Perfil Eletrofortico de Protenas Plasmticas: Estudo em Crianas Atendidas no Hospital de Pediatria Hosped / UFRN da Cidade de Natal-RN

ELECTROPHORETIC PROFILE OF PLASMATIC PROTEINS: STUDY IN CHILDREN ASSISTED AT THE PEDIATRIC HOSPITAL HOSPED/UFRN IN NATAL CITY
D. G. K. C. E SILVA1; G. M. TEODORO1; L. V. DE SENA2; Z. M. DE SOUSA1; A. A. REZENDE1*

RESUMO - A eletroforese de protenas permite qualificar e quantificar as protenas sricas, auxiliando no diagnstico e controle das alteraes patolgicas. Este trabalho objetiva estudar o perfil eletrofortico das protenas sricas das crianas atendidas no Hospital de Pediatria (HOSPED/UFRN) e auxiliar no diagnstico de patologias decorrentes de insuficincia/disfuno protica. Foram coletadas amostras de sangue de 98 crianas atendidas no HOSPED, na faixa etria compreendida de 1 dia a 15 anos, e encaminhadas ao Laboratrio de Bioqumica Clnica do DACT/CCS, onde se realizou a eletroforese de protena em suporte de acetato de celulose, posteriormente quantificadas por Densitometria. As amostras avaliadas apresentaram um perfil eletrofortico bem definido quanto separao das fraes proticas albumina, alfa 1, alfa 2, beta e gama globulina. Observou-se que 51 pacientes (52,04%) enquadaramse no Grupo I - processo inflamatrio agudo, 32 pacientes (32,66%) no Grupo II - processo crnico e 11 pacientes do Grupo III (11,22%) apresentaram valores normais no padro eletrofortico analisado. Em outros 4 pacientes, observou-se situaes isoladas com nveis diminudos das fraes alfa 1 e alfa 2 globulinas, da frao albumnica, ou aumento da frao beta. Estes resultados mostram um perfil preliminar das principais patologias que acometem a populao estudada, sendo estes relevantes para monitoramento, auxlio e confirmao do diagnstico das mesmas PALAVRAS-CHAVES - Eletroforese de protenas, crianas, protena de fase aguda, diagnstico SUMMARY - The electrophoresis of proteins allows to qualify and quantify seric proteins, helping out the diagnosis and control of pathologic alterations. This work aims to study the electrophoretic profile of serum proteins in children assisted at the Pediatric Hospital (HOSPED/UFRN) and aid in the diagnosis of pathologies origined by proteic insufficiency or disfuncion. It had been collected blood samples from children assisted at HOSPED, within the age range of 0 and 15 years of age, and guided to the Laboratory of Clinical Bioquemistry of DACT/CCS, where the electrophoresis of proteins took place in celulosis acetate support, later quantified by Desintometry. The samples evaluated showed an electrophoretic profile well defined regarding the separation of proteic fractions albumin, alfa 1, alfa 2, beta and gama globulins. Among 98 analysed cases, 51 patients (52.04%) were included in G-I (acute inflamatory process), 32 patients (32.66%) in G-II (cronic process) and 11 patients included in G-III (11.22%) showed normal values in the electrophoretic pattern analysed. In other 4 patients, it was observed isolated situations with low levels of alfa 1 and alfa 2 globulins, albumin fraction, or increasing of beta fraction. These results show a preliminary profile of the main pathologies which assalt the studied population, these are relevant to the follow up and confirmation of the diagnosis. KEYWORDS - Electrophoresis of proteins, children, acute phase protein, diagnosis

INTRODUO

s protenas so compostos essenciais todas as clulas vivas e esto relacionadas, praticamente, a todas as funes fisiolgicas, alm de desempenharem papis importantes na estrutura celular. So polmeros de alto peso molecular, cujas unidades bsicas, os aminocidos, so ligados entre si por ligaes peptdicas. Dentre suas funes biolgicas, que so influenciadas por sua estrutura e seqncia de aminocido, destacam-se: catlise enzimtica, transporte, capacidade de contrao ou de movimento, suporte e estrutura, imunoproteo e defesa, coagulao sangunea, reguladores do crescimento e diferenciao celular (6, 14). As protenas plasmticas podem ser separadas por eletroforese em duas fraes principais sendo uma a frao de albumina e a outra constituda pelas globulinas, as quais se diferenciam da albumina por apresentarem maior tamanho e peso molecular. A concentrao total de protenas no plasma de aproximadamente 6,0 a 8,0 g/dL e, em pH 7,4, estas protenas encontram-se na forma aninica e, assim,

