Diseo de oligonucleotidos iniciadores (primers)

La seleccin de oligonucletidos iniciadores es muy importante en lareaccin en cadena de la polimerasa o PCR (por sus siglas en ingls), en la hibridizacin con sondas y en la secuenciacin de ADN. De este paso depende el xito en el laboratorio. Principales Criterios Tamao ideal: 20-25 nucletidos de longitud generalmente: 18-30 nucletidos de longitud Debe ser una G o una C 50-65 C 40-60% Debe ser evitada Para minimizar la formacin de estructuras secundarias y los dimeros de primer Debe tener un 100% de apareamiento con el molde

Tamao Base en el extremo 3' Temperaturas de fusin (Tm) contenido GC autocomplementariedad Similaridad

Cebadores para PCR o para Secuenciacin

PCR:

Cuando el objetivo a amplificar es un locus, la posicin de los iniciadores debe ser relativa a los codones de inicio y terminacin. Es recomendable que el cebador "forward" se encuentre mas o menos a 35 pb del inicio de la secuencia que codifica, de la misma forma el cebador "reverse" debe localizarse 35 pb despues de la regin que codifica.
SECUENCIACIN

Cuando el objetivo es obtener la secuencia de ADN es recomendable que los cebadores se localicen por lo menos 50 pb antes de la regin que se desea secuenciar, esto para el cebador "forward" cuando hay uno, y 50 pb despues de la regin a secuencias para el cebador "reverse", cuando hay uno. Es importante que el fragmento a secuenciar no sea muy grande, debido a que los errores de lectura de secuencia aumentan cuando los fragmentos son grandes, si es necesario secuenciar un fragmento muy largo, es conveniente disear cebadores internos, para obtener la secuencia en dos partes y luego ensamblarla.
Temperatura de Asociacin

La temperatura de asociacin de los cebadores es uno de los factores mas determinantes de la reaccin. Se recomienda que se emplee como temperatura de asociacin la temperatura de fusin -5C, aproximadamente. Existen muchos mtodos para calcular la temperatura de fusin, pero siempre, despues de efectuado el clculo es necesario ir al laboratorio y ensayar con diferentes temperaturas de asociacin cercanas a la temperatura de fusin para determinar la temperatura ptima para cada reaccin.
Clculo de la temperatura de fusin (Tm) (2)

Existen muchos mtodos para estimar el valor de la temperatura de fusin. Para secuencias de 20 bp o menos, existe la siguiente aproximacin: Tm = 2C (A + T) + 4C (G + C) donde se asume una concentracin de sal de 0.9M, tipica de "dot blot" y otros ensayos de hibridizacin A continuacin tenemos otra expresin para el calculo de Tm Tm = 81.5 + 0.41(%GC) - 500/L + 16.6 log[M],

donde L se refiere a la longitud del oligonucletido, y [M] es la concentracin de cationes monovalentes. Esta frmulas es unicamente aplicable a asecuencias polinucleotidicas largas. El mtodo mas preciso para estimar la Tm de oligonucletidos est basado en el anlisis termodinmico del proceso de fusin del cual se puede mostrar que,

Los cambios en la entalpia( ) y la entropia( ) de la formacin del duplex se calculan a partir de parametros termodinmicos de vecindades. R es la constante molar de los gases (1.987 cal.K-1mol-1), y C es la concentracin molar del oligonucleotido. Se puede adicionar un secundo trmino a la ecuacin anterior para tener encuenta el efecto estabilizante de la sal sobre el duplex:

Los efectos de Na+ y K+ son equivalentes dentro de los margenes del error experimental.
Programas de Diseo de Primers

Primer3 Primer Selection NetPrimer

Bibliografa

1. - Human Genome Maping Project. Primer Desing (http://www.hgmp.mrc.ac.uk/MANUAL/faq/faqprimers.html) 2. - Integrated DNA Technologies. Calculation of Tm for Oligonucleotides (http://www.idtdna.com/html/tech/tmcalc.html )