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GENTICA
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1.- INTRODUCCIN
La Gentica es una materia diversa que trata de la variacin y la herencia de todos los organismos vivos. Desde la antigedad se tena la idea de que las caractersticas de los neonatos eran heredadas de los padres, as como la idea de que stas podran ser afectadas por factores externos durante la concepcin. Sin embargo, el primer avance significativo hacia el entendimiento de la herencia surgi al final del Renacimiento, con el trabajo de William Harvey (1578)-1657) y la invencin del microscopio. Harvey propuso una nueva idea sobre la importancia relativa de la contribucin de animales machos y hembras en la creacin de su descendencia. Anteriormente se crea que la hembra proporcionaba el huevo slo como soporte y que ste tomaba una forma especfica dictada por el semen del macho. Harvey propuso que ambos, huevo y semen, guiaban el desarrollo de la descendencia. Las ideas acerca de la herencia probablemente no habran avanzado ms all de la que Harvey propuso de no haber sido por la invencin del microscopio compuesto, invento acreditado a Zacharias Jansen en 1609. Otro hombre del renacimiento, fundador de la microscopa (pequeos dibujos, Robert Hoke (1635-1709) public en 1665 un libro llamado Micrographia en la que demostraba la estructura del corcho, compuesto de cavidades a las que llam clulas (del latn cella, pequeo cuarto). Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723), en 1676, con la ayuda de un microscopio simple, observ en la espuma de charcos organismos pequeos a los que llam animlculos. Nehemiah Grew (1641-1712) public en 168, su libro The anatomy of Plants en el cual se muestra que los tejidos de las plantas estn formados por agregados de clulas. Las observaciones de estos naturalistas dieron inicio a la biologa celular que culmin en la teora celular, desarrollada por el botnico Mattias Jakob Schleiden y el zologo Theodor Schwann, quienes en 1839, integrando los conocimientos previos y los propios, propusieron que todos los organismos estn compuestos de clulas. Los estudiosos de la poca, quienes ya tenan la certeza de que la clula era la unidad estructural y funcional de todos los organismos, observaron la gran diversidad de formas y tamaos celulares, as como de algunos de sus componentes internos, como el ncleo. As surgi la clasificacin de organismos eucariotas, los que posean ncleo, y procariotas, los que carecan de ste.
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En 1858, el mdico alemn Rudolph Carl Virchow (1821- 1902), en su libro Cellular pathologie (Patologa celular), propuso que todos los organismos procedan de clulas preformadas por clulas (ovnis cellula e cellula) y que no aparecan por generacin espontnea a partir de materia desorganizada. Posteriormente se lleg a la conclusin de que los espermatozoides y los vulos eran clulas especializadas en transmitir informacin de una generacin a la siguiente. Esta evolucin de las ideas llev a proponer la ley de la continuidad gentica, que probablemente fue el avance ms importante en su tiempo del entendimiento de los seres vivos: la vida viene slo de la vida por medio de las clulas. Durante este mismo siglo, Gregor Johan Mendel encuentra mediante experimentos de apareamiento, que los caracteres hereditarios del chcharo ( Pisium sativum) estaban presentes y eran transmitidos a la progenie como unidades discretas; cada chcharo deba poseer un par homlogo de esas unidades, de las cuales recibi uno del polen y uno del ovario y, de stas, una era dominante y la otra, recesiva. A fines de 1880, se lleg a la conclusin de que la informacin hereditaria estaba localizada en elementos intranucleares que se podan ver con la ayuda del microscpio durante la fase mittica del ciclo celular, fase que culmina en la divisin celular. Estos elementos fueron llamados cromosomas. Continuando con los estudios microscpicos, en la segunda mitad del siglo XIX se observ la divisin celular y su efecto sobre los cromosomas. Las clulas somticas sufren divisin por mitosis, dando lugar a dos clulas hijas con el mismo nmero diploide de cromosomas, al igual que la clula madre. Tambin se observ que las clulas precursoras de los gametos llevaban a cabo una divisin celular mucho ms compleja que la mitosis, la meiosis, que involucra dos divisiones celulares sucesivas, produciendo cuatro gametos, cada uno con la mitad de cromosomas de la clula precursora. Con los conocimientos adquiridos hasta ese momento se inici un estudio intensivo de la herencia, a la cual se le llam gentica. Se llam gen a la unidad hereditaria descrita por Mendel y genoma, a la suma total de los genes de un individuo. En esta ltima dcada, se han secuenciado diversos genomas, incluyendo el del Humano y se ha avanzado en la capacidad, el diseo, la manipulacin y el uso generalizado de nuevas tecnologas, lo cual ha permitido el desarrollo de la gentica mdica.
