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Quim. Nova, Vol. 35, No.

6, 1228-1232, 2012

Nota Tcnica

DESENVOLVIMENTO E VALIDAO DE MTODOS ANALTICOS PARA DETERMINAO DE CIDO GLICIRRZICO, CIDO SALICLICO E CAFENA EM NANOPARTCULAS DE QUITOSANA E ALGINATO Monika P. Tagliari*, Andra Granada, Gislaine Kuminek, Hellen K. Stulzer e Marcos A. S. Silva Departamento de Cincias Farmacuticas, Centro de Cincias da Sade, Universidade Federal de Santa Catarina, 88040-900 Florianpolis - SC, Brasil Recebido em 9/9/11; aceito em 20/12/11; publicado na web em 2/3/12

DEVELOPMENT AND VALIDATION OF ANALYTICAL METHOD FOR DETERMINATION OF GLYCYRRHIZIC ACID, SALICYLIC ACID, AND CAFFEINE IN CHITOSAN-ALGINATE NANOPARTICLES. The present work consists of the development and validation of analytical method for evaluation of glycyrrhizic acid, salicylic acid, and caffeine in chitosan-alginate nanoparticles by high performance liquid chromatography. Method validation investigated parameters such as linearity, precision, accuracy, robustness and specificity, which gave results within the acceptable range. The methods were applied to nanoparticles suspensions containing the drugs and were able to determine the entrapment efficiency successfully. The best entrapment efficiency was achieved with the glycyrrhizic acid (95.4%). Keywords: method validation; high performance liquid chromatography; nanoparticles.

INTRODUO As nanopartculas podem ser definidas como partculas slidas coloidais com tamanho inferior a 1,0 m, que carreiam a substncia ativa, e podem ser preparadas por meio de vrios mtodos fsico-qumicos.1 Na tcnica de coacervao complexa, tambm chamada de complexao de polieletrlitos, ocorre a interao de dois ou mais polieletrlitos carregados opostamente induzida por modificaes no meio.2 Esta tcnica particularmente interessante, pois polieletrlitos polimricos so biodegradveis e degradam lentamente, no alteram a funo celular e utilizam gua como solvente, o que uma grande vantagem para produtos farmacuticos.3 Na literatura so descritos diversos trabalhos utilizando os polmeros quitosana e alginato de sdio na formao de nanopartculas por meio de polimerizao ou interao inica.4-8 A quitosana um copolmero formado por unidades de 2-desoxi-N-acetil-D-glucosamina e 2-desoxi-D-glucosamina, obtida a partir da desacetilao da quitina em meio alcalino.9 um polieletrlito catinico que possui grupamentos amino ao longo de sua cadeia, os quais tm um pKa entre 6-6,5.10 O alginato de sdio um sal de cido algnico e um polmero aninico solvel em gua. O cido algnico extrado de algas marinhas pardas, formado de resduos de cido -D-manurnico e cido -L-gulurnico.11 O sistema nanoparticulado contendo quitosana e alginato de sdio desenvolvido neste trabalho foi utilizado para encapsulao de trs frmacos com caractersticas fsico-qumicas diferentes: cido glicirrzico, cido saliclico e cafena (Figura 1). O cido glicirrzico ((3, 20)-20-carboxi-11-oxo-30-norlean12-en-3-il-2-o--17-glucopiranuronosil--D-cido glucopiranosidurnico) o principal componente ativo da raiz de alcauz (Glycyrrhiza uralensis, Fisch).12 um cido fraco solvel em gua com trs valores de pKa (pKa1 = 2,7; pKa2 = 2,8; pKa3 = 4,7).13 Possui massa molar de 822,92 g/mol e frmula molecular C42H62O16. O extrato de alcauz pode conter de 10 a 25% de cido glicirrzico.14 O cido saliclico (cido 2-hidroxibenzoico) um beta-hidroxi cido com valor de pKa de 2,8, o que o torna um cido fraco, solvel em gua, apresentando atividade anti-inflamatria e antimicrobiana.15
*e-mail: monikatag@gmail.com

Figura 1. Estrutura qumica do cido glicirrzico (A); cido saliclico (B) e cafena (C)

