TAG CCA TAA TGA AAG CAA 3

GEN SREHP de E. histolytica (AB253474) GEN SREHP de E. dispar (AB253482)

553 pb

567 pb

Enzimas y otros reactivos Para el procedimiento de extraccin y purificacin de cidos nucleicos se utiliz la enzima proteinasa K (Promega), detergente Bromuro de Cetiltrimetilamonio (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide CTAB) de Sigma. Para las reacciones de amplificacin por PCR se utiliz Go Taq DNA polimerasa (5 u/l) (Promega). Otros reactivos de uso frecuente, tales como Tris-base, EDTA, dodecil sulfato de sodio (SDS), agarosa, etc, fueron obtenidos de diferentes casas proveedoras (Sigma, Biorad, Promega). 5.2.2.- Mtodos Extraccin y purificacin de ADN genmico de Entamoeba sp. La extraccin de ADN genmico de Entamoeba sp. a partir de muestras de heces, se llev a cabo a travs de un procedimiento estandarizado en el laboratorio que incorpor algunos pasos de protocolos de lisis enzimtica, choque trmico y mecnico, descritos previamente
(26,36,55)

. Se transfiri aproximadamente 0,5 a 0,7 gramos de

heces a un tubo eppendorf de 2 ml, se resuspendi en 1 ml de buffer fosfato salino (PBS: 0,1M Na2HPO4, 0,1M NaH2PO4, pH 7,5) y se filtr a travs de gasa estril. El homogeneizado fue centrifugado a 10.000 rpm y el sedimento resultante fue lavado 3 veces con 1,5 ml de buffer PBS para eliminar contaminantes solubles. El sedimento resultante se lav con 1 ml de NaCl 0,15 M tres veces o hasta que el sobrenadante qued claro. El sedimento se resuspendi en 600 l de buffer de lisis (Tris-Cl 100mM

pH 8, 25mM EDTA, 0,25% SDS) y se someti a 5 ciclos de congelacin-descongelacin incubando el tubo en hielo seco-etanol por 5 min. y descongelando a 37C por tres minutos. Despus del ltimo tratamiento, se agreg 10 l de proteinasa K de 20 mg/ml. y se incub a 55C durante toda la noche. Se agreg 60 l de CTAB-NaCl (0,7M NaCl, 1% CTAB) y se incub a 65C por 1 hora. Se hizo una extraccin con 500 l de cloroformo, luego con fenol-cloroformo y cloroformo. Se recuper la fase acuosa en otro tubo eppendorf y el ADN se precipit con 600 l de isopropanol incubndolo a temperatura ambiente por 45 min. y luego centrifugando por 30 min. a 14.000 rpm. El sedimento se resuspendi en 50 l de buffer TE. Se utiliz 10 l de la muestra para ensayos de amplificacin. El mismo tratamiento fue seguido para la extraccin de ADN genmico a partir de cultivos de E. histolytica. En estos casos se utiliz 2,5 l de ADN para los ensayos de amplificacin por PCR. Ensayos de amplificacin por PCR Se prepar una mezcla de reaccin para un volumen final de 50 l, consistiendo en 10 l de buffer Go taq DNA polimerasa 10X (Promega), 2,5 mM MgCl2, 200M cada desoxirribonucletido (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), 1 l de cada oligonucletido (primers) 50M (1 M cada oligonucletido). Se utiliz 0,5 l de Taq DNA polimerasa 5U/l para cada reaccin. Esta mezcla de reaccin se utiliz para amplificacin por PCR de secuencias del gen SREHP tanto de E. histolytica, como de E. dispar, incluyendo los oligonucletidos especficos para cada reaccin. Para los oligonucletidos SRPEh5/3, especficos de E. histolytica se ensay temperatura de alineamiento de 67C, de acuerdo a protocolo previamente reportado
(38)

, sin embargo ante la falla en la amplificacin, se baj gradualmente la temperatura alineamiento. El programa definitivo de amplificacin consisti en una

hasta obtener el producto esperado, por lo cual se seleccion 64C como temperatura de desnaturalizacin inicial de 10 minutos a 96C y 35 ciclos de amplificacin de 1 minuto a 94C (desnaturalizacin), 1,5 minutos a 64C (alineamiento de los oligonucletidos) y 2 minutos a 72C (polimerizacin). Se incluy un paso final de extensin a 72C por 8 minutos.

Para los oligonucletidos SRPEd5/3, especficos de E. dispar, igualmente se disminuy gradualmente la temperatura de alineamiento desde 64C del protocolo inicial
(36)

hasta 60C. Se utiliz un programa equivalente al anterior (SRPEh5/3), pero

cambiando la temperatura de alineamiento de los oligonucletidos a 60C. Posteriormente se ensayaron condiciones para amplificacin simultnea en una nica reaccin con ambos pares de oligonucletidos, ensayando temperaturas de alineamiento desde 54C hasta 60C, pero aparecieron mltiples bandas inespecficas o fallaba la amplificacin, por lo cual se sigui el anlisis con reacciones individuales. En todos los ensayos se incluyeron controles negativos y positivos. Como control negativo, se utiliz la mezcla de reaccin sin el ADN blanco y como controles positivos se utiliz el ADN extrado a partir del cultivo de E. histolytica (MMM) donado por la Dra. Haydee Urdaneta del Instituto Inmunologa Clnica Dr. Luis Pasteur de la Universidad de los Andes, Edo. Mrida, Venezuela. Como control positivo de E. dispar se utiliz ADN genmico (extrado de heces), donado por la Dra. Ivonne Qvarnstrom de la Division of Parasitic Diseases, Nacional Center for Infectious Diseases, Center for Disease Control and Prevention, Public Health Service, U.S. Department of Health and Human Services, Atlanta, Georgia. La preparacin de las mezclas de PCR se llevaron a cabo en un rea de trabajo estril y para las reacciones de amplificacin se utiliz un termociclador MJ Research PTC-100 (Anexo N 6). Electroforesis horizontal en geles de agarosa Los productos de PCR se separaron en geles de agarosa en cmaras horizontales (BIORAD). La concentracin de agarosa utilizada fue de 1 %. Como Buffer de corrida se utiliz TBE (Tris-Borato 89mM, EDTA 2mM pH 8). La corrida se llev a cabo a 40v/cm por 2 - 3 horas. Los geles fueron teidos con bromuro de etidio, visualizados en transiluminador ultravioleta y fotografiados con sistema de fotodocumentacin DigiDoc UVP. Se incluy marcador de peso molecular 100bp DNA Ladder de PROMEGA (Figura N 1).

Figura N 1. Marcador de Peso Molecular.