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En la actualidad, es fundamental desarrollar un adecuado balance, entre la ciencia bsica y la investigacin aplicada, en beneficio de las mltiples necesidades de salud. Si bien, esta relacin empieza a tener un desarrollo notable, es primordial fortalecer el impulso de tales tecnologas para avanzar, no solo en el conocimiento bsico requerido, sino tambin para conocer las caractersticas genticas de diferentes poblaciones y desarrollar una mejor medicina preventiva. Pensando en lo importante que es para el estudiante de las ciencias de la salud el conocimiento de la gentica aplicada y como apoyo prctico a los conocimientos tericos adquiridos en la unidad de aprendizaje de Gentica se disea una serie de prcticas en el Laboratorio de Gentica. El Laboratorio de Gentica le permitir conocer algunas de las tecnologas que son utilizadas para la manipulacin gnica, las prcticas son diseadas en coordinacin temtica a la unidad de aprendizaje de Gentica. Las actividades generalmente estn diseadas en varias etapas, en cada una de las cuales se pretende que el estudiante desarrolle habilidades y destrezas que le sern tiles para su futuro trabajo profesional. Al inicio se pretende que sean guiadas por el docente responsable de la prctica hasta lograr una total responsable independencia de su aprendizaje
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Los conocimientos de las tcnicas de biologa molecular le permiten al profesional de la Disciplinar: La tendencia salud desarrollar disciplinar del aprendizaje de la competencia, la Gentica, es integrar el entre otras, de conocimiento de las tcnicas mejorar los de biologa molecular y su mtodos de aplicacin en la gentica diagnostico de mdica. enfermedades genticas, Profesional: Que el adems de que estudiante como un futuro le permiten el integrante de los profesionales planteamiento de de las ciencias de la salud tratamientos desarrolle la competencia del preventivos. uso de la tecnologa del DNA recombinante, para adquirir una de las competencias que en la actualidad deben formar
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Es necesario que el profesional de la salud tenga Gentica conocimiento del Molecular uso de las tcnicas de biologa molecular en la gentica medica.
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(ej. enzimas).
Sociales: Que el estudiante como futuro integrante del grupo de los profesionales de la salud tenga las competencias bsicas de la tecnologa del DNA recombinante que le permitan proponer nuevas metodologas para la solucin de los problemas de salud (especialmente las enfermedades de carcter hereditario) y la industria actuales.
2.3 Niveles de desempeo _______________________________________________________________________ Nivel 1. Se realizan funciones rutinarias de baja complejidad. Se reciben instrucciones. Se requiere baja autonoma. Nivel 2. Se realizan un conjunto significativo de actividades de trabajo, variadas y aplicadas en diversos contextos. Algunas actividades son complejas y no rutinarias. Presenta un bajo grado de responsabilidad y autonoma en las decisiones. A menudo requiere colaboracin con otros y trabajo en equipo. Nivel 3. Se requiere un importante nivel de toma de decisiones. Tiene bajo su
responsabilidad recursos materiales con los que opera su rea. As como control de recursos financieros para adquisicin de insumos. Nivel 4. Se desarrolla un conjunto de actividades de naturaleza diversa, en las que se tiene que mostrar creatividad y recursos para conciliar intereses. Se debe tener habilidad para motivar y dirigir grupos de trabajo. Nivel 5. Se desarrollan un conjunto de actividades de naturaleza diversa, en las que se tiene que mostrar un alto nivel de creatividad, as como buscar y lograr la cooperacin entre grupos e individuos que participan en la implantacin de un problema de magnitud institucional.
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Las prcticas del Laboratorio de Gentica tendrn un nivel de desempeo del Conocer planteado en el NIVEL 2 a. Los contextos son varios: 1. Aula: con los conocimientos aprendidos en su unidad de aprendizaje de Gentica. 2. Laboratorio de Gentica: aplicar y reforzar los conocimientos tericos con el manejo de las tcnicas de biologa molecular. 3. Otros ambientes de aprendizaje: cuando desarrolle trabajos de investigacin que en cada prctica se les dejara, la finalidad es buscar una aplicacin prctica profesional de lo aprendido en el laboratorio. 4. La complejidad de las prcticas estarn directamente relacionadas con su aprendizaje del aula. 5. Su grado de responsabilidad y autonoma ser determinado con su compromiso de aprender. 6. Se requiere trabajo en equipo para el desarrollo de cada prctica sealada.
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Unidad de competencia
Semana en el semestre
Bibliografa
1 prctica:
2 semana del curso Comportamiento dentro del laboratorio de gentica 2 prctica Programa de Prcticas del Laboratorio de Gentica. Copia del Resumen de las Normas Oficiales. Reglamento del Laboratorio. Principios de Gentica. James Lewin. Gentica en Medicina Nussbaum-McinnesWillard Molecular cloning. Sambrook y Russell. Tomo I Tomo II Tomo III
Aislamiento de DNA cromosmico 3 y 4 semana del y anlisis mediante curso electroforesis. 3 prctica Amplificacin de genes mediante PCR., y anlisis mediante electroforesis. 4 prctica Aislamiento de DNA plasmdico y anlisis mediante electroforesis. 5 prctica Preparacin de clulas competentes, Transformacin gentica de bacterias, y Seleccin de clones transformados
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ESPECIFICACIONES
EQUIPOS DE PROTECCIN
--Se tiene del conocimiento con capacitacin del personal, para el uso,
Reglamento Federal de Higiene y Medio Ambiental del Trabajo.. Cap. 5to. Art. 135 al 141
INSTALACIONES ELCTRICAS
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Las instalaciones elctricas deben tener protecciones de seguridad y sealarse de acuerdo al voltaje y corriente elctrica de la carga instalada. NOM-OO1-SEDE-1999, ART. 1 - 34
--El bloqueo de energa para el control de riesgos, estar en tableros,
controles y equipos, a fin de desemergizar, desactivar y/o impedir la operacin normal de la maquinaria y equipo.