Possui massa molar de 138,1 g/mol e frmula molecular C7H6O3.16 A cafena (1,3,7-trimetilxantina) um estimulante do sistema nervoso central e diurtico, sendo tambm aplicada externamente em formulaes tpicas. uma base fraca, solvel em gua e apresenta pKa de 8,3.17 Possui massa molar de 194,2 g/mol e frmula molecular C8H10N4O2.16 A quantificao do cido glicirrzico, do cido saliclico e da cafena em diferentes sistemas de liberao j foi realizada com sucesso atravs de tcnicas como espectrofotometria UV-vis, espectrofluorescncia e cromatografia lquida de alta eficincia.18-25 Entretanto, por se tratar de um novo sistema nanoparticulado, diferentes mtodos analticos utilizando cromatografia lquida de alta eficincia foram desenvolvidos para a quantificao dos frmacos. Aps o desenvolvimento de um mtodo e antes de sua aplicao na anlise de amostras de interesse, o mesmo precisa ser validado, de forma que, nas condies em que ser utilizado, gere os resultados esperados.26,27 Consequentemente, o objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar mtodos analticos para a determinao dos cidos glicirrzico e saliclico e da cafena em nanopartculas de quitosana e alginato de sdio obtidas atravs da tcnica de complexao de polieletrlitos.

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Desenvolvimento e validao de mtodos analticos

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PARTE EXPERIMENTAL Materiais A quitosana (QUI; 122,3 kg/mol, grau de desacetilao: 85%) foi obtida da empresa Purifarma (So Paulo, Brasil). O alginato de sdio (ALG; 200,0 kg/mol) e o tripolifosfato de sdio (TPP) foram obtidos da Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemanha). O cido glicirrzico (AG) e o cido saliclico (AS) foram obtidos da DEG (So Paulo, Brasil), e a cafena (CF) da Valdequmica (So Paulo, Brasil). Os frmacos foram previamente analisados quanto a sua identidade e pureza e foram utilizados como padres de referncia secundrios. A gua purificada foi obtida atravs de sistema Milli-Q (Millipore Corporation). A acetonitrila e o metanol utilizados foram grau CLAE (Tedia). Outros solventes e reagentes empregados foram de grau analtico. Equipamento As anlises foram realizadas por cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) utilizando um cromatgrafo Shimadzu LC-10A (Kyoto, Japo), equipado com bombas LC-10AD, detector UV/VIS SPD-10AVVP, detector de arranjo de fotodiodos SPD-M10AVP, unidade de controle SCL-10AVP, autoinjetor Jasco AS-2055 Plus e software Class VP V 6.14. Preparao de nanopartculas Inicialmente foram preparadas solues estoque de QUI (2,0 mg/ mL) em cido actico 1,0% (v/v) e de ALG (2,0 mg/mL) e TPP (5,0 mg/mL) em gua. As solues foram filtradas a vcuo. O processo de formao das nanopartculas foi realizado a 25 C, sob agitao magntica, em um nico estgio. Para cada frmaco, foi preparada uma soluo de 1,0 mg/mL em gua. Gotejaram-se 6,0 mL de cada soluo de frmaco em 24 mL de soluo de QUI (0,9 mg/mL), sob agitao magntica. A esta soluo adicionaram-se 6,0 mL de soluo contendo ALG (1,2 mg/mL) e TPP (1,0 mg/mL). As suspenses de nanopartculas foram mantidas sob agitao magntica por 1 h e filtradas em papel de filtro. As formulaes foram nomeadas conforme o frmaco utilizado: NPAG (nanopartculas com cido glicirrzico), NPAS (nanopartculas com cido saliclico) e NPCF (nanopartculas com cafena). Preparao das solues estoque de frmacos As solues estoque (1,0 mg/mL) de AG, AS e CF foram preparadas dissolvendo-se 25,0 mg de cada frmaco em sua respectiva fase mvel, em balo volumtrico de 25 mL. A partir destas solues foram preparadas as solues de trabalho atravs de diluies com a fase mvel correspondente ao frmaco analisado. Desenvolvimento do mtodo para quantificao do cido glicirrzico Para quantificao do cido glicirrzico (AG) foi utilizada uma coluna de fase reversa C18 Phenomenex Luna (250 x 4,6 mm, 5 m) e o sistema mantido temperatura de 25 1 C. Uma pr-coluna (4,0 x 3,0 mm) foi utilizada para proteger a coluna analtica. A fase mvel consistiu numa mistura de metanol:tampo fosfato de potssio 0,025 M (60:40 v/v) adicionada de 5 mM de cloreto de tetrabutilamnio. As anlises foram realizadas em modo isocrtico, com fluxo de 1,2 mL/min, deteco UV a 254 nm e volume de injeo de 20 L.