5.3.- Evaluacin Clnica Se elabor una ficha personal, Encuesta Clnica (Anexo N 7), de todos los individuos que fueron evaluados mediante examen fsico, por un Mdico Parasitlogo. Esta encuesta incluy, nmero de identificacin, nombre, direccin, edad, sexo, peso, talla y presencia o ausencia de signos y sntomas gastrointestinales de los individuos estudiados, al momento de la toma de las muestras (Anexo N 8). 6.- Anlisis Estadstico El anlisis de los datos se efectu a travs de la estadstica descriptiva, empleando valores absolutos y porcentajes, para lo cual se elaboraron Cuadros, Tablas y Figuras, de los datos obtenidos en los resultados. Se utiliz para el anlisis el paquete estadstico Statgraphics Plus versin 5.1 para Windows, Professional Edition, Statistical Graphics Corp. 2001. Para analizar las prevalencias de E. histolytica y E. dispar se calcul la diferencia de porcentajes, mediante la prueba Z. En la determinacin de asociacin entre las tcnicas efectuadas se utiliz Ji cuadrado y Tau de Goodman y Kruskal. La relacin entre las variables edad, sexo y prevalencia lpsica de E.

histolytica y E. dispar se determin mediante el estadstico Ji cuadrado de Pearson (X2). Adems, se estableci la correlacin entre la presencia de E. histolytica y hallazgos clnicos presentados por los individuos infectados, segn Ji cuadrado. Un valor de p<0.05 fue considerado como el nivel crtico de significacin (56).

RESULTADOS Y DISCUSIN

RESULTADOS Y DISCUSIN A travs de este estudio, se determin la prevalencia de E. histolytica y E. dispar en una poblacin del municipio Maracaibo. Se detect un elevado nmero de individuos parasitados 177/204 (86,77%) a travs de los mtodos coproparasitolgicos empleados, predominando los protozoarios sobre los helmintos, tal como puede apreciarse en la Tabla II. El elevado porcentaje de protozoarios observado, indica una intensa transmisin oral-fecal entre las personas que conviven en esta comunidad. As mismo se aprecia que de los 204 individuos estudiados 42 (20,58%) presentaron formas evolutivas del complejo E. histolytica/E. dispar al examen microscpico. Otros estudios realizados en comunidades indgenas e instituciones educativas del estado Zulia reflejan valores similares, que oscilan entre 7,3% y 27% presencia de E. histolytica mediante este procedimiento (34,61). Tabla II Especies parasitarias identificadas en las muestras de heces por microscopa.* Especies Parasitarias Blastocystis hominis Entamoeba coli Protozoarios
Complejo E. histolytica/E. dispar
(42,44,57-60)

. No se

observaron trofozotos hematfagos, por lo que en ningn caso pudo concluirse la

N 110 43 42 40 26 7 4 3 88 72 10 5 4 1

% 53,92 21,08 20,58 19,61 12,75 3,43 1,96 1,47 43,14 35,29 4,90 2,45 1,96 0,49

Giardia lamblia Endolimax nana Chilomastix mesnili Iodamoeba butschlii Pentatrichomonas hominis Trichuris trichiura Ascaris lumbricoides Hymenolepis nana Strongyloides stercoralis Enterobius vermicularis Ancylostomideos

*Incluidas las asociaciones parasitarias

Helmintos

El reconocimiento de E. histolytica como especie patgena y E. dispar como especie no-patgena, y su clasificacin como especies separadas pero microscpicamente indistinguibles, han inducido a la Organizacin Mundial de la Salud a recomendar el desarrollo y aplicacin de mtodos especficos para el diagnstico de E. histolytica
(61)

. Este estudio, permiti estandarizar una metodologa aplicable en

nuestro medio, basada en la amplificacin por PCR de secuencias del gen SRPEh especficas del genoma de E. histolytica y E. dispar permitiendo la discriminacin entre ambas especies. En la Fig. 2, se muestran resultados de ensayos de amplificacin de algunas muestras donde pueden observarse los productos de PCR de 553pb (SRPEh 5/3), especficos de E. histolytica y de 567 pb especficos de E. dispar (SRPEd 5/3). Igualmente se observa una muestra en la cual fue detectado el genoma de ambas especies (carril 7).

Fig. 2. Identificacin por PCR de E. histolytica y E. dispar. M- Marcador de peso molecular 1- Control de referencia de E. histolytica MMM (control +); 2- Control de referencia de E. dispar; 3 a 17- ADN extrado de muestras de heces de pacientes. Arriba amplificacin por PCR utilizando oligonucletidos SRPEh 5/3 (especficos de de E. histolytica). Abajo productos de amplificacin obtenidos utilizando oligonucletidos SRPEd 5/3 (especficos de E. dispar).

Diversas publicaciones han reseado al PCR como el mtodo ms sensible y especfico para el diagnstico de la amibiasis
(32,38,62-64)

y lo han propuesto como la

prueba de oro para determinar esta infeccin. Consistente con datos reportados por diversos estudios, en esta investigacin se demostr la alta sensibilidad de las tcnicas de amplificacin, detectndose el genoma del complejo E. histolytica y E. dispar en muestras que fueron negativas por microscopa. Se determin diferencia significativa entre la tcnica de PCR y el examen microscpico (p<0,01), lo que confirma la importancia que el PCR tiene en el diagnstico definitivo de la amibiasis (Tabla III). La tcnica de PCR descrita aqu, demostr una segura deteccin y diferenciacin de las dos especies que componen el complejo E. histolytica/E. dispar, mediante la extraccin del ADN directamente de las muestras fecales sin efectuar cultivos previos. El mtodo de PCR fue capaz de detectar 6 muestras que no mostraron formas evolutivas del complejo al examen microscpico. Se identific E. histolytica en 5 muestras en las cuales se haba observado protozoarios diferentes al complejo y 1 que estaba sin protozoarios. Se detect el genoma de E. histolytica (3) y de E. dispar (2). Esto podra explicarse por una escasa cantidad de formas evolutivas del parsito en las muestras que no fueron visibles al examen microscpico pero si suficiente para deteccin de material gentico por ensayos de amplificacin de ADN. As mismo una muestra que haba sido considerada positiva por examen microscpico, no amplific para ninguna de las amibas mediante PCR. En este caso, la falla en la deteccin no puede ser atribuida a la reaccin de amplificacin, sino posiblemente a una mala calidad de muestra o la presencia de sustancias inhibitorias de la reaccin. La superioridad del diagnstico por biologa molecular radica en que, el PCR al detectar el ADN, no depende de la viabilidad del parsito para realizar el diagnstico, mientras que el examen microscpico si lo hace; adems la identificacin de las amibas depende de las habilidades y experiencia del personal que realiza el examen microscpico. La diferenciacin de especies por PCR es una herramienta necesaria y de gran valor para el diagnstico de la amibiasis, pues le permite al clnico discriminar las verdaderas infecciones por E. histolytica y evitar los tratamientos innecesarios cuando E. dispar esta presente (41).