constituem parte significativa do complemento aninico do plasma. A relao normalmente encontrada entre albumina e globulina de 2:1 (14). A albumina, tambm conhecida como soroalbumina, a mais abundante das protenas sricas (3,5 a 5,5 g/dL), sendo sintetizada no fgado a uma taxa de aproximadamente 12 g/dia, o que representa 25% da sntese protica total do fgado e a metade de toda a protena exportada pelo rgo. A frao globulnica uma mistura muito complexa, sendo dividida em 05 subfraes: alfa 1, alfa 2, beta 1, beta 2 e gama globulinas. Dentre as globulinas a frao de migrao eletrofortica mais rpida a alfa 1 e a mais vagarosa gama globulina que, geralmente, sintetizada pelas clulas do sistema macrofgico, principalmente pelos linfcitos B (9). A frao alfa-1 globulina formada principalmente pelas protenas alfa-1-antitripsina (AAT), alfa-1-glicoprotenacida (AGA), alfa-1-lipoprotena (Lp) e alfa-1-fetoprotena (Ft), enquanto a frao alfa 2 pela haptoglobina (Hap), ceruloplasmina (Cer) e alfa-2-macroglobulina (AMG). Os principais componentes da frao beta-1 so a transferrina

Recebido em 27/06/2004 Aprovado em 25/02/2005 1 Departamento de Anlises Clnicas e Toxicolgicas Faculdade de Cincias Farmacuticas Universidade Federal do Rio Grande do Norte UFRN, Natal, Brasil. 2 Departamento de Pediatria Hospital de Pediatria HOSPED Centro de Cincias da Sade UFRN, Natal, Brasil. Trabalho apresentado ao Departamento de Anlises Clnicas e Toxicolgicas DACT, na forma de monografia para a concluso do curso de Farmcia, modalidade Anlises Clnicas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte UFRN/ Natal/RN.

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(TRF) e a hemopexina (Hpx), enquanto da beta 2, a beta-lipoprotena (Lp), alm dos componentes do complemento srico (C3, C4) e fibrinognio. A frao gama formada pelos vrios tipos de imunoglobulinas, entre elas IgA, IgM IgD, IgE, IgG e, e pela protena C reativa (PCR), tendo neste grupo a IgG como a principal frao, correspondendo a 80% das gamaglobulinas. (9, 14). importante descrever ainda alguns componentes de interesse especial, como as mucoprotenas e glicoprotenas, as quais so encontradas principalmente nas fraes globulnicas alfa 1 e alfa 2 e as lipoprotenas que so formadas por uma combinao de lipdeo com protena e migram com as globulinas alfa e aproximadamente 5% de misturas semelhantes migram com as globulinas beta (10,14,15). As protenas plasmticas so ainda classificadas como protenas de fase aguda uma vez que embora presentes naturalmente no sangue, apresentam sua sntese alterada pelas clulas parenquimais do fgado em resposta a uma variedade de estresses como inflamaes, infeco bacteriana, radiaes, toxinas, isquemia, choque trmico, entre outros, independente do fator desencadeante. As protenas de fase aguda positivas so representadas por alfa-1antitripsina, alfa-1-glicoprotena-cida, haptoglobina, alfa-2-macroglobulina, ceruloplasmina, fibrinognio, C3, e protena C reativa, e as de fase aguda negativas por pralbumina, albumina e transferrina. Devido falta de especificidade, o perfil das protenas de fase aguda pode ser determinado atravs de algumas protenas, como protena C reativa, glicoprotena-cida, antitripsina e haptoglobina, sendo este utilizado no estudo de algumas patologias, pois apresentam elevaes dos nveis sricos em resposta a estmulos que caracterizam uma agresso ou estresse do organismo (9,14). Do ponto de vista prtico mais fcil e confivel medir a concentrao srica das protenas do que de fatores e citocinas responsveis pelo aumento das mesmas, como fator de necrose tumoral (TNF), interleucina 1 (IL-1) e interleucina 6 (IL-6), os quais apresentam meia vida curta e so medidas por mtodos mais sofisticados (4,5). Importantes progressos tem sido acumulados a partir do significado clnico das possveis patologias associadas s protenas plasmticas, entre eles, o estudo da relao albumina/globulina em doenas hepticas e renais (11). Neste sentido, Muratsubaki et al. (2002) relataram o aumento de protenas de fase aguda em pacientes com doenas inflamatria e ps-operatria, Miura et al. (2000) apontaram como satisfatrio o uso da eletroforese na separao da protena M (gamopatia monoclonal) em pacientes com Mieloma Mltiplo e Graninger et al. (1992) avaliaram a concentrao das protenas sricas em pacientes com malria. A maioria das protenas sricas so mostradas por sua aparncia real atravs de padres eletroforticos tpicos como ilustra a Figura 1. Como pode ser observado, a configurao eletrofortica se apresenta na forma de picos ou bandas de acordo com a concentrao da protena. Para realizar a eletroforese de protenas, os suportes geralmente utilizados incluem papel de filtro, acetato de celulose, gel de agarose ou gel de poliacrilamida e, por razes econmicas, os laboratrios clnicos tm utilizado acetato de celulose, um meio de separao que se processa com rapidez e eficincia em anlises qualitativas de protenas, lipoprotenas, isoenzimas e hemoglobinas (2, 9,14).
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Figura 1: Padro eletrofortico das protenas plasmticas em pH 8,6. O grfico mostra a ordem e migrao ao longo do eixo horizontal. A altura da banda ao longo do eixo vertical define a concentrao da protena (adaptado de DEVLIN, T.M. 1998)

