Aminocidos e protenas

Aurenvia Bonifcio
aurenivia@uft.edu.br

UFT - Gurupi

Aminocidos
Caractersticas bsicas -grupo carboxila + grupo amino no carbono -diferem em suas cadeias laterais (grupos R)

Asparagina 1 aminocido descoberto (1806)

Treonina 20 AA descoberto (1938)

Funes dos aminocidos

Componentes de: Peptdeos Protenas Fosfolipdeos Percussores de: Cetocidos Aminas biognicas Glicose Nucleotdeos Heme, Creatina

Neurotransmissores:

Molculas de transporte para:

Glutamato Aspartato Glicina L-aminocido

Grupos NH2

Classificao dos aminocidos

1. Quanto a isomeria ptica: -Ismeros do tipo D e L

Projeo de Fischer

L-Gliceraldedo

D-Gliceraldedo

L-aminocido

D-aminocido

Classificao dos aminocidos

2. Quanto a essencialidade nutricional - Essencial obtidos pela dieta - No-essencial sintetizados pelo organismo
Essencial No-essencial
O C HO NH2
Glicina

Fenilalanina
Histidina

Alanina
Arginina

CH2

O C HO NH 2 CH

CH 3 CH
Valina

Isoleucina
Leucina

Aspartato
Asparagina

CH 3

Lisina
Metionina

Cistena
Glicina

O C HO NH2
O C HO NH 2 CH

O CH CH2 CH2 C NH2

Glutamina

Treonina
Triptofano

Glutamato
Glutamina

Valina

Prolina
Serina Tirosina

CH 3 CH CH 2 CH 3

Isoleucina

Classificao dos aminocidos

3. Quanto a polaridade da cadeia lateral - No polares ou polares (no carregado ou carregado)
No-polar, alifticos Aromticos
No polar Relativamente no polares Glicina Alanina Prolina

Fenilalanina Metionina

Tirosina
Valina Leucina Isoleucina Triptofano

Classificao dos aminocidos

3. Quanto a polaridade da cadeia lateral - No polares ou polares (no carregado ou carregado)
Polar, no carregados Polar, carregados
Aspartato Glumato Asparagina

Glutamina
Cistena

Serina

Histidina

Treonina

Arginina

Lisina

Propriedades dos aminocidos

Aminocidos Grupo R alifticos, no polares Glicina Alanina Prolina Gly Ala Pro G A P 75 89 115 2,34 2,34 1,99 9,60 9,69 10,96 5,97 6,01 6,48 Abreviao Mr
(-COOH)

pK1

(-NH3+)

pK2

(grupo R)

pKR

pI

Valina
Leucina

Val
Leu

V
L

117
131

2,32
2,36

9,62
9,60

5,97
5,98

Isoleucina
Metionina Grupos R aromticos

Ile
Met

I
M

131
149

2,36
2,28

9,68
9,21

6,02
5,74

Fenilalanina
Tirosina

Phe
Tyr

F
Y

165
181

1,83
2,20

9,13
9,11 10,07

5,48
5,66

Triptofano

Trp

204

2,38

9,39

5,89

Propriedades dos aminocidos

Aminocidos

Abreviao

Mr

(-COOH)

pK1

(-NH3+)

pK2

(grupo R)

pKR

pI

Grupo R no carregados, polares

Serina Treonina Cistena Asparagina Glutamina Ser Thr Cys Asn Gln S T C N Q 105 119 121 132 146 2,21 2,11 1,96 2,02 2,17 9,15 9,62 10,28 8,80 9,13 8,18 5,68 5,87 5,07 5,41 5,65

Propriedades dos aminocidos

Aminocidos Grupos R carregados positivamente Abreviao Mr
(-COOH)

pK1

(-NH3+)

pK2

(grupo R)

pKR

pI

Lisina
Histidina

Lys
His

K
H

146
155

2,18
1,82

8,95
9,17

10,53
6,00

9,74
7,59

Arginina
Grupos R carregados negativamente

Arg

174

2,17

9,04

12,48

10,46

Aspartato
Glutamato

Asp
Glu

D
E

133
147

1,88
2,19

9,60
9,67

3,65
4,25

2,77
3,22

Aminocidos incomuns

4-hidroxiprolina

Ornitina

Citrulina

5-hidroxilisina

Selenocistena

Desmosina

Aminocidos como cidos e bases

- Zwitterion = on hbrido - Anflitos - capaz de agir como cido ou como base - AA como cidos = doam prtons - AA como base = recebem prtons
AA como um cido: AA como uma base:

Carga lquida:

+1

-1

Curva de titulao da glicina

Curva para aminocidos com grupo R no ionizvel
Carga lquida: +1 Glicina 0 -1

pKa Medida de tendncia de um grupo perder prtons

OH- (equivalentes)

Curva de titulao da glicina

Curva para aminocidos com grupo R no ionizvel
Carga lquida: +1 Glicina 0 -1

pI ponto isoeltrico, onde a carga lquida zero pI = pK1 + pK2 2 pH < pI Carga lquida positiva pH > pI Carga lquida negativa
OH- (equivalentes)