Para determinar la asociacin existente entre el examen microscpico y la tcnica de PCR, se efectu la prueba de Tau y Kruskal, cuyos valores demuestran que existe una satisfactoria asociacin entre los resultados obtenidos mediante el examen al fresco y la tcnica de PCR. Esto significa que el examen microscpico, cuando es realizado por personal experto, puede ser un examen de descarte primario que requiere en todo caso de un examen confirmatorio que discrimine entre E. histolytica y E. dispar (PCR). Es importante destacar que la microscopa debe ser realizada por personal con experiencia, ya que, existen muchos artefactos y otras amibas similares que pueden ser errneamente diagnosticadas como formas evolutivas del complejo E. histolytica/E. dispar (34) Tabla III Comparacin de los resultados obtenidos mediante Microscopia y PCR.

Anlisis de PCR Microscopia E. histolytica Complejo E. histolytica/ E. dispar Otro protozoario Sin protozoarios Total 42 138 24 18 3 1 E. dispar 14 2 0 Infeccin mixta E. h y E. d 9 0 0 Negativas 1 133 23

204

22

16

157

Ji cuadrado (2)= 167,3324 p=0,00001 (Significativo) Tau de Goodman y Kruskal: Filas vs. Columnas= 0,5034* Columnas vs. Filas= 0,483* Los resultados del ensayo de PCR aplicada a los individuos estudiados se muestran en el Tabla IV. La especie E. histolytica fue detectada en 22 de 204 muestras fecales (10,78%), E. dispar fue observada en 16 muestras (7,84%) y ambas especies de

Entamoeba fueron detectadas en 9 muestras (4,41%). La prevalencia total de infeccin por E. histolytica [(Eh+(Eh+Ed)] en la comunidad estudiada, 31 casos (15,19%) fue mayor que la infeccin por E. dispar [(Ed+(Eh+Ed)], 25 casos (12,25%). La ocurrencia de infecciones mixtas entre E. histolytica y E. dispar ha sido reportada previamente
(26)

. Los resultados de la prueba Z (p<0,01) demostraron que la frecuencia de E.

histolytica es significativa para esta poblacin. Aunque muchos autores

(26,32-36,39,40,55,65,66)

sealan una mayor prevalencia de E.

dispar con relacin a E. histolytica, el hallazgo de un mayor nmero de casos de esta ltima (15,19%) no resulta sorprendente, en virtud de las deplorables condiciones de higiene observadas en la comunidad. Adems, confirma el carcter endmico de la amibiasis en esta poblacin y alerta sobre el potencial problema de salud como factor de morbilidad y mortalidad en esta parroquia. En nuestro pas, son muy pocos los estudios que refieren la utilizacin de tcnicas discriminatorias entre E. histolytica y E. dispar. La nica referencia a nivel nacional que describe el diagnstico especfico de estas amibas a travs de PCR, seala una prevalencia de 6,31% para E. histolytica, 4,44% para E. dispar y 4 casos de infeccin mixta en pacientes con sintomatologa gastrointestinal de distintos centros de salud de Cuman (41). Es importante destacar que la frecuencia encontrada de E. dispar, contribuye en la sobreestimacin de la amibiasis diagnosticada a travs de mtodos convencionales como el examen microscpico, (20,58%) el cual no permite discriminar entre ambas amibas. Esto plantea graves implicaciones clnicas, teraputicas y epidemiolgicas, que lamentablemente no sern superadas a corto plazo; mientras no se difunda la informacin sobre la reclasificacin de Entamoeba en el personal de las ciencias de la salud, y no se apliquen tcnicas especficas en los laboratorios de la red de salud. El diagnstico de la amibiasis a expensas exclusivamente de los resultados de un examen microscpico representa una situacin compleja para el clnico. Ya que al no poder discernir cual de las dos especies presenta el paciente, debe aplicar el medicamento amebicida, previendo que se trate de un verdadero caso de infeccin por

E. histolytica. Es recomendable en todo caso, que el mdico no solo ordene el descarte de otros microorganismos patgenos intestinales, Ej.: Bacterias enteropatgenas, para concluir el diagnstico, sino tambin la identificacin de E. histolytica. No se encontr diferencia significativa (p>0,05) en la frecuencia de E. histolytica y/o E. dispar entre las dos reas geogrficas estudiadas, es decir entre los individuos de Brisas del Lago y Manaure (Anexo 9). Tabla IV Resultados de la tcnica de PCR aplicada a las muestras de heces.

Especie Parsito E. histolytica E. dispar Infeccin mixta con E. histolytica y E. dispar Negativas Total

N Individuos 22 16 9 157 204

% 10,78 7,84 4,41 76,96 100

PCR con los primers: SRPEh y SRPEd E. histolytica vs. Negativos: z= 8,9228 p= 0,00001 (Significativo) E. dispar vs. Negativos: z= 9,1995 p= 0,00001 (Significativo) Infeccin mixta E. histolytica y E. dispar: z= 9,5154 p= 0,00001 (Significativo) Aunque otros autores han referido la presencia de sangre en las muestras con E. histolytica
(33,43)

; en la presente investigacin, solo un paciente infectado con E.

histolytica (1/31), present sangre y moco en la muestra fecal al momento del examen macroscpico, por lo que no se pudo efectuar correlacin entre estas variables. Es posible justificar la ausencia de sangre en las heces si para el momento en que el

paciente entreg su muestra, el parsito todava no hubiere invadido la mucosa intestinal. En general, se observ un elevado nmero de infecciones mltiples (poliparasitismo) entre los individuos de la comunidad (66,17%). Cuando se analizan los casos que resultaron positivos por PCR, los protozoarios ms frecuentemente asociados a E. histolytica fueron Blastocystis hominis (74,19%), Entamoeba coli (41,93%) y Giardia lamblia (22,58%). En los individuos con E. dispar se present una asociacin con las mismas especies parasitarias, como puede apreciarse en la Tabla V. Tabla V Protozoarios observados en las muestras de los individuos infectados con las amibas estudiadas

Protozoarios Blastocystis hominis Entamoeba coli Giardia lamblia Endolimax nana Chilomastix mesnili Pentatrichomonas hominis

E. histolytica N 16 10 5 4 2 1 % 72,72 45,45 27,72 18,18 9,09 4,54

E. dispar N 13 8 1 3 0 1 % 81,25 50,00 6,25 18,75 0,00 6,25

Inf. Mixta E. h / E. d N % 7 3 2 3 1 0 77,77 33,33 22,22 33,33 11,11 0,00

Algunas publicaciones refieren a Entamoeba coli como uno de los principales organismos asociados a infecciones por E. histolytica y han sugerido que debe existir un mecanismo comn de transmisin o una susceptibilidad especfica para estas parasitosis
(26)

. Rivera y cols.