Considerando que cada patologia apresenta um perfil eletrofortico caracterstico esse usado para elucidar o diagnstico e acompanhar a evoluo ou regresso da doena (3,9,13,14). O padro eletrofortico de processos inflamatrios de reao aguda consiste em nveis diminudos de albumina e elevao do nvel de alfa 1 e alfa 2-globulina, sendo observado nos estgios iniciais das infeces agudas e em alguns casos de infarto do miocrdio, necrose tecidual, em queimaduras graves, cirurgias e outras condies de estresse (1,3,5,13,15). O perfil inflamatrio crnico consiste na reduo do nvel de albumina, nveis elevados de gama globulinas e elevao ou nveis normais de alfa 2-globulina, sendo observado em vrios tipos de infeces crnicas, nas doenas granulomatosas, na cirrose e em doenas reumatides do colgeno. Naturalmente, pode haver vrios estgios de transio entre esse padro crnico e o padro agudo descrito anteriormente (1,3,12). Tendo em vista a importncia das alteraes de protenas sricas para o acompanhamento de patologias, o presente trabalho tem o objetivo de avaliar o perfil eletrofortico das protenas sricas de crianas atendidas no Hospital de Pediatria UFRN / Natal / RN e identificar as possveis alteraes associadas aos processos agudos e crnicos.