Desenvolvimento do mtodo de quantificao do cido saliclico Para quantificao do cido saliclico (AS) foi utilizada uma coluna de fase reversa C18 Phenomenex Luna (250 x 4,6 mm, 5 m) e o sistema mantido temperatura de 25 1 C. Uma pr-coluna (4,0 x 3,0 mm) foi utilizada para proteger a coluna analtica. A fase mvel consistiu numa mistura de metanol:gua (70:30 v/v) ajustada a pH 2,6. As anlises foram realizadas em modo isocrtico, com fluxo de 1,0 mL/min, deteco UV a 237 nm e volume de injeo de 20 L. Desenvolvimento do mtodo de quantificao da cafena Para quantificao da cafena (CF) foi utilizada uma coluna de fase reversa C8 Perkin-Elmer (150 x 4,6 mm, 5 m) e o sistema mantido temperatura de 25 1 C. A fase mvel consistiu numa mistura de H3PO4 0,01 M (ajustado a pH 2,8 com trietilamina):acetonitrila (90:10 v/v). As anlises foram realizadas em modo isocrtico, com fluxo de 1,0 mL/min, deteco UV a 262 nm e volume de injeo de 20 L. Validao dos mtodos O processo de validao foi realizado para cada mtodo analtico desenvolvido atravs dos seguintes parmetros, de acordo com a ICH (International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use),28e resoluo da ANVISA RE n 899:26 especificidade, linearidade, exatido, preciso, robustez e limites de quantificao e deteco. Especificidade Para confirmar a especificidade do mtodo, foi visualizada a ausncia de interferncias pelos excipientes que fazem parte das nanopartculas (QUI, ALG e TPP). Foram preparadas nanopartculas sem o frmaco (placebo) e analisadas nas mesmas circunstncias experimentais das amostras na presena do frmaco. Alm disso, a pureza do pico cromatogrfico de cada frmaco foi obtida com auxlio de um detector de arranjo de fotodiodos. Linearidade e limites de deteco (LD) e quantificao (LQ) A linearidade foi determinada atravs da construo de trs curvas de calibrao para cada frmaco, em 3 dias diferentes. Para a construo de cada curva de calibrao 6 concentraes de cada frmaco (5,0; 10,0; 25,0; 50,0; 75,0 e 100,0 g/mL) foram preparadas nas suas respectivas fases mveis. Foram realizadas 3 injees de 20 L de cada soluo para verificar a repetibilidade da resposta do detector em cada concentrao. O limite de deteco (LD) corresponde menor concentrao presente na amostra que pode ser detectada, mas no necessariamente quantificada. O limite de quantificao (LQ) corresponde menor concentrao que pode se determinada quantitativamente com aceitvel preciso e exatido. Os LD e LQ foram calculados a partir da inclinao e do desvio padro do intercepto da mdia de trs curvas de calibrao. Exatido A exatido do mtodo foi avaliada por meio da contaminao de amostras de suspenses de nanopartculas (placebo) com solues de concentrao conhecida de cada frmaco, correspondendo a concentraes finais de 40,0; 50,0 e 60,0 g/mL. A recuperao foi determinada como sendo a diferena percentual entre a concentrao experimental mdia e a concentrao terica em cada nvel.