Curvas de titulao da histidina

AA com grupo R ionizveis possuem curvas com trs estgios

pH 0.5

pH 5

pH 7.6 (Ponto isoeltrico)

pH 11

Carga lquida

Protenas

Caractersticas gerais

- Polmeros de aminocidos unidos por ligaes peptdicas

- Peso molecular acima de 10.000 Dalton (Da)

Protenas

Caractersticas gerais

- So estabilizadas por pontes dissulfeto e pelas interaes fracas no covalentes (pontes de hidrognio e interaes inicas)

Classificao das protenas

- Quanto ao nmero de cadeias polipeptdicas Monomricas e Oligomricas - Quanto aos seus componentes associados Simples e Conjugadas
N-terminal Monomricas 2 C-terminal 1

2 C-terminal N-terminal Oligomricas

Classificao das protenas

- Quanto ao nmero de cadeias polipeptdicas Monomricas e Oligomricas - Quanto aos seus componentes associados Simples e Conjugadas
Classes Lipoprotena
Glicoprotena

Grupo prosttico Lipdeos

Carboidratos

Fosfoprotena
Hemoprotena

Grupos fosfato
Heme (Fe)

Flavoprotena
Metaloprotena

Nucleotdeo flavina
Ferro

Zinco
Clcio

Molibdnio
Cobre

Estrutura das protenas

Primria Indica a sequncia linear dos aminocidos

Secundria Os aminocidos interagem atravs de pontes de hidrognio

So -hlice e folha
folha

-hlice

Estrutura das protenas

Terciria Ocorrem interaes entre -hlice e folha
Quaternria Protenas com mais de uma cadeia de aminocidos

N-terminal C-terminal 2 1

Ligaes peptdicas
Estrutura rgida e planar Interaes de ressonncia Aprox. 40% de caracterstica de dupla ligao Conformao trans mais frequente que cis

ngulos de toro
Cadeia lateral
Amida plana

Cadeia principal

ngulos de toro ou ngulos de rotao

- CN - CC -So ambos definidos como 180 ou -180 -Aumenta em sentido horrio do C

Grupo lateral

Amida plana

Diagrama de Ramachandran
-Indica os ngulos de toro estericamente permitidos;
-Algumas estruturas secundrias j so prdeterminadas: - folha paralela - folha antiparalela - hlice (direita) C - hlice do colgeno L - hlice (esquerda)

Estrutura das protenas

A hlice

A folha
Antiparalela (conformao amino-carboxil oposta)

Paralela (conformao amino-carboxil igual)

6.5

Dobras
Conecta estruturas de hlice e folha Conecta folhas antiparalelas Envolve quatro resduos de AA onde o O do 1 se liga ao H do 4 AA Glicina e prolina so os AA mais frequentes

As protenas pode ser fibrosas ou globulares

-Queratina -Hlice com 5.1 -Rica em resduos de cistena -Rica em AA hidrofbicos
-hlice dobrada a direita

superhlice dobrada a esquerda

Filamento intermedirio protofilamento

As protenas pode ser fibrosas ou globulares

Colgeno -hlice orientada para esquerda -trs resduos de AA por passo

Cadeia

Estrutura secundria

As protenas pode ser fibrosas ou globulares

Fibrona da seda -Formada por cadeias polipeptdicas predominantemente em conformao -Rica em alanina e glicina -Estrutura mantida por numerosas interaes fracas

As protenas pode ser fibrosas ou globulares

Protenas globulares -Formada por diferentes arranjos de estruturas secundrias -Enzimas; protenas transportadoras, motoras e regulatrias; imunoglobulinas; entre outras.

Mioglobina

Padres estruturais em protenas globulares

Lao --

Quilha -

Conexes tpicas em um motivo totalmente

Conexo cruzada (no observada)

Padres estruturais em protenas globulares

Conexo orientada para direita entre cadeias

Conexo orientada para esquerda entre cadeias (muito rara)

Barril

Folha retorcida

Estrutura quaternria das protenas

- Protena multissubunitria ou multmero - Duas a centenas de subunidades - Oligmero - poucas subunidades - Protmero - unidade estrutural repetitiva
N-terminal 2 C-terminal 1

Funes das protenas

-Envolvem ligao reversvel com outras molculas -Ligante - molcula que se liga protena -Stio de ligao - complementar ao ligante (tamanho, forma, carga e carter hidroflico ou hidrofbico)
-Podem existir vrios stios de ligao -Exibem flexibilidade -Interao protena-ligante leva a alterao da conformao da protena

-A interao protena-ligante pode ser regulada

Mioglobina

-Protena ligante ao oxignio -Mr 14.600

Protenas de reconhecimento

MHC major histocompatibility complex

Complexo principal de histocompatibilidade

Separao das protenas

Centrifugao diferencial

Preparo do extrato bruto

Homogeneizador

Filtro

Fracionamento (tamanho e carga)