CASUSTICA E MTODOS CASUSTICA O estudo foi realizado com um grupo de 98 pacientes de ambos os sexos, compreendido numa faixa etria de 1 dia a 15 anos de idade, atendidos no Hospital de Pediatria HOSPED da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) na cidade do Natal-RN, no perodo de maro de 2001 a maro de 2002. COLETA E PROCESSAMENTO DA AMOSTRA As amostras de sangue foram coletadas diariamente no HOSPED, aps jejum de oito horas, sem anticoagulante, e encaminhadas ao Laboratrio de Bioqumica Clnica do Departamento de Anlises Clnicas e Toxicolgicas do Centro de Cincias da Sade da UFRN. Aps centrifugao a 1.500 rpm por 10 minutos, (Centrifuga OTMA Presvac, Modelo DCS 16 RVT) o soro obtido foi imediatamente submetido eletroforese de protenas e determinao da concentrao de protenas totais.
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MTODOS DETERMINAO DA CONCENTRAO DE PROTENAS TOTAIS Para determinao da concentrao de protenas totais utilizou-se o mtodo colorimtrico Biureto (kit Labtest), cujo fundamento consiste na reao das ligaes peptdicas das protenas com o on cprico, em meio alcalino, resultando em um complexo de cor violeta com mxima absorbncia em 540nm, cuja intensidade proporcional a concentrao de protenas totais da amostra. As leituras espectofotomtricas foram realizadas utilizando um Espectrofotmetro RA 50 (Bayer Diagnsticos). ELETROFORESE DE PROTENAS EM ACETATO DE CELULOSE A eletroforese de protenas foi realizada utilizando como suporte a fita de acetato de celulose (Biomidi) em tampo Tris-Veronal (5,0 g/L), pH 8,6-8,8. A amostra foi submetida ao de um campo eltrico em cuba eletrofortica Tecnow, durante 40 minutos. Decorrido o tempo de migrao a fita foi corada em soluo de Ponceau S 0,5 g/L, por 8 minutos e posteriormente descorada em soluo de cido actico a 5%. A transparentizao da fita foi realizada incubando em metanol p.a por 1 minuto, em seguida em soluo de metanol : cido cetico : glicerina (21,25mL : 3,5mL : 0,25mL) por 2 minutos, sendo finalmente seca por 5 minutos 60C (estufa Fanen Mod 3155E). A determinao do perfil eletrofortico e das concentraes das fraes proticas foi realizada em um Densitmetro BioSystems BTS-235. RESULTADOS E DISCUSSO A avaliao dos proteinogramas obtidos das 98 amostras de soro de crianas atendidas no HOSPED UFRN, revelou um quadro heterogneo que, assim possibilitou dividir os pacientes em 3 grupos: Grupo I Pacientes que apresentaram perfil compatvel com um processo inflamatrio de reao aguda; Grupo II Pacientes que apresentaram perfil compatvel com um processo crnico e Grupo III Pacientes com valores normais (Figura 2).

tadas pelos pacientes, cujas patologias alteram os nves de protenas plasmticas (8,15), como por exemplo febre indeterminada, colangite esclerosante, vasculopatia perifrica, hepatopatias e infeces, alm de outras que levaram perdas proticas como na sndrome nefrtica e em patologias do trato gastrointestinal, como a gastroenteropatia exudativa com perdas fecais de protenas. Por outro lado, a hiperproteinemia poder ser observada atravs da relao albumina/globulina, que poder estar normal (2 : 1) ou alterada (11,14,15). Nos processos onde foi observado hemoconcentrao esta relao albumina/globulina permaneceu normal, sendo este quadro caracterstico de vmitos e diarria difusa, toxicose, insuficincia supra-renal aguda, queimaduras, coma diabtico e sndrome pilrica. Resultados apresentados por Graninger et al. (1992) relataram alteraes no padro de protenas de fase aguda em pacientes infectados pelo Plasmodium falciparum, agente etiolgico da malria, atravs do aumento de protena C reativa, alfa-1 antitripisina, haptoglobina, alfa-1-glicoprotena cida, em contraste com a diminuio da albumina, transferrina e pr-albumina. Os autores sugeriram que a determinao de protenas de fase aguda tambm representa um acesso valioso resposta ao tratamento A Figura 3 mostra um perfil representativo do grupo I, que apresentou um aumento caracterstico das fraes alfa 1 e alfa 2 globulinas. Como pode ser observado, um quadro visvel de fase aguda com diminuio da concentrao de albumina e aumento moderado da frao das globulinas, inclusive da gama. Embora a concentrao das protenas totais - 7,0g/dL tenha apresentado um valor dentro da mdia do valor de referncia, este um caso caracterstico de compensao entre as fraes uma vez que a concentrao de albumina est diminuda e das globulinas aumentada. Estes resultados reforam que as alteraes observadas na concentrao das protenas de fase agudas tm o objetivo de restaurar a homeostase aps uma injria, necrose tecidual ou infeces, e embora o padro de respostas das protenas individuais possa diferir em relao ao tipo de doena, as alteraes observadas nas concentraes plasmticas so geralmente indicadoras de inflamao.

Figura 2: Percentual de pacientes que apresentaram um perfil eletrofortico correspondente a: Processos Inflamatrios agudos (G-I), Processos crnicos (G-II) e Proteinograma normal (G-III).

Figura 3: Perfil eletrofortico de paciente atendido no HOSPED/UFRN, correspondente ao Processo inflamatrio agudo.