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Preciso A preciso foi determinada por meio da repetibilidade (intradia) e preciso intermediria (interdia). A repetibilidade foi avaliada analisando-se 6 amostras de nanopartculas (placebo) contaminadas com solues de cada frmaco, correspondendo concentrao final de 50,0 g/mL, no mesmo dia, nas mesmas condies experimentais. Na preciso intermediria as anlises foram realizadas em 3 dias diferentes. Robustez A robustez do mtodo foi determinada atravs da anlise de uma mesma amostra de nanopartculas (placebo) contaminada com solues de cada frmaco (50,0 g/mL), modificando-se os seguintes parmetros do mtodo: temperatura do forno, fluxo e composio da fase mvel. Determinao da eficincia de encapsulao, teor e recuperao A determinao da concentrao total de ativo associado s nanopartculas foi realizada pela tcnica de ultrafiltrao/centrifugao, na qual o ativo livre foi determinado no sobrenadante, enquanto o ativo total foi medido aps completa dissoluo das nanopartculas.29 Para obter o sobrenadante, 0,5 mL de suspenso de nanopartculas foram centrifugadas a 6.000 rpm, durante 20 min, em unidades de centrifugao Amicon Ultra-0,5 (Ultracel-100 K 100000 MW; Millipore, Irlanda). Para a determinao da concentrao total de frmaco na suspenso de nanopartculas, 1,0 mL de cada suspenso foi mantida em contato com 1,0 mL de metanol durante 24 h para completa dissoluo do complexo, seguida da diluio com a fase mvel correspondente para cada frmaco at volume de 10,0 mL (concentrao total). A concentrao de frmaco no sobrenadante e a concentrao total na suspenso foram determinadas por CLAE. A eficincia de encapsulao (EE %) foi estimada de acordo com a Equao 1. (1)

Nas condies otimizadas, o tempo de reteno do AG foi cerca de 20,0 min e um cromatograma tpico obtido pelo mtodo pode ser visualizado na Figura 2a.

Figura 2. Cromatogramas obtidos utilizando fase mvel constituda por metanol:tampo fosfato de potssio 25,0 mM (60:40 v/v) adicionada de 5,0 mM de tetrabutilamnio sob fluxo de 1,2 mL/min e deteco UV a 254 nm. (a) Suspenso de nanopartculas de cido glicirrzico e (b) suspenso de nanopartculas de placebo

Desenvolvimento do mtodo para quantificao do cido saliclico O cido saliclico (AS) um cido fraco com valor de pKa prximo a 3,0, sendo necessria uma anlise cuidadosa das condies cromatogrficas de forma que, no momento da anlise, esteja em sua forma no ionizada.15 O ajuste do pH da fase mvel para 2,6 foi suficiente para a obteno de uma boa assimetria de pico, com um tempo de reteno de cerca de 5,1 min. A Figura 3 apresenta um cromatograma tpico obtido pelo mtodo desenvolvido.

em que: CT = concentrao total de frmaco encontrada na suspenso aps dissoluo das nanopartculas; CS = concentrao de frmaco encontrada no sobrenadante. O teor de frmaco nas suspenses foi expresso em g/mL. A taxa de recuperao (%) de cada frmaco foi calculada como sendo a diferena percentual entre a quantidade inicialmente adicionada e aquela encontrada nas suspenses. RESULTADOS E DISCUSSO Desenvolvimento do mtodo para quantificao do cido glicirrzico O cido glicirrzico (AG) um cido fraco com trs valores de pKa (pKa1 = 2,7; pKa2 = 2,8; pKa3 = 4,7).13 Assim, um composto altamente ionizvel que tende a apresentar caudas pronunciadas no pico cromatogrfico, coeluio, e ser pouco retido em fase reversa, pois a forma ionizada tem maior afinidade pela fase mvel (mais polar). Desta forma, vrias condies cromatogrficas foram propostas para que apenas uma das formas da substncia estivesse presente no momento da anlise, na tentativa de se obter melhor assimetria e pureza do pico. Isto foi alcanado atravs da cromatografia com formao de pares de ons, onde o analito foi mantido na forma inica, e um contraon (tetrabutilamnio) foi adicionado fase mvel. A melhor assimetria foi obtida com uma fase mvel contendo metanol, tampo fosfato de potssio 25,0 mM (pH 5,8) e tetrabutilamnio 5,0 mM.
Figura 3. Cromatogramas obtidos utilizando fase mvel constituda por metanol:gua (70:30 v/v) pH 2,6 sob fluxo de 1,0 mL/min e deteco UV a 237 nm. (a) Suspenso de nanopartculas de cido saliclico e (b) suspenso de nanopartculas de placebo

Desenvolvimento do mtodo para quantificao da cafena A cafena (CF) uma base fraca que apresenta valor de pKa prximo de 8,5. Inicialmente o mtodo foi desenvolvido com uma coluna C18 e a fase mvel foi ajustada para vrios valores de pH. Entretanto, o pico cromatogrfico do frmaco apresentou uma cauda em todas as propores testadas de solventes e pHs da fase mvel. Por ser uma base fraca, a cafena pode apresentar uma interao