(55)

estudiaron la distribucin de Entamoeba histolytica y

Entamoeba dispar en el norte de Filipinas y detectaron una fuerte asociacin entre Entamoeba coli y la infeccin con Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar. No se observ diferencia significativa entre los porcentajes globales de las amibas estudiadas y el grupo de edad al que pertenecan los individuos (p>0,05); pero si es

importante destacar la ausencia de casos de amibiasis en los menores de 2 aos de edad, ya que ninguno estuvo parasitado con E. histolytica, E. dispar o ambas (Tabla VI). Es posible que en este grupo efectivamente haya una baja prevalencia de infeccin, pero el escaso nmero de individuos estudiados no permite obtener resultados concluyentes para este grupo de edad. Por otro lado esta situacin puede explicarse por los cuidados maternos que generalmente reciben los nios desde recin nacidos hasta aproximadamente los 20 meses de edad. Posteriormente, los nios llegan a tener un mayor contacto con el medio ambiente contaminado y por tal motivo se incrementa la probabilidad de adquirir la infeccin. Este sealamiento es importante porque en nuestro medio se aprecia con preocupacin, un elevado reporte de casos de amibiasis en los nios menores de 2 aos de edad. El anuario de mortalidad del ao 2005, seala 114 muertes por amibiasis en el pas, de las cuales 23 ocurrieron en menores de 2 aos
(46)

. La realizacin de tcnicas ms sensibles y especficas para el diagnstico de la

amibiasis colaborar significativamente en el esclarecimiento de esta situacin. El mayor nmero de individuos parasitados con E. histolytica y E. dispar se present en el grupo de 7-12 aos. Rivera y cols. (55) obtuvieron resultados similares, ya que, tampoco observaron diferencias entre los grupos etarios, pero si una mayor prevalencia de estas amibas en los individuos de 5-14 aos de edad.

Tabla VI Frecuencia de las especies de amibas por grupo etario N Grupo Individuos De Edad Estudiados Lactante menor Lactante Mayor Pre-escolar Escolar Adolescentes Adulto Joven Adulto Medio Adulto Mayor Total
2

Microscopia Complejo E. h / E. d N % 0 0 8 11 5 11 6 1 42 0,00 0,00 19,04 26,19 11,90 26,19 14,28 2,38 100

PCR E. histolytica N % 0 0 4 8 3 3 4 0 22 0,00 0,00 18,18 36,36 13,63 13,63 18,18 0 100 E. dispar N 0 0 3 5 1 5 2 0 16 % 0,00 0,00 18,75 31,25 6,25 31,25 12,5 0 100 Asoc. E. h/E. d N % 0 0 2 2 1 3 0 1 9 0,00 0,00 22,22 22,22 11,11 33,33 0 11,11 100

7 6 48 46 16 48 29 4 204

Ji cuadrado (X )= 8,5155 p= 0,9015 (No Significativo). De los 204 individuos estudiados, 94 pertenecan al sexo masculino y 110 al sexo femenino. De las 47 muestras que resultaron positivos por PCR (34,04%) para las amibas analizadas, 31 (65,96%) especimenes pertenecan al sexo femenino y 16 al sexo masculino. En el sexo femenino la prevalencia de las amibas mediante PCR fue la siguiente: 13 portadoras de E. histolytica, 12 con E. dispar y 6 tenian la infeccin mixta. En el caso de los hombres, 9 muestras amplificaron para E. histolytica, 4 para E. dispar y 3 para ambas especies de amibas (Anexo 10). El anlisis estadstico demostr que no haba diferencia significativa entre la frecuencia de las amibas y el sexo. Al igual que otros estudios que reportan una prevalencia de infecciones por E. histolytica equivalente entre hombres y mujeres (55). Con relacin a los signos y sntomas observados en los individuos estudiados, es conveniente destacar que de los 31 portadores de E. histolytica, solamente 2 fueron asintomticos y de los 25 infectados con E. dispar, 1 no refiri manifestaciones clnicas. El resto de los individuos 44/47 (93,62%) presentaron una variada mezcla de hallazgos clnicos, tal como puede apreciarse en la Tabla VII.

Los principales hallazgos clnicos observados en la infeccin con E. histolytica fueron dolor abdominal (77.27%), prurito anal (63,64%) y diarrea (59,09%). Los trabajos de Gonin y Trudel
(34)

y Visser y cols

(40)

refieren igualmente al dolor abdominal y la

diarrea como los principales sntomas encontrados en los pacientes infectados con E. histolytica. Estas manifestaciones tambin se presentaron en la mayora de los individuos infectados por E. dispar, por lo cual las manifestaciones clnicas no pueden ser atribuidas de manera concluyente a infeccin por E. histolytica y podran estar asociadas a infecciones bacterianas o virales no investigado en este trabajo. La frecuencia del prurito anal no puede ser adjudicada a la presencia de alguna de las amibas, debido a que este sntoma es bastante caracterstico de la enterobiasis y de otras patologas del rea perianal (Hemorroides, alergias, etc). Adems, en el presente estudio no se efectu el descarte de Enterobius vermicularis, ya que no se realizaron tcnicas especficas para su diagnstico. No se observ diferencia significativa entre la presencia de alguna de las amibas y los sntomas observados. Prcticamente todos los individuos presentaron signos y sintomas, indistintamente de que estuviesen infectados por E. histolytica y/o E. dispar. Aunque est claramente descrita la capacidad patgenica de E. histolytica y por ende la produccin de sintomas en los individuos infectados, nunca se ha referido la presencia de sntomas en portadores de E. dispar, en vista de su caracter apatognico. Por tal motivo, probablemente las manifestaciones observadas en los individuos con E. dispar, sea debida a la coexistencia de infeccin con otros protozoarios Blastocystis hominis y/o helmintos o protozoarios patgenos como Giardia lamblia. Adems la mayora de los individuos portadores de E. dispar tenian coinfeccin con Ascaris lumbricoides y Trichuris trichiura. Para poder demostrar causalidad de los sntomas en los casos con E. histolytica y/o E. dispar es necesaria la ausencia de otros agentes enteropatgenos parasitarios, bacterianos o virales, as como tambin el descarte de otras patologas gastrointestinales. Esto significa que los individuos no deben estar poliparasitados, situacin poco factible de conseguir en la mayora de las comunidades de bajos recursos, como la estudiada aqu.

Tabla VII Hallazgos Clnicos observados en los pacientes infectados con E. histolytica y/o E. dispar * E. histolytica Hallazgos Clnicos C/H N % 17 77,27 14 63,64 13 59,09 11 8 7 5 5 50 S/H N % 5 8 9 11 E. dispar C/H N % 75 87,5 50 37,5 62,5 43,75 12,5 S/H N % 4 2 8 10 6 9 14 25 12,5 50 62,5 37,5 56,25 87,5 Infec. Mix. E. h y E. d C/H N % 7 5 5 1 4 5 3 3 77,78 55,56 55,56 11,11 44,44 55,56 33,33 33,33 44,44 11,11 S/H N % 2 4 4 8 5 4 6 6 5 8 22,22 44,44 44,44 88,89 55,56 44,44 66,67 66,67 55,56 88,89

Dolor Abdominal Prurito Anal Diarrea Heces con moco Prdida de Apetito Flatulencia Vmitos Nuseas

22,73 12 36,36 14 40,91 50 8 6

36,36 14 63,64 10 31,82 15 68,18 22,73 17 77,27 22,73 17 77,27 7 2 3

18,75 13 81,25

Prdida de Peso 3 13,64 19 86,36 6 37,5 10 62,5 4 Diarrea intercalada con estreimiento 3 13,64 19 86,36 2 12,5 14 87,5 1 C/H= Con Hallazgos clnicos S/H= Sin Hallazgos Clnicos

*Hallazgos clnicos en 22 portadores de E. histolytica, 16 de E. dispar y 9 con infeccin mixta. (No se observaron casos de disentera por lo que tal hallazgo no aparece reflejado en la Tabla). Ji cuadrado (2)= 12,5019 p= 0,8977 (No Significativo). Este estudio demuestra la importante aplicacin de la tcnica de PCR en la deteccin diferencial de E. histolytica y E. dispar directamente de las muestras de heces, como una herramienta para estudios epidemiolgicos y en el monitoreo de la eficacia del tratamiento amebicida en pacientes particulares. Adems, los resultados obtenidos representan una importante data para los organismos regionales de salud, porque representa el primer estudio en el estado de caracterizacin gentica de E. histolytica y E. dispar.