O Grupo I, representado por 51 das 98 amostras estudadas, representa o grupo de crianas que apresentaram o perfil onde predominam nveis diminudos de albumina e elevao dos nveis das fraes alfa-1 e alfa-2. J a frao gama globulina apresentou um nvel normal ou moderadamente aumentado em relao aos parmetros normais. Neste grupo, foi possvel observar alguns casos de hipoproteinemia em acordo com as indicaes clnicas apresenRBAC, vol. 37(4): 239-242, 2005

Para o Grupo II, representado por 32 (32,66%) das amostras analisadas, os resultados revelaram um perfil eletrofortico caracterstico de processo crnico, onde se observa um aumento no nvel das gama globulinas, acompanhado de reduo da frao albumina, nveis normais de 1 e 2 e nveis variados de frao globulina. A variao nos nveis da frao beta globulina foi geralmente aliada a indicao clnica, estando diminuda para casos de hepatite viral e insuficincia heptica. O aumento da frao globulina, que leva a alterao da re241

lao albumina/globulina, geralmente caracterstico de processos infecciosos ou parasitrios de evoluo crnica, linfogranuloma inguinal, em muitos casos de lepra, na polioartrite crnica, na cirrose esplenomeglica, na macroglobulinemia de Waldenstrom, mieloma mltiplo, endocardite lenta, algumas vezes no mixedema e na hiperproteinemia essencial (11,14). A Figura 4 apresenta um perfil eletrofortico com diminuio na frao albumina e -globulina e um aumento da frao gamaglobulina. Entre os casos analisados e classificados no Grupo II esto as indicaes clnicas especficas de gamopatias policlonais como hepatite autoimune, piodermite de repetio, edema e artrite reumatide, as quais revelaram aumentos especficos das gamaglobulinas.

trios agudo e crnicos, doenas hepticas, deficincias de anticorpos, diferenciar gamopatias monoclonais e policlonais, alm de permitir monitorar respostas terapia.

Figura 6: Freqncia de Processos Agudos e Crnicos e de alteraes isoladas das fraes proticas, obtidos a partir da anlise do perfil eletrofortico em 98 pacientes, atendidos no Hospital de Pediatria

AGRADECIMENTOS Universidade Federal do Rio Grande do Norte UFRN atravs do Departamento de Anlises Clnicas e Toxicolgicas DACT e do Laboratrio Integrado de Anlises Clnicas LIAC pelo apoio financeiro. Aos colegas do setor de Bioqumica pelo apoio, incentivo e colaborao.
Figura 4: Perfil eletrofortico de paciente atendido no HOSPED/UFRN, correspondente ao Processo crnico.

REFERNCIAS
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O Grupo III, onde esto compreendidas 11 (11,22%) das amostras trabalhadas, no foram observadas variaes nas concentraes das fraes proticas, mostrando um padro eletrofortico normal, quando comparado aos padres descritos anteriormente. Entre os quadros clnicos apresentados por este grupo esto colestase neonatal e anemia. Para representar o grupo III um perfil eletrofortico de um paciente de 2 anos foi selecionado, uma vez que apresentou valores relativo e absoluto normais para as 5 fraes proticas, como mostra a Figura 5.

Figura 5: Perfil eletrofortico de paciente atendido no HOSPED/UFRN, correspondente ao proteinograma normal.

Em relao aos 4 pacientes no enquadrados nos grupos acima descritos, observou-se situaes isoladas com nveis diminudos apenas das fraes alfa 1 e alfa 2 globulinas (2,04%), nveis diminudos apenas da frao albumina (1,02%) ou aumento apenas da frao beta (1,02%). A Figura 6 mostra uma avaliao geral dos resultados obtidos expressando a freqncia de processos agudos e crnicos e as alteraes isoladas das fraes proticas, nos 98 pacientes estudados. Estes resultados conferem eletroforese das protenas plasmticas uma ferramenta importante para identificar e monitorar alteraes malignas, indicar processos inflama242

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ENDEREO PARA CORRESPONDNCIA: Prof. Dr. Adriana. A. Rezende - Faculdade de Farmcia - Departamento de Anlises Clnicas e Toxicolgicas / Centro de Cincias da Sade / Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Rua Gustavo Cordeiro de Faria, sn Petrpolis, CEP 59010-180 - Natal, RN. Brasil. [Telefone 84 215 4377; Fax: 84 215 5549; e-mail: adrirezende@yahoo.com

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