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com os grupamentos silanis residuais da superfcie da slica da fase estacionria, levando formao de cauda.17 Algumas alternativas para evitar que isto ocorra so reduzir a ionizao dos grupamentos silanis utilizando fase mvel com pH < 4,0, ou diminuir a ionizao do analito bsico atravs do aumento do pH da fase mvel. Por outro lado, podem ser adicionados fase mvel os chamados bloqueadores de silanol como, por exemplo, a trietilamina. Alm disso, o uso de uma coluna de fase reversa C8 acarreta menor atividade dos grupamentos silanis. Desta forma, as condies cromatogrficas inicialmente propostas foram otimizadas utilizando-se uma coluna C8 e trietilamina para o ajuste do pH da fase aquosa em 2,8. Nestas condies, a cafena encontra-se na forma no ionizada e os grupamentos silanis esto bloqueados, eliminando a cauda do pico cromatogrfico. O tempo de reteno obtido para a cafena foi de 4,4 min. A Figura 4 mostra um cromatograma tpico obtido pelo mtodo desenvolvido.

Linearidade e limites de deteco (LD) e quantificao (LQ) A linearidade da resposta do detector foi calculada para vrias solues padro na faixa de 5,0-100,0 g/mL. Na Tabela 1 esto descritos a equao da reta, coeficiente de correlao (r) e limites de deteco (LD) e quantificao (LQ) obtidos para cada mtodo desenvolvido.
Tabela 1. Resultados da linearidade obtidos a partir de trs curvas dos frmacos avaliados individualmente (cido glicirrzico, cido saliclico e cafena) nas condies dos mtodos validados Frmaco AG AS CF
a

Equao da retaa y = 7511,6x6284,8 y = 67628x43533 y = 37788x+23000

r 1,0 0,9999 0,9999

LD (g/mL) 1,18 4,03 0,21

LQ (g/mL) 0,39 1,33 0,07

equao da reta mdia obtida de trs curvas.

A validade dos ensaios foi confirmada atravs de anlise de varincia, que demonstrou que a regresso linear foi significativa e o desvio da linearidade no significativo (P < 0,01) nos trs mtodos avaliados. Exatido e preciso A exatido foi calculada a partir da determinao de 3 replicatas de 3 diferentes suspenses de nanopartculas (placebo) contaminadas com cada frmaco. No foram observadas diferenas entre a quantidade adicionada de frmacos e as quantidades encontradas (P = 0,05), indicando a exatido dos mtodos (Tabela 2). Os resultados da preciso intradia e interdia esto tambm descritos na Tabela 2. Os teores dos frmacos encontrados nos 3 diferentes dias foram equivalentes (P = 0,05) e os valores de desvio padro relativo esto dentro do critrio de aceitao de 5%, demonstrando a preciso dos mtodos. Robustez A avaliao da robustez dos mtodos desenvolvidos foi realizada atravs de variaes na temperatura da coluna, no fluxo e composio da fase mvel. Em todos os mtodos as colunas utilizadas foram avaliadas modificando-se a temperatura do forno para 20, 25, e 30 C. O efeito do fluxo da fase mvel foi avaliado nas seguintes condies: 1,1; 1,2 e 1,3 mL/min para o AG; 0,8; 1,0, e 1,2 mL/min para o AS e para a CF. A composio da fase mvel foi modificada de acordo com o mtodo. Para o mtodo do AG a quantidade de metanol testada foi de 58, 60 e 62%, enquanto que para o AS foi de 68, 70 e 72%. Para a CF a % de acetonitrila da fase mvel foi de 8, 10 e 12%.

Figura 4. Cromatogramas obtidos utilizando fase mvel constituda por H3PO4 0,01 M (ajustado a pH 2,8 com trietilamina):acetonitrila (90:10 v/v) sob fluxo de 1,0 mL/min e deteco UV a 262 nm. (a) Suspenso de nanopartculas de cafena e (b) suspenso de nanopartculas de placebo

Validao dos mtodos Especificidade Os cromatogramas das solues amostra (a) e das solues placebo (b) obtidos com os mtodos desenvolvidos para quantificao do AG, do AS, e da CF esto apresentados nas Figuras 2, 3 e 4, respectivamente. Os resultados demonstram que no houve interferncia ou sobreposio dos excipientes com o pico dos frmacos. Adicionalmente, a especificidade foi confirmada atravs detector de arranjo de fotodiodos, que demonstrou que os picos dos frmacos no possuem coeluio de nenhum pico adicional, com valores de pureza de pico maiores que 0,9999.