CONCLUSIONES

CONCLUSIONES Este estudio revel una elevada prevalencia de enteroparsitos (86,77%) en la comunidad estudiada. Se estandariz un mtodo de extraccin de ADN directamente de muestras fecales para posterior anlisis de amplificacin por PCR. La sensibilidad de la tcnica de amplificacin result mayor que la evaluacin microscpica de las muestras de heces, al detectar mayor nmero de casos. La tcnica de PCR empleada permiti discriminar entre E. histolytica y E. dispar, as como diagnosticar infecciones mixtas lo cual representa un gran impacto desde el punto de vista teraputico y epidemiolgico. Se encontr un elevado porcentaje de individuos poliparasitados (66,17%). Las especies de protozoarios principalmente asociadas a Entamoeba histolytica y/o Entamoeba dispar fueron Blastocystis hominis, Entamoeba coli y Giardia lamblia. No se observ relacin entre la presencia de las amibas estudiadas, edad y sexo de los individuos infectados. El principal hallazgo clnico encontrado fue dolor abdominal, seguido de prurito anal y diarrea en los individuos infectados con cualquiera de las dos amibas. La gran cantidad de individuos sintomticos parasitados con ambas especies de amibas, que present asociaciones con otras especies patgenas o potencialmente patgenas, no permiti atribuir la causalidad de los sntomas a E. histolytica. La frecuencia observada de E. histolytica 31/204, demuestra el carcter endmico de la amibiasis en esta comunidad. Este estudio permite evidenciar la potencial aplicacin de la tcnica de diagnstico molecular utilizada, para estudios epidemiolgicos a gran escala y para monitorear la eficacia de un protocolo teraputico.

RECOMENDACIONES

RECOMENDACIONES Propiciar la realizacin de estudios mediante la tcnica de PCR, en pacientes con diagnstico de Amibiasis intestinal o extra-intestinal. Exhortar a los organismos sanitarios a implementar tcnicas especficas para la deteccin de E. histolytica en los laboratorios asistenciales para el correcto diagnstico de la amibiasis, indicando en todo caso, la deteccin de copro-antgenos como tcnica de descarte, debido a los elevados costos e infraestructura especial que se requiere para efectuar la PCR. Desarrollar este tipo de estudio con propsitos epidemiolgicos para conocer la verdadera prevalencia de estas amibas en la poblacin Exhortar a las autoridades sanitarias sobre la necesidad de llevar a cabo programas de saneamiento ambiental y mejorar las condiciones socio-econmicas de estas comunidades.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 1.- Matijasevic, E. 1995. Amibiasis. Espectro Clnico y Tratamiento. Tribuna Mdica 82(6):170-184. 2.- Fonte, L. 2000. Amebiasis: Enfoques actuales sobre su Diagnstico, Tratamiento y Control. La Habana. Elfos Scientiae. 193 pg. 3.- WHO/PAHO/UNESCO. 1997. Report of a Consultation of Experts on Amoebiasis. Mexico. January 28-29. 4.- Stanley S. 2003. Amoebiasis. Lancet 36:1025-34. 5.- Botero, D. y Restrepo, M. 2003. Parasitosis Humanas. Cuarta Edicin. Corporacin para investigaciones Biolgicas (CIB) Medelln, Colombia. 6.- Kirsch D. and Diaz-Rivera RS. 1943. Perinephric absceso: a previously unrecognized complication of amebiasis. Am. J. Med. Sci. 206:373-79. 7.- OLeary RK. And Posen J. 1984. Amoebiasis of the penis. S. Afr. Med. J. 65:113. 8.- Heinz KP. 1973. Amoebic infection of the female genital tract: a report of three cases. S. Afr. Med. J. 47:1795-98. 9- Choon K., Yamazaki O., Hamba H., Sakaup Y., Kinoshia H., Hirohashi K., and Kubo S. 1996. Analysis of 69 patients with amebic liver abscess. J. Gastroenterol; 31:40-45. 10.- Gotohda N., Itano S., Okada Y., Horiki S., Endo A., Terada N., Isozaki H., Takakura N., and Tanaka N. 2000. Acute apendicitis caused by amebiasis. J. Gastroenterol; 35:861-863. 11.- Cavagnaro F., Guzmn C., Harris P. 2006. Hemolytic uremia syndrome associated with Entamoeba histolytica intestinal infection. Pediatr. Nephrol; 21:126-128. 12.- Martnez-Palomo A., Gonzlez-Robles A., De La Torre M. 1973. Selective Agglutination of Pathogenic Strains of Entamoeba histolytica Induced By con A. Nature; New Biology 245:186-187. 13.- Sargeaunt PG., Willians JE., Grene JD. 1978. The Diferentiation of Invasive and Non-Invasive Entamoeba histolytica by Isoenzyme Electrophoresis. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 72:519-521. 14.- Petri WA., Clark CG., Diamond LS. 1994. Host-parasite relationships in Amebiasis. Conference J. Infect. Dis. 169:483-484. 15.- Chacn-Bonilla L. 2001. Relevancia del Reconocimiento de Entamoeba dispar en Amibiasis. Invest. Clin. 42(3):157-159.