--Se ubican las seales de seguridad e higiene de tal manera que
NOM-OO1-SEDE-1999, ART. DEL 384 SEALES, AVISOS DE SEGURIDAD Y CODIGO DE COLORES NOM-026-STPS-1998 Apto 5 y 5.4 NOM-026-STPS-1998 Apto 9 y 9.1 NOM-026-STPS-1998 Apto 5 y 5.3 NOM-001-STPS-1999. Aptdo. 11
pueden ser observadas e interpretadas por los trabajadores a los que estn destinados y se evita que sean obstruidos. --Se utiliza el cdigo de colores en el sistema de tuberas conforme a lo que establece la norma correspondiente. Se garantiza que la aplicacin del color, sealizacin y la identificacin en la cubierta estn sujetas a un mantenimiento que asegure en todo momento su visibilidad y legibilidad.
PLANTA FSICA
--Se realizan verificaciones oculares peridicas a las instalaciones y Reglamento Federal de Higiene y elementos estructurales. Medio Ambiental del Trabajo. Ttulo -Los resultados de dichas verificaciones son anotados en un registro, siempre y cuando se detecten signos de ruptura, agrietamiento, pandeo, fatiga de material, deformacin, hundimiento u otra condicin similar, se deben solicitar las reparaciones correspondientes. --Se establecen lugares limpios, adecuados y seguros destinados al personal, para sanitarios, consumo de alimentos y en su caso, regaderas y vestidores.
2do. Cap. 1ero. Reglamento Federal de Higiene y Medio Ambiental del Trabajo. Ttulo 2do. Cap. 1ero.
Reglamento Federal de Higiene y Medio Ambiental del Trabajo. Ttulo 2do. Cap.1 y Cap. 7mo. --Se mantienen las reas de trabajo libres de obstculos y lo suelos Reglamento Federal de Higiene y limpios. As como objetos no debern obstaculizar la iluminacin y Medio Ambiental del Trabajo. ventilacin en las zonas en que stas se requieran. Cap. 8 mo. Y 12 do.
--Se conservan las reas limpias y en orden, permitiendo el desarrollo de
las actividades para las que fueron destinadas, asimismo, se les da mantenimiento preventivo y correctivo. --Las reas de trabajo deben delimitarse mediante franjas amarillas de al menos 5 cm. de ancho de tal manera que se disponga de espacios seguros para la realizacin de actividades. --Los techos del centro de trabajo, cuentan con un sistema que evite el estancamiento de agua. --Las paredes del centro de trabajo, se mantienen con colores que no afecten la visin del trabajador. --Los pisos del centro de trabajo, se mantienen limpios y cuentan con un sistema que evite los estancamientos de lquidos.
Art. 108
--Debern existir excusados y mingitorios con agua corriente, separados Reglamento Federal de Higiene y de los hombres de los de las mujeres. Medio Ambiental del Trabajo. Cap. 12,
Art. 103 CONDICIONES GENERALES --Se cuenta con un manual de primeros auxilios en el que se definen los NOM-005-STPS-1998
medicamentos y, materiales de curacin, que requiera el centro de trabajo, as como los procedimientos para la atencin de emergencias mdicas. --Se cuenta con un botiqun de primeros auxilios, en el rea, laboratorio NOM-005-STPS-1998 taller, en la que se deban incluir los materiales de curacin que se -9CIENCIAS QUIMICAS D.C. NORMA URTIZ ESTRADA
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requieran de conformidad con el anlisis de riesgos. --Se capacita al personal para prestar los primeros auxilios, por lo menos una vez al ao. --Se proporciona a todos los trabajadores, capacitacin y adiestramiento para la prevencin y, proteccin de incendios y combate de conato de incendios. --Se realizan simulacros una vez al ao. --Se organizan y capacitan simulacros de evacuacin del personal y de atencin de primeros auxilios. --Se efecta y registra el reconocimiento, evaluacin y control de los niveles de iluminacin del rea de trabajo.
NOM-005-STPS-1998 NOM-002-STPS-2000, CAP. 5.8 NOM-002-STPS-2000, CAP. 5.9 NOM-002-STPS-2000, CAP. 5.9 NOM-025-STPS-1999, CAP. 8, 9, 10
El laboratorio de Gentica tambin cuenta con un Reglamento Interno que pretende guiar su conducta dentro del mismo, las normas ah sealadas son actitudes que Usted debe conocer, aprender y acatar para un mejor desempeo y desarrollo de competencias. 4.2 Reglamento interno del laboratorio de gentica 1. Ingreso al Laboratorio de Gentica puede ser bajo 2 condiciones: 1) El grupo de estudiantes que tenga asignada una prctica debe llegar al laboratorio de Gentica acompaados del docente responsable de la Unidad de aprendizaje. (la ausencia del docente ocasiona la suspensin de la prctica y sta se reprograma en horarios que no interfiera con alguna actividad del propio laboratorio). 2) El estudiante o grupo de estudiantes (mximo 10) que le interese realizar una prctica para reforzar el aprendizaje. sta actividad puede ser realizada en los horarios determinados por el propio laboratorio. 2. En cualquiera de las 2 condiciones antes sealadas, al ingresar al Laboratorio los estudiantes dejarn en los casilleros que se encuentran en la entrada del mismo, sus mochilas y solo pasaran al Laboratorio con un cuaderno, lpiz, pluma y colores. 3. Adems del uniforme que portan para sus clases diarias, utilizaran bata blanca de manga larga, traern cubierta su cabeza con gorro o turbante que mantenga sus cabellos recogidos y cubiertos. 4. Los estudiantes traern las uas de sus manos cortas y sin esmalte 5. Cada estudiante traer un par de guantes de ciruga para el manejo de los equipos y reactivos, el no portarlos les impedir el manejo de los mismos.