Tabela 2. Resultados de exatido e preciso obtidos com cada mtodo desenvolvido AG Concentrao adicionada (g/mL) 40,0 50,0 60,0 Preciso interdia
a

AS Recuperaoa (%) DPRc % 101,1 0,7 102,0 0,6 101,2 0,6


c

CF Recuperaoa (%) DPRc % 100,5 1,2 101,2 0,9 101,6 0,4


c

Recuperaoa (%) DPRc % 101,9 1,2 98,4 0,6 98,2 0,6 % Recuperado DPR (%)

% Recuperado DPR (%) 98,5 0,9 99,3 0,3 100,2 0,4 100,1 1,4

% Recuperado DPRc (%) 101,9 1,1 99,9 1,1 99,4 1,2 101,8 1,9

Dia 1 Dia 2 Dia 3

99,8 0,9 98,2 0,5 98,9 0,6 98,9 1,8

Preciso intradiab
a

mdia de 3 replicatas; bmdia de 6 replicatas; cdesvio padro relativo

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Tabela 3. Resultados de eficincia de encapsulao (EE), teor e recuperao obtidos com as suspenses de nanopartculas contendo cido glicirrzico (NPAG), cido saliclico (NPAS) ou cafena (NPCF) Formulao NPAG NPAS NPCF
a

EEa (%) DPRb (%) 95,4 1,7 4,0 5,8 3,0 6,3

Teora (g/mL) DPRb (%) 113,4 2,9 163,9 4,6 161,2 5,3

Recuperaoa (%) DPRb (%) 68,3 2,5 98,3 3,1 96,6 4,0

mdia de 3 replicatas; bdesvio padro relativo

No foram verificadas diferenas estatisticamente significativas nos teores de frmaco encontrados nas condies testadas (P = 0,05) e os valores de desvio padro relativo esto dentro do critrio de aceitao de 5%, indicando a robustez dos mtodos. As variaes na fase mvel resultaram em pequenas mudanas no tempo de reteno, sem nenhum efeito na quantificao dos frmacos. Aplicao dos mtodos para determinao da eficincia de encapsulao e do teor de frmaco As suspenses de nanopartculas foram submetidas anlise por CLAE utilizando os mtodos previamente validados para determinao da eficincia de encapsulao, teor e recuperao de frmaco. Os resultados esto descritos na Tabela 3. A formulao NPAG apresentou maior EE, provavelmente relacionada s caractersticas fsico-qumicas do frmaco, como o alto peso molecular e a presena de trs grupamentos carboxlicos em sua estrutura, que permitiram uma maior interao eletrosttica com a QUI. Por outro lado, apesar de possuir grupos carboxlicos disponveis para interao, o AS no complexou de forma satisfatria com a QUI, apresentando baixa EE. A CF no possui grupamentos carboxlicos em sua estrutura, entretanto poderia ser encapsulada fisicamente pela rede de aprisionamento formada pelo ALG e TPP. Porm, a formulao NPCF tambm apresentou baixa EE. Como o AS e a CF apresentam maior solubilidade em meio aquoso do que o AG, uma possvel explicao para estes resultados que o AS e a CF no esto associados s nanopartculas, mas dissolvidos no meio, o que reflete o maior teor e recuperao de frmaco nas formulaes NPAS e NPCF. CONCLUSO Os mtodos analticos propostos para deteco e quantificao de cido glicirrzico, cido saliclico e cafena por CLAE mostraram-se especficos, lineares, exatos, precisos e robustos na faixa de concentrao entre 5,0 e 100,0 g/mL, sendo adequados para se determinar a eficincia de encapsulao e o teor dos frmacos em nanopartculas de quitosana e alginato de sdio. Atravs dos resultados de eficincia de encapsulao pode-se concluir que o cido glicirrzico possui as caractersticas fsico-qumicas ideais para ser encapsulado neste sistema nanoparticulado. REFERNCIAS
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