16.- Haque, R., Neville, L., Hahn. P, Petri, W. 1995. Rapid Diagnosis of Entamoeba Infection by using Entamoeba and Entamoeba histolytica Stool Antigen Detection Kits. J. Clin. Microbiol. Oct. 33(10):2558-2561. 17.- Matijasevic, E. 1995. Amibiasis Intestinal Invasora: Patogenia. Tribuna Mdica 83(1):15-29. 18.- Walsh J.A. 1986. Amebiasis in the world. Arch Invest Med. 17(Supl):385-389. 19.- Gathiram V. and Jackson T.F.H.G. 1985. Frecuency Distribution of Entamoeba histolytica Zymodemes in a rural South African population. Lancet 1:719-721. 20.- Ravilin J.P., Jackson T.F.H.G., Petri W.A, Murphy C.F., Ungar B.L.P., Gathiram V., Skilogiannis J., Simjee A.E. 1990. Association of Serum Antibodies to Adherence Lectin with Pathogenic Entamoeba histolytica. Infect. Dis. 162:768-772. 21.- Gathiram V. and Jackson T.F.H.G. 1987. A longitudinal study of asymptomatic carries of pathogenic zymodemes of Entamoeba histolytica. S. Afr. Med. J. 72:768672. 22.- Shibayama-Hernndez, H., Pedroza-Gmez J., Rivero-Baos B., Shibayama M., Serrano-Luna J., and Tsutsumi V. 2000. A Simple Stool Concentration Method for the Detection and Preservation of the Vegetative Forms of Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar. Arch. Med. Res. 31:S30-S31. 23.- Ximnes C. 2003. Epidemiology of Amebiasis in Mexico: A Molecular Approach. Arch. Med. Res. 37:263-265. 24.- Murray P., Baron E., Jorgensen J., Pealler M., Yolken. 2003. Manual of Clinical Microbiology. 8th Edicin. Volumen 2. Washington DC. ASM Press. 25.- Bartolini, A., Cutts, F., Leoni, S. 1998. Patterns of antimicrobial use and antimicrobial resistance among healthy children in Bolivia. Trop. Med. Int. Health. 3:116123. 26.- Nuez, Y., Fernndez, M., Torres, D., Silva, J., Montano, L., Maestre, J., Fonte, L. 2001. Multiplex Polymerasa Chain Reaction Amplification and differentiation of Entamoeba histolytica and Entameoba dispar DNA from stool samples. Am. J. Trop. Med. Hyg. 64(5,6): 293-297. 27.- Haque, R., Krees, K., Wood. S. Jackson TFGH., Lyderly D., Wilkins T., Petriw A. 1993. Diagnosis of Pathogenic Entamoeba histolytica Infection Using a Stool Elisa Based on Monoclonal Antibodies to the Galactose-Specific Adhesin. J. Infect. Dis. 167:247-249. 28.- Haque, R., Lyerly, D., Wood, S., Petri, W.A. Jr. 1994. Detection of Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar Directly in Stool. Am. J. Trop. Med. Hyg. 50(5):595596.

29.- Haque, R., Neville, L., Hahn, P., Petri, W. 1995. Rapid diagnosis of Entamoeba infection by using Entamoeba and Entamoeba histolytica stool antigen detection kits. J. Clin. Microbiol. 33(10):2558-2561. 30.- Acua-Soto R, Samuelson J, De-Girolami P, et al. 1993. Application of the Polymerase Chain Reaction to the epidemiology of pathogenic and non- pathogenic Entamoeba histolytica. Am. J. Trop. Med. Hyg. 48(1):58-70 31.- Haque, R., Ali, I.K.M., Akther, S., Petri Jr., W. 1998. Comparison of PCR, Isoenzyme Analisis and Antigen Detection for Diagnosis of Entamoeba histolytica Infection. J Clin Microbiol 36(2):449-452. 32.- Evangelopoulos A., Legakis N., Vakalis N. 2001. Microscopy, PCR and ELISA applied to the epidemiology of amoebiasis in Greece. Parasitol. Int. 50:185-189. 33.- Snchez-Guilln M., Prez-Fuentes R., Salgado-Rosas H., Ruiz-Argelles A., Ackers J., Shire A., and Talams-Rohana P. (2002). Differentitation of Entamoeba histolytica/ Entamoeba dispar by PCR and their Correlation with Humoral and Cellular Immunity in Individuals with Clinical Variants of Amoebiasis. Am. J. Trop. Med. Hyg. 66(6), pp. 731-737. 34.- Gonin P. and Trudel L. 2003. Detection and Differentiation of Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar Isolates in Clinical Samples by PCR and EnzymeLinked Immunosorbent Assay. J. Clin. Microbiol. p. 237-241 35.- Pinheiro, SM., Carneiro, RM., Aca, IS., Irmao, JI., Morais, MA., Coimbra, MR., Carvalho, LB. 2004. Determination of the prevalence of Entamoeba histolytica and E. dispar in the Pernambuco State of Northeastern Brazil by a Polymerase Chain Reaction. Am. J. Trop. Med. Hyg. 70(2):221-4. 36.- Ramos F., Morn P., Gonzlez E., Garca G., Ramiro M., Gmez A., Garca M., Melendro E., Valadez A., Ximenez C. 2005. High prevalence rate of Entamoeba histolytica asymptomatic infection in a rural Mexican community. Exp. Parasitol. 110: 327-330. 37.- Qvarnstrom Y., James C., Xayavong M., Holloway B., Visvesvara G., Sriam R and da Silva A. 2005. Comparison of Real-Time PCR protocols for differential laboratory diagnosis of Amebiasis. J. Clin. Microbiol. p. 5491-5497. 38.- Blessmann J., Buss H., Ton Un P., Dinh B., Viet Ngo Q., Le Van A. Abd Alla M., Jackson T., Ravdin J., and Tannich E. 2002. Real-time PCR for detection and differentiation of Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar in fecal samples. J. Clin. Microbiol. p. 4413-4417. 39.- Calderaro A., Gorrini Ch., Bommezzadri S., Piccolo G., Dettori G., Chezzi C. 2006. Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar: comparison of two PCR assays for diagnosis in a non-endemic setting. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 100, 450-457. 40.- Visser L., Verweij J., Van M., Edeling W., Clreinx J., Polderman A. 2006. Diagnostic methodos for differentitation of Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar in

carries: Performance and clinical implications in a non-endemic setting. Int. J. Med. Microbiol. 296:397-403. 41.- Mora L., 2006. Caracterizacin molecular y epidemiologa de Entamoeba histolytica y Entamoeba dispar en pacientes con diarrea en Cuman, Estado Sucre. Trabajo de Grado presentado como requisito parcial para optar al ttulo Magster Scientiarum en Biologa Aplicada mencin Microbiologa Aplicada. Universidad de Oriente. 42.- Rivero, Z., Daz. I., Acurero, E., Camacho, M.C., Medina, M., Rios, L. 2001. Prevalencia de Parsitos Intestinales en Escolares de 5 a 10 aos de un Instituto del Municipio Maracaibo. Estado Zulia. Kasmera. 29(2):153-170. 43.- Mora L., Garca A. y De Donato M. 2005. Prevalencia del complejo Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar en pacientes con sntomas gastrointestinales de diarrea procedentes de Cuman, Estado Sucre. Kasmera. 33(1):36-45. 44.- Daz I., Rivero Z., Bracho A., Castellanos M., Acurero E., Calchi M., Atencio R. 2006. Prevalencia de enteroparsitos en nios de la etnia Yukpa de Toromo, Estado Zulia, Venezuela. Rev. Md. Chile 134: 72-78. 45.- Anuario Estadsticas de Salud, Edo. Zulia 2001. Ministerio de Salud y Desarrollo Social. Gobernacin del Edo. Zulia. Direccin Regional de Salud. Direccin Regional de Epidemiologa. Publicacin N 4. Septiembre 2002. 46.- Anuario de Mortalidad 2005. Ministerio de Salud. Direccin General de Epidemiologa. Direccin de Informacin Social y Estadsticas. Caracas-Venezuela. Agosto 2006. 363 pgs. 47.- Sabino, C. 1992. El Proceso de Investigacin. Caracas. Editorial Panapo. 48.- Hernandez R., Fernndez C., Baptista P. (1991). Metodologa de la Investigacin. Mxico. Editorial McGraw-Hill. 49.- Convenio CONAVI-IVIMA. (2004) Componente Tcnico Urbano Alcalda de Maracaibo. 50.- Masaln M y Gonzlez R. (2003). Autocuidado del Ciclo Vital. Disponible en: http://www.puc.cl/sw_educ/enferm/ciclo/index.html (consulta: 2003, diciembre). 51.- Melvin D Y Brooke M. (1971). Mtodos de Laboratorio para diagnostico de parasitosis intestinales. 1 Edicin. Editorial Interamericana. Mxico. 52.- Stanley L., Blanchard L., Johnson N., Foster L., Kunz-Jenkins C., Zhang T., Tian K., Cogswell F. (1995). Immunogenicity of the Recombinant Serine Rich Entamoeba histolytica Protein (SREHP) Amebiasis Vaccine in the African Green Monkey. Vaccine 13: 947-951