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6. Mantendrn sus celulares apagados para no interrumpir el desarrollo de la prctica. El no acatar sta disposicin se har acreedor a una sancin. 7. No podrn ingerir alimentos, bebidas o fumar cuando se encuentren dentro del Laboratorio. 8. Al ingresar al Laboratorio los estudiantes permanecern en el interior del mismo no se permite la salida, sino hasta finalizar la prctica excepto, cuando se organice, alguna actividad que as lo requiera. 9. La asistencia del laboratorio se rige con el Reglamento General, por lo tanto para lograr acreditar ste laboratorio el estudiante debe contar con el 80% de asistencias a sus prcticas programadas. 10. Los reportes de prctica y tareas estarn integradas a una carpeta que se le nombrar Bitcora de Laboratorio. 11. Al finalizar cada una de las prcticas Usted elaborar un reporte de las mismas de acuerdo como le sea indicado. 12. Cada tarea que sea sealada debe entregar una copia a la siguiente prctica, para su revisin, posteriormente se les regresa y se integra a su Bitcora del Laboratorio. 13. Las tareas sealadas en este manual sern obligatorias para todos los grupos que realicen las prcticas sin importan de cual licenciatura provengan. Las cuales se integran en la Bitcora del Laboratorio el cual ser revisado por el docente responsable de la unidad de aprendizaje y el responsable del laboratorio. 14. Las primeras prcticas sern guiadas por el docente responsable de la prctica (docente de la unidad de aprendizaje de Gentica). 15. El grupo de estudiantes se organizarn en equipos de trabajo (puede ser de manera independiente o por indicaciones del docente) y estar en relacin directa a: 3 factores importantes: 1) Nmero total de estudiantes (preferentemente en nmero que no exceda a 6 integrantes). 2) Cantidad de material y equipo disponibles. 3) Duracin de cada prctica. 16. El docente responsable del grupo junto con los estudiantes son responsables del cuidado y conservacin del equipo del laboratorio.
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17. Cada equipo de trabajo nombra a uno de sus integrantes como coordinador de la prctica. 18. El responsable del Laboratorio le entregar a cada docente y coordinador de equipo el material necesario para que realicen su prctica mediante la firma de un vale, en el que se seala la integridad del material entregado y el estado general del mismo. 19. Para el manejo de todo el equipo, materiales y reactivos docente y los integrantes de cada equipo deben utilizar guantes, quin no los porte, se le impedir el manejo de los mismos. 20. Durante y al final de la prctica, el docente, Usted y sus compaeros de equipo, son los responsables de la integridad del equipo y material utilizados. 21. La entrega del material perteneciente a ste laboratorio que haya sido utilizado durante la prctica se le har al responsable del laboratorio el cul previa revisin minuciosa, certificar la integridad del mismo y les regresa el vale que firmaron al inicio de la prctica. 22. El funcionamiento del Laboratorio de Gentica est basado en los lineamientos que las Normas Oficiales Mexicanas sealan, las cuales debe conocer y acatar la normalizacin. 23. El Laboratorio de Gentica cuenta con una serie de sealizaciones las cuales Usted debe conocer y cumplir pues fueron diseadas para su proteccin y seguridad personal, el no respetar su significado ser acreedor a una sancin. (Normas Oficiales Mexicanas).
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PRIMERA PRCTICA
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Utilizar bata blanca de manga larga. Utilizar guantes para el manejo del equipo, material y reactivos.
Realizar un reporte de cada prctica Elaborar las tareas Integrar informacin a la Bitcora
El laboratorio de Gentica para su buen funcionamiento requiere que: - Se cumplan los lineamientos de las Normas Oficiales Mexicanas - Se observen las normas del Reglamento Interno del Laboratorio
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NOM-
NOM-026-STPS-1998 Apto 5 y 5.4 NOM-026STPS-1998 Apto 9 y 9.1 NOM-026-STPS-1998 Apto 5 y 5.3 Reglamento Federal de Higiene y Medio Ambiental del Trabajo. Ttulo 2do. Cap.1 y Cap. 7mo. Reglamento Federal de Higiene y Medio Ambiental del Trabajo. Cap. 8 mo. Y 12 do. NOM-025-STPS-1999, apdo. 7 NOM-001-STPS1999, NOM-026-STPS-1998 NOM-026-STPS-1998, apdo NOM-001-STPS-1999, fracc. 7.1 NOM-005STPS-1998 NOM-087-ECOL-SSA1-2002 NOM-087-ECOL-SSA1-2002 Apdo. 4, 5, y 6 Reglamento Federal de Higiene y Medio Ambiental del Trabajo. Cap. 12, art. 109 y 110. OM-005-STPS-1998 NOM-005-STPS1998 NOM-005-STPS-1998 NOM-002-STPS-2000, CAP. 5.8, 5.9 NOM025-STPS-1999, CAP. 8, 9, 10
PLANTA FISICA
CONDICIONES GENERALES
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B) Encuadre
120 minutos
15 min.