Tecido

Clulas inteiras, tecidos conectivos

tampo

Centrifugao

1. Centrifugao diferencial 2. Centrifugao pelo gradiente de densidade (isopcnica)

Tipos:

citosol
Sobrenadante Pellet

Ribossomos Macromolculas

Membrana plasmtica Fragmentos de RE Pequenas vesculas Frao microssomal

Mitocndria Lisossomos Peroxissomos (plantas; cloroplastos)

Ncleo Citoesqueleto

Separao das protenas

Preparo do extrato bruto
Centrifugao pelo gradiente de densidade

Centrifugao

Fracionamento (tamanho e carga)

1. Centrifugao diferencial 2. Centrifugao pelo gradiente de densidade (isopcnica)

Tipos:

Amostra Gradiente de sacarose Componente menos denso Componente mais denso Fracionamento

Purificao: precipitao com sal

Precipitao com sal

salting in

Solubilidade

Solubilidade maior com menor concentrao de sal

salting out

Solubilidade menor com maior concentrao de sal

Camada de hidratao

Concentrao de sal
Sobrenadante

Precipitado Protena alvo

salting out

Purificao: dilise
- Processo fsico-qumico - Separa as protenas do solvente - Baseado no tamanho das protenas

on

Protenas Saco de dilise

Soluo de protenas Soluo de protenas Saco de dilise

Soluo tampo

Agitador

Soluo tampo

No incio da dilise

No equilbrio

Purificao: cromatografia
- Interao diferencial dos seus componentes entre a fase estacionria (lquida/slida) e a fase mvel (lquida/gasosa)

A coluna cromatogrfica deve ser de material inerte: Carvo, slica, alumnio, fosfato de clcio, hidroxiapatita, etc...
- Beneficia-se das diferenas de carga, tamanho, afinidade de ligao e outras propriedades da protena

Classificao dos tipos de cromatografia

1. Quanto a forma fsica do sistema

Planar, em coluna, centrfuga

2. Segundo o modo de separao

Adsoro, partio, troca inica, afinidade

3. De acordo com a fase estacionria

Slida, liquida, quimicamente ligadas

4. Segundo a fase estacionria

Lquida, gasosa, supercrtica

Cromatografia de troca inica

As protenas so separadas de acordo com suas cargas aps passarem por uma coluna contendo ctions/nions e geralmente de celulose

A matriz utilizada deve ser:

- porosa - inerte - natural ou sinttica (compostos inorgnicos, resinas sintticas ou polissacardeos) - Insolvel em gua solventes orgnicos - Ligada covalentemente a trocadores inicos

Carga positiva lquida grande Carga positiva lquida Carga negativa lquida Carga negativa lquida grande

Trocadores inicos
+ + + + + + + + +

Trocador aninico com contra-ons trocavis

Trocador catinico com contra-ons trocavis

Os contra-ons podem ser trocados reversivelmente com outros ons sem alterar as propriedades da matriz

Trocadores aninicos Dietilaminoetil (DEAE) Aminoetil quaternrio (QAE) Amnio quaternrio (Q) Trietilaminoetil (TEAE) Tocadores catinicos Carboximetil (CM) Sulfopropil (SP) Sulfoetil (SE) Fosfo (P) Metilsulfonato (S)

Grupos funcionais -O-CH2-CH2-N+H(CH2CH3)2 -O-CH2-CH2-N+(C2H5)2-CH2-CHOH-CH3 -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3 -O-CH2-CH2-N+(C2H5)2-CH2-CH3 Grupos funcionais -O-CH2-COO-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CH2-CH2SO3-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CH2SO3-O-PO4-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2SO3-

Cromatografia de filtrao em gel

Solvente

grnulo de gel

Matriz do gel

Beneficia-se das diferenas de tamanho das protenas

Pequenas molculas Grandes molculas

Esferas com polmero poroso

Cromatografia de afinidade
As protenas so purificadas de acordo com sua especificidade por um substrato ou cofator particular
Mistura de protena Protena de interesse ligante

Soluo do ligante

Adiciona glicose

Protenas ligantes da glicose se ligam aos stios de glicose (G) nas esferas do gel

Protenas ligantes da glicose so perdidas com adio da glicose

Cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC)

Bombas de alta-presso aceleram a movimentao das protenas pela coluna, reduzindo o tempo de transito na coluna e aumentando a resoluo
Solvente

Coluna do HPLC

Dados
Tempo (minutos)

Injetor

Bomba

Detector

Descarte

Absorbncia a 220nm

Eletroforese
- A protena desnaturada e as subunidades se separam - As protenas migram de acordo com tamanho e forma em um campo eltrico - As molculas menores migram mais rapidamente atravs da matriz porosa do gel
Distncia

Amostra Poo

Direo da migrao

Protenas

Eletroforese Massa (kDa) Gel poroso

Eletroforese bidimensional
Baixo pH (-) Alto pH (+)

Baixo pH (-)

Alto pH (+)

Focalizao isoeltrica