53.- Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W., Lipman, D.J. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215: 403-410. 1990. 54.- Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., Lipman, D.J. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic. Acids. Res. 25: 3389-3402. 55.- Rivera W., Tachibana H., Kanbara H. 1998. Field study on the distribution of Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar in the Northern Philippines as detected by the Polymerase Chain Reaction. Am. J. Trop. Med. Hyg. 59(6), pp. 916921. 56.- Daniel, W. Bioestadstica. Base para el anlisis de las ciencias de la salud. 4ta Edicin. Limusa Wiley. 57.- Chacn-Bonilla L., Dikdan Y. 1981. Prevalencia de Entamoeba histolytica y otros parsitos intestinales en una comunidad suburbana de Maracaibo. Inv. Clin. 22(4): 185203. 58.- Chacn-Bonilla L., Rubio F., Cuamo Y., Aez S. 1984. Prevalencia de Entamoeba histolytica y otros parsitos intestinales en una comunidad del Distrito Urdaneta. Inv. Clin 25(1): 11-24. 59.- Chacn-Bonilla L., Dikdan Y., Guanipa N., Villalobos R. (1990). Prevalencia de Entamoeba histolytica y otros parsitos intestinales en un barrio del Municipio Mara, Estado Zulia, Venezuela. Inv. Clin 31(1): 185-204. 60.- Rivero-Rodrguez Z. 2003. Deteccin y diferenciacin de Entamoeba histolytica y Entamoeba dispar en nios de un rea endmica. Trabajo presentado para optar al ascenso a la categora de Profesor Titular de LUZ. 45 pp. 61.- WHO (1997). Amoebiasis. Wkly. Epidemiol. Rec. 72:97-100. 62.- Troll H., Marti H. and Weiss N. 1997. Simple differential detection of Entamoeba histolytica y Entamoeba dispar in fresh stool specimens by sodium acetateacetc acidformalin concentration and PCR. J. Clin. Microbiol. 35: 1701-1705. 63.- Moran P., Ramos F., Ramiro M., Curiel O., Gonzalez E., Valadez A., Gmez A., Garcia G., Melendro E., Ximnez C. 2005. Entamoeba histolytica and/or Entamoeba dispar: Infection frequency in HIV*/AIDS patients in Mexico City. Exp. Parasitol. 110:331-334. 64.- el-Hamshary EM., el-Shewy KA., Hezagy MM., Zakaria H. 2004. Selective identification of the pathogenic E. histolytica in fresh stool simples using polymerase chain reaction (PCR). J. Egypt. Soc. Parasitol. 34(2):611-20. 65.- Verweij J., Oostvogel F., Brienen E., Nang-Beifubah A., Ziem J., Polderman A. 2003. Prevalence of Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar in northern Ghana. Trop. Med. Int. Health. 8 (12):1153-1156.

66.- Walderich B., Weber A., Knobloch J. 1997. Differentiation of Entamoeba histolytica y Entamoeba dispar from German travelers and residents of endemic areas. 1997. Am. J. Trop. Hyg 57(1):70-74.

ANEXOS

ANEXO N 1 UBICACIN DE LA COMUNIDAD

ANEXO N 2 CONDICIONES DE VIDA EN LA COMUNIDAD

ANEXO N 3 COMUNIDADES ESTUDIADAS: BRISAS DEL LAGO Y MANAURE

ANEXO N 4 CONSENTIMIENTO PREVIA INFORMACIN Las Ctedras de Parasitologa, Bacteriologa y Prctica Profesional de Parasitologa de la Escuela de Bioanlisis de la Facultad de Medicina de La Universidad del Zulia, estn realizando el programa de investigacin VAC-CONDES CC-0216-05 titulado: Diagnstico, Prevalencia y Manifestaciones Clnicas de Protozoosis Intestinales Humanas con el objetivo de Establecer la prevalencia de Entamoeba histolytica y Entamoeba dispar mediante la tcnica de PCR en el Estado Zulia, Asociar la prevalencia amibiana con la presencia o no de sntomas clnicos intestinales en los individuos estudiados. Yo,____________________________________ C.I.:_____________________ Nacionalidad:__________________ Estado Civil:__________________ Domiciliado en la casa #: _______________________ siendo mayor de 18 aos en USO pleno de mis facultades mentales y sin que medie coaccin ni violencia alguna en completo conocimiento de la naturaleza, forma, duracin, propsito, inconvenientes y riesgos relacionados con el estudio que ms abajo indico, en calidad de paciente o representante legal del menor de edad ______________________________, declaro mediante la presente: 1.- Haber sido informado de manera clara y sencilla, por parte de investigadores de La Escuela de Bioanlisis de la Facultad de Medicina de La Universidad del Zulia, coordinado por la Lic. Zulbey Rivero Magster de todos los aspectos relacionados al programa de investigacin VAC-CONDES CC-0216-05 titulado: Diagnstico, Prevalencia y Manifestaciones Clnicas de Protozoosis Intestinales Humanas 2.-Tener conocimiento claro de que el objetivo fundamental del trabajo antes sealado es: Determinar la prevalencia de Entamoeba histolytica y Entamoeba dispar y asociar la prevalencia amibiana con la presencia o no de sntomas clnicos intestinales en los individuos estudiados. 3.- Haber sido informado de que mi participacin en el programa consiste en facilitar de manera voluntaria al equipo de investigadores una muestra de heces en un envase recolector facilitado por el personal previa instrucciones de la correcta toma de la misma. 4.- Que la muestra de heces que acepto facilitar as como la informacin que suministre al equipo de investigadores ser utilizada para determinar la presencia de agentes parasitarios y/o bacterianos. 5.- Que el equipo de investigadores me ha garantizado absoluta confidencialidad relacionada tanto a mi identidad como de cualquier informacin relativa a mi persona a la que tenga acceso por concepto de mi participacin en el programa antes mencionado.