D) Lectura y anlisis de las Final de la Prctica y diferentes Normas Oficiales Tarea para la siguiente Mexicanas requeridas para el sesin buen funcionamiento del Laboratorio de Gentica.
A).
INGRESO AL LABORATORIO DE GENETICA CADA VEZ QUE TENGAN UNA ACTIVIDAD. 1 El grupo de estudiantes llegara al Laboratorio de Gentica con su maestro responsable de la Unidad de aprendizaje de Gentica. 2 Al ingresar al Laboratorio los estudiantes dejarn con un cuaderno, lpiz, pluma y colores. 3 Adems del uniforme que utilizan para sus clases diaria, utilizaran bata blanca de manga larga, traern cubierta su cabeza con gorro que mantenga sus cabellos recogidos y cubiertos.
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4 Los estudiantes traern las uas de sus manos cortas y sin esmalte. 5 Cada estudiante traer un par de guantes de ciruga para el manejo del material, equipo y reactivos, el no portarlos les impedir el manejo de los mismos. 6 Mantendrn sus celulares apagados para no interrumpir el desarrollo de la prctica. El no acatar sta disposicin se har acreedor a una sancin. 7 No podrn ingerir alimentos, bebidas o fumar cuando se encuentren dentro del Laboratorio. 8 Al ingresar al Laboratorio los estudiantes permanecern en el interior del mismo no se permite la salida, sino hasta finalizar la prctica excepto, cuando se organice, alguna actividad que as lo requiera. 9 Al finalizar cada una de las prcticas Usted elaborar un reporte de las mismas de acuerdo como le sea indicado y la presentar en la prctica siguiente.
B). Segunda parte de la primera prctica: DESARROLLO DE LA ACTIVIDAD DIDCTICA CONOCIDA COMO ENCUADRE. El Encuadre como tcnica de trabajo es muy importante para el desarrollo de cualquier Unidad de aprendizaje, consta de varias actividades y cada una de ellas pretende lograr objetivos que sustenten el xito del aprendizaje. En el manejo y desarrollo de sta tcnica de trabajo, el docente puede utilizar las estrategias que considere conveniente sin olvidar que ste se integra por lo menos de 5 actividades siguientes: 1. Presentacin de los participantes. 2. Anlisis de expectativas. 3. Presentacin del programa 4. Plenario de acuerdos y de organizacin operativa 5. Prueba diagnstica Cada una de stas actividades tiene objetivos explcitos e implcitos; los primeros el propio coordinador se los explicar, los segundos conforme se desarrolle sta actividad los ir descubriendo Usted mismo.
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ACTIVIDAD DEL ENCUADRE ES POSIBLE CON STE TIPO DE DISTRIBUCIN DE LOS ESTUDIANTES? -La distribucin que presenta la imagen no permite que la actividad cumpla con las expectativas para lo que fue diseada. sta actividad permite que docente coordinador y estudiantes se conozcan
ACTIVIDAD DEL ENCUADRE CMO DEBEN STAR ORGANIZADOS LOS ESTUDIANTES PARA QUE LA ACTIVIDAD LOGRE EL XITO? CON LA FORMACIN DE EQUIPOS DE TRABAJO Para sta tcnica de trabajo el docente puede utilizar las estrategias que considere pertinente, sin olvidar el objetivo principal: el estudiante debe tener claro: -Qu se va a hacer. Para qu se va hacer. -Como se va hacer. -Es establecer un acuerdo formal entre el docente y los estudiantes
1. Presentacin de los participantes: Este rubro permite que los estudiantes se conozcan entre s, y en docente conozca algo ms de cada uno de ellos. (objetivo explcito) 1) La estrategia para sta primera parte del encuadre ser la de: PRESENTACIN PROGRESIVA. a) Se solicitar a los participantes que se junten en parejas que no se conozcan o que deseen conocerse. (La duracin de la actividad 5 a 10 minutos). Cada participante de sta pareja se presentara con su otro compaero y le contar lo principal de su persona. Es necesario escuchar con suma atencin lo que el compaero le diga de si mismo, porque posteriormente l lo presentar a sus dems compaeros. b) Posteriormente el Coordinador solicita que cada pareja se rena con otra para formar una cuarteta, es mejor que se juntes las duplas que menos se conozcan. Se les indica que en este grupo cada uno de ellos presente a su primera pareja ante los dems compaeros. (10 minutos). c) En este tercer momento el Coordinador solicitar que cada cuarteta se rena con otra de las menos conocidas y formar grupos de ocho. De cada
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uno de las cuartetas uno presentara a sus tres compaeros restantes y luego uno de ellos lo presentara a l. (10 a 15 minutos) d) El cuarto momento de esta estrategia, se rene todo el grupo en plenario, lo mejor es sentados en crculo, el Coordinador pedir a uno de cada de las octetos presente al resto de sus compaeros y luego uno de ellos los presente a l. El Coordinador solicitar a un integrante de otro equipo que repita el nombre de los integrantes que acaban de ser presentados. Se repite sta actividad con el resto de los dems equipos. actividad la realizar el Coordinador. (10 15 minutos) 2. Anlisis de las expectativas: ste apartado permite al docente responsable conocer las expectativas que sobre el Laboratorio tiene el estudiante, adems identifica algunas de las habilidades previas en el manejo del equipo e instrumentos que cada estudiante pueda poseer. (objetivo explcito). La actividad tendr el siguiente orden: 1) Se organizarn varios equipos de trabajo utilizando el mtodo que se crea conveniente segn el nmero de estudiantes que asistan a la prctica. 2) Se les reparten una serie de preguntas o situaciones las cuales permiten al docente responsable as como al grupo conocer las expectativas que se tienen sobre las actividades que se realizarn en el Laboratorio de Gentica o tambin la aplicacin que en el ejercicio profesional les ofrecer la unidad de aprendizaje de Gentica y los conocimientos adquiridos en el Laboratorio. La serie de preguntas o situaciones pueden ser: Describa tres situaciones ficticias del trabajo del profesional (aqu se les est solicitando de acuerdo a la licenciatura que est cursando el estudiante) en las que se requiera los conocimientos de Gentica. Y con respecto a las actividades del laboratorio: Qu esperan de ste Laboratorio? Los conocimientos adquiridos en el Laboratorio como les apoyar en su prctica profesional futura?
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Al final varios
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Que les gustara que pasara en este curso prctico? Que espera del docente coordinador, de sus compaeros y de Usted mismo? A que se compromete Usted mismo? Todas sus respuestas de equipo las plasmarn en una cartulina u otro material didctico El tiempo utilizado es sta actividad no debe de excederse de 20 min.
3) Posteriormente se realizar una plenaria donde un representante de cada equipo expondr las conclusiones a la que llegaron. (20 25 minutos) 3. Presentacin del programa: sta actividad es realizada por el docente donde les presenta en plenaria el programa de debe contener:
Los objetivos Explcitos: Estos objetivos se refieren a: Propuesta de trabajo del docente. Ubicacin de la unidad de aprendizaje en el plan de estudio. Los contenidos que se van a estudiar. Presentacin del programa por escrito
sta actividad se realizar con la presentacin de los anteriores puntos por el docente permitiendo que los estudiantes cuestionen si existe alguna duda, y conformados como se encuentran los equipos puedan hacer sugerencias para modificar, completar o enriquecer alguno de los planteamientos anteriores. (5 20 minutos) 4. Plenario de acuerdos y de organizacin operativa: Esta actividad est muy relacionada con la anterior en la cul cada uno de los equipos expondr sus propuestas; lo que es importante recordar en que en este tipo de negociacin no solo estn involucrados el docente y los estudiantes sino tambin la Institucin, las normas acadmico-administrativas y el plan de estudios vigente y cualquier modificacin o propuesta no debe contradecir a stos. (Objetivo explcito) minutos) 5. Prueba de diagnstico: (10 15
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La funcin de sta ltima actividad del encuadre tiene como objetivo explcito el conocer el nivel de conocimientos previos que Usted posee de la unidad de aprendizaje de Gentica, del manejo del equipo, el material y el comportamiento en un Laboratorio. (Como mximo 20 minutos) C. Tercera parte de la primera de la prctica: IDENTIFICACIN DE LAS
DIVERSAS REAS QUE CONFORMAN EL LABORATORIO Y SU SEALIZACIN. Terminando su prueba diagnstica, el docente responsable de la prctica le muestra los espacios que conforman el Laboratorio de Gentica. Es importante que Usted identifique los diversos sealamientos que se encuentran dentro y fuera del Laboratorio (En su cuaderno de trabajo Usted debe anotar las sealizaciones observadas y su ubicacin). El docente le entrega una sntesis de las Normas Oficiales Mexicanas y del Reglamento Interno del Laboratorio para su posterior lectura en casa que le permite a Usted una mejor comprensin de: Los diversos sealamientos que identific en el Laboratorio de Gentica. El comportamiento que tiene que seguir dentro del mismo. D. Tarea para la prxima prctica: LECTURA Y ANLISIS DE LAS NORMAS MEXICANAS OFICIALES Y DEL REGLAMENTO INTERNO DEL LABORATORIO DE MORFOLOGA. o Despus de conocer las diferentes reas del Laboratorio de Gentica Usted elabore un croquis del mismo. o Mencione y describa las caractersticas de las diversas sealizaciones que Usted identifico dentro del Laboratorio. o Relacione stas sealizaciones con las Normas Oficiales Mexicanas (resumen que se le entreg en el Laboratorio). o Realice una resea de los acontecimientos de la primera prctica con los siguientes puntos:.
La explicacin del docente respecto al Reglamento Interno del Laboratorio fue la adecuada? Si tiene alguna duda mencinela.
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La actividad del Encuadre segn su opinin le fue til? Si no es as, qu detalles o sugerencias no fueron las adecuadas? A partir del conocimiento de las Normas Oficiales Mexicanas identifique y mencione por escrito cules de ellas estn relacionadas con las sealizaciones que Usted encontr en el Laboratorio?
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importante para desarrollar sus habilidades y actitudes necesarias para lograr la competencia. Conocimiento, observacin y aplicacin de lo establecido en las Normas Oficiales Mexicanas. El conocimiento de stas Normas le permiten a Usted comprender la razn del porque de las diversas sealizaciones que identifico tanto dentro y fuera del laboratorio, el porque de su ubicacin, su significado y la importancia de que un Laboratorio trabaje basndose en estas Normas. 11.3 Mtodo de asignacin de calificaciones de la primera prctica
En sta primera prctica los conocimientos previos no tiene una significacin preponderante ya que el desarrollo del resto de las prcticas de ste laboratorio una de sus principales finalidades es mejorar el aprendizaje de la Gentica, por lo tanto la ponderacin no ser alta. Por el contrario el conocimiento del Reglamento Interno del Laboratorio as como, las Normas Oficiales Mexicanas son bsicamente los conocimientos necesarios e indispensables para adquirir la competencia prevista en sta primera prctica; por lo tanto la calificacin y ponderacin de sta primera prctica es la siguiente:
ACTIVIDAD A CALIFICAR Examen diagnstico Conocimiento, observacin y aplicacin de los lineamientos del Reglamento Interno del Laboratorio.
12. BIBLIOGRAFA: Reglamento Interno del Laboratorio de Gentica Resumen de las Normas Oficiales Mexicanas
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13. PARA SABER MS Realizar una bsqueda en Internet las caractersticas de otros laboratorios de Gentica de Facultades de Medicina y sealar algunas diferencias respecto a nuestro Laboratorio
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2 PRCTICA: EXTRACCIN DE DNA CROMOSMICO. EL ESTUDIANTE ESTAR CAPACITADO PARA AISLAR Y ANALIZAR EL DNA OBTENIDO DE CLULAS BACTERIANAS U OTROS MODELOS DE ESTUDIO CUANDO: a. Se asegure de tener a la mano todo el material requerido para realizar la prctica. b. Trabaje de manera ordenada, segura y limpia. c. Siga cada uno de los pasos indicados para el desarrollo exitoso de la tcnica, teniendo cuidado de no omitir, o equivocarse en alguno. d. Pueda observar un resultado favorable.
NOM-
NOM-026-STPS-1998 Apto 5 y 5.4 NOM-026STPS-1998 Apto 9 y 9.1 NOM-026-STPS-1998 Apto 5 y 5.3 Reglamento Federal de Higiene y Medio Ambiental del Trabajo. Ttulo 2do. Cap.1 y Cap. 7mo. Reglamento Federal de Higiene y Medio Ambiental del Trabajo. Cap. 8 mo. Y 12 do. NOM-025-STPS-1999, apdo. 7 NOM-001-STPS1999, NOM-026-STPS-1998 NOM-026-STPS-1998, apdo
PLANTA FISICA
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CONDICIONES GENERALES
NOM-001-STPS-1999, fracc. 7.1 NOM-005STPS-1998 NOM-087-ECOL-SSA1-2002 NOM-087-ECOL-SSA1-2002 Apdo. 4, 5, y 6 Reglamento Federal de Higiene y Medio Ambiental del Trabajo. Cap. 12, art. 109 y 110. OM-005-STPS-1998 NOM-005-STPS1998 NOM-005-STPS-1998 NOM-002-STPS-2000, CAP. 5.8, 5.9 NOM025-STPS-1999, CAP. 8, 9, 10
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deposite en el fondo del tubo y se decanta el sobrenadante cuidadosamente. Se procede a lavar la muestra de DNA con etanol al 95%, se deja secar al aire, y se resuspende en 10 l de amortiguador T10 E1 (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8). Se agrega a la muestra 1 L de RNAsa para degradar el RNA contaminante. El DNA se analiza en un gel de agarosa al 1% (p/v) teido con 0.1 % (p/v) de bromuro de etidio. 19.2 Programa de actividades El desarrollo de la segunda prctica ser manejado en 3 etapas. El cuidado y manejo del equipo y reactivos sern responsabilidad del docente y de Usted.
ACTIVIDADES 1) El docente explicar de manera breve el manejo de los equipos y materiales que se utilizarn para el desarrollo de la prctica. 2) Cada subgrupo de estudiantes obtendr y analizar DNA cromosmico.
TIEMPO REQUERIDO
RESULTADO ESPERADO A travs de la observacin guiada por el docente, el estudiante se familiariza con el equipo y el material que se utilizara para el desarrollo de la prctica, adems conoce los puntos clave para el resultado exitoso de la misma. El estudiante aprender de manera prctica la obtencin de DNA cromosmico, que es uno de los materiales esenciales para iniciar el estudio de genes de inters, y es la base para el desarrollo de la siguiente prctica. El estudiante por medio de la lectura, conocer algunas de las tecnologas del DNA recombinante, dems de su aplicacin prctica en la gentica mdica.
20 min.
2 das.
Tcnicas de Southernblot, Northernblot, Westernblot y PCR. La utilizacin en la gentica mdica de las anteriores.
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importante que recuerde que siempre es calificado por el docente responsable de la prctica. Manejo adecuado de los equipos, materiales y reactivos: Este parmetro se refiere a seguir con varios de los lineamientos sealados por el Reglamento Interno del Laboratorio. Resultado de la prctica: Indicador de su capacidad para seguir una tcnica, cuyo resultado favorable es esencial para el desarrollo de la siguiente prctica. Elaboracin de la tarea de investigacin: sta parte de la actividad en el laboratorio tiene la finalidad para que Usted: Desarrolle la habilidad de investigacin bibliogrfica. Logre identificar la aplicacin prctica en su actividad profesional futura. 20.3 Mtodo de asignacin de calificaciones:
ACTIVIDAD A CALIFICAR -- Comportamiento responsable de acuerdo a los lineamientos del laboratorio -- Manejo adecuado del equipo, material y reactivos --Resultado de la prctica -- Tarea de investigacin
PONDERACIN
20% 30% 30% 20 %
21. BIBLIOGRAFA
Molecular cloning. A laboratory manual. J. Sambrook. E.F. Fritsch y T. Maniatis (Eds.) Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York 1989. Current Protocols in Molecular Biology. F. Ausbel, R. Brent, R. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.G. Smith, y K. Struhl (Eds.) John Wiley & Sons Inc. 19941995. Gentica en Medicina. R.L. Nussbaum, R.R. McInnes, H.F. Williard. 5a Edicin. Editorial MASSON. 2004.
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ACTIVIDAD Indique con una flecha, en que direccin migraran las muestras de DNA del gel de ectroforsis y explique por qu?
Muestras
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TERCERA PRCTICA
Diseada por:
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Por medio de la aplicacin de calor a 94C, se produce la separacin de las dos cadenas de la molcula de DNA que se quiere amplificar. Al romperse los enlaces de hidrgeno, cada cadena acta como molde para fabricar su complementaria. 2. Hibridacin con cebadores. La temperatura se disminuye rpidamente a 55 C, para lograr que los cebadores o primers reconozcan sus secuencias complementarias en las cadenas de DNA correspondientes y se unan con ellas. Los primers no deben ser complementarios entre s y deben corresponder a los extremos del fragmento del DNA que se quiere amplificar. 3. Extensin con Taq polimerasa. Para esta etapa, la temperatura se eleva a 72 C, con lo que la taq polimerasa agrega los diferentes nucletidos complementarios siguiendo el orden de la cadena que sirve de molde. El proceso se repite un nmero determinado de veces o ciclos, generalmente 30, y se consigue un aumento o amplificacin exponencial del nmero de copias del fragmento de DNA que sirvi como molde. (1, 2, 3) Una ventaja de la tcnica es que amplifica nicamente el fragmento de DNA que queremos, aunque est en cantidades mnimas (alta sensibilidad) o en presencia de grandes cantidades de DNA semejantes (alta especificidad). La reaccin es eficaz incluso si se parte de muestras de DNA muy poco purificadas, es decir, que se encuentran en presencia de otros componentes. Una vez amplificada la molcula del DNA que se desea, se coloca la muestra en gel de agarosa, en el que se agrega azul de bromofenol que nos permitir visualizar cmo la muestra corre a travs del gel, para lo que se emplea corriente elctrica a 100 mV, durante 30 a 40 minutos. De acuerdo con el tamao de la molcula de DNA, ser la distancia que correr en el gel; posteriormente este se tie con bromuro de etidio que permite visualizar la extensin en forma de bandas con el empleo de luz ultravioleta. La banda obtenida se compara con un
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marcador de peso molecular para poder establecer su tamao y as verificar si corresponde al fragmento que se busca o se puede correr al mismo tiempo que un control conocido y establecer comparaciones entre ambas bandas. El material biolgico a partir del cual se pueden obtener muestras para el anlisis del DNA es mltiple e incluye sangre, piel, semen, cabellos, material de biopsia, o puede conseguirse a partir de los instrumentos utilizados para la recoleccin de las muestras como son cotonetes o cepillos. La PCR se aplic inicialmente como una tcnica de laboratorio de investigacin, pero su gran especificidad y sensibilidad ha permitido el desarrollo de tcnicas especficas basadas en ella con aplicacin en muchos campos de la investigacin y el anlisis. As, se ha convertido en una herramienta fundamental en campos tan diversos como la investigacin (clonacin de genes, deteccin de clones recombinantes, estudio de DNA de fsiles), medicina forense y criminalstica (determinacin de paternidad, identificacin de individuos y de sospechosos, as como en el anlisis de la evidencia en casos de asesinato, violacin, etc.), sanidad animal y mejora gentica (deteccin de enfermedades genticas e infecciosas, pureza de razas, etc.) y medicina (diagnstico de enfermedades).
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NOM-
NOM-026-STPS-1998 Apto 5 y 5.4 NOM-026STPS-1998 Apto 9 y 9.1 NOM-026-STPS-1998 Apto 5 y 5.3 Reglamento Federal de Higiene y Medio Ambiental del Trabajo. Ttulo 2do. Cap.1 y Cap. 7mo. Reglamento Federal de Higiene y Medio Ambiental del Trabajo. Cap. 8 mo. Y 12 do. NOM-025-STPS-1999, apdo. 7 NOM-001-STPS1999, NOM-026-STPS-1998 NOM-026-STPS-1998, apdo NOM-001-STPS-1999, fracc. 7.1 NOM-005STPS-1998 NOM-087-ECOL-SSA1-2002 NOM-087-ECOL-SSA1-2002 Apdo. 4, 5, y 6 Reglamento Federal de Higiene y Medio Ambiental del Trabajo. Cap. 12, art. 109 y 110. OM-005-