6.- Que estoy de acuerdo en el USO de los resultados obtenidos en el presente estudio, nica y exclusivamente para el presente proyecto. Cualquier otro uso queda prohibido, excepto previo acuerdo entre las partes. 7.- Que mi participacin en dicho estudio no implica riesgo ni inconveniente alguno para mi salud o la de mi representado. 8.- Que bajo ningn concepto se me ha ofrecido ni pretendo recibir algn beneficio de tipo econmico producto de los hallazgos que puedan producirse en el referido programa de investigacin. 9.- Que los resultados de las pruebas me sern entregados oportunamente. En un tiempo no mayor de 15 das. 10.- Uso de las muestras: Las muestras de heces que le sean solicitadas sern utilizadas para conocer sobre los agentes infectantes antes descritos. Algunas muestras sern almacenadas en el Laboratorio con la finalidad de ser usadas en posteriores pruebas que confirmen los agentes parasitarios presentes y/o pruebas virolgicas. Las muestras pueden ser procesadas en otras instituciones y pueden facilitar a los investigadores el desarrollo de pruebas diagnsticas que tengan valor comercial. El paciente no recibir ninguna compensacin econmica derivada de la comercializacin de esas pruebas o tratamientos. Para cualquier estudio, sus muestras sern identificadas por cdigos, manteniendo por este medio bajo estricta confidencialidad la identidad del paciente. Si Ud. Autoriza que guarden sus muestras de heces para futuras investigaciones, los investigadores que estudien sus muestras pudieran querer saber ms sobre Ud. Si los investigadores necesitan otra informacin sobre Ud.: (Por favor marque abajo para indicar si Ud. Puede o no ser contactado en el futuro) ___Puedo ser contactado de nuevo para informacin. ___No puedo ser contactado de nuevo para informacin. Preguntas: Ud. Es libre de preguntar sobre este estudio y sus derechos en este proyecto de investigacin. DECLARACIN DEL VOLUNTARIO Luego de haber ledo, comprendido y recibido las respuestas a mis preguntas con respecto a este formato de consentimiento y por cuanto mi participacin en este estudio es totalmente voluntaria acuerdo: A.- Aceptar las condiciones estipuladas en el mismo y a la vez autorizar al equipo de investigadores de la Escuela de Bioanlisis de la Facultad de Medicina de La Universidad del Zulia a realizar el referido estudio de muestras de heces que acepto facilitar a los fines indicados anteriormente. B.- Reservarme el derecho de revocar esta autorizacin as como mi participacin en el programa, en cualquier momento, sin que ello conlleve algn tipo de consecuencia negativa para mi persona.

Firma del Voluntario (o representante) ________________________________ Nombres ________________________ C.I:_____________________________ Lugar: __________________________ Fecha: __________________________ Firma Testigo: ____________________ Nombres: ________________________ C.I: _____________________________ Lugar: __________________________ Fecha: __________________________

DECLARACIN DEL INVESTIGADOR Luego de haber explicado detalladamente al voluntario la naturaleza del protocolo mencionado. Certifico mediante la presente que, a mi leal saber, el sujeto que firma este formulario de consentimiento comprende la naturaleza, requerimientos, riesgos y beneficios de la participacin en este estudio. Ningn problema de ndole mdica, de idioma o de instruccin ha impedido al sujeto tener una clara comprensin de su compromiso con este estudio. Esta investigacin permanecer en constante evaluacin del manejo de los individuos bajo estudio, con el fin de preservar la integridad fsica y psicolgica de los mismos resguardando sus derechos humanos por parte de la Comisin de Biotica de la Facultad de Medicina de la Universidad del Zulia. Lugar y Fecha:

ANEXO N 5 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS. ANLISIS PARASITOLGICO.

ANEXO N 6 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS. BIOLOGA MOLECULAR.

ANEXO N 7 ENCUESTA CLNICA Fecha: ___/___/___.

Nombre del Paciente: _________________

Edad: ________

Sexo: F____ M____ Talla: ________

Direccin: ___________________________ Peso: _________

HALLAZGOS CLNICOS SI NUSEAS VMITOS PERDIDA DE APETITO PERDIDA DE PESO FLATULENCIA DIARREA HECES CON MOCO DISENTERA ESTREIMIENTO DIARREA INTERCALADA CON ESTREIMIENTO PRURITO ANAL DOLOR ABDOMINAL

PRESENTE NO

Observaciones:_________________________________________________________ ______________________________________________________________________ _________________________ Mdico Parasitlogo

ANEXO N 8 EVALUACIN CLNICA

ANEXO N 9 FRECUENCIA DE LAS ESPECIES DE AMIBAS EN LOS SECTORES ESTUDIADOS

Sectores

Ind. Est.*

E. histolytica N 15 7 22 % 68,18 31,82 100

E. dispar N 10 6 16 % 62,5 37,5 100

Inf. Mixta E. h y E. d N 6 3 9 % 66,67 33,33 100

Brisas del Lago Manaure Total

110 94 204

*Ind Est: Individuos estudiados Ji cuadrado (X2)= 0,1357 p= 0,9344 (No Significativo)

ANEXO N 10 FRECUENCIA DE LAS ESPECIES AMIBIANAS SEGN SEXO Infeccin E. dispar mixta E. h y E. d 4 12 3 6

Total estudiados Hombres Mujeres 94 110

E. histolytica 9 13

Total

204

22

16

Ji cuadrado (X2)= 1,0466 p=0,5925 (No Significativo)

INDICE DE ILUSTRACIONES

INDICE DE ILUSTRACIONES Figura N 1. Marcador de peso molecular N 2. Corrida electrofortica en gel Tablas. N. I. Oligonucletidos utilizados N. II. Especies parasitarias identificadas em las muestras de heces N. III. Comparacin de los resultados obtenidos mediante microscopa y PCR N. IV. Resultados de la Tcnica de PCR aplicada a las muestras de heces 25 31 34 36 28 32

N. V. Otros protozorios observadas en las muestras de los individuos infectados con las amibas estudiadas N. VI. Frecuencia de las especies de amibas por grupo etario 37 39

N. VII. Hallazgos Clnicos observados en los pacientes infectados con E. histolytica y/o E. dispar 41

INDICE DE ANEXOS

INDICE DE ANEXOS

N 1. Ubicacin de la Comunidad N 2. Condiciones de Vida de la Comunidad N 3. Comunidades estudiadas: Brisas del Lago y Manaure N 4. Consentimiento Previo N 5. Procesamiento de las muestras. Anlisis Parasitolgico N 6. Procesamiento de las muestras. Biologa Molecular N 7. Encuesta Clnica N 8. Evaluacin Clnica N 9. Frecuencia de las especies de amibas en los sectores estudiados N 10. Frecuencia de las especies amibianas segn sexo.

51 52 56 58 61 62 65 66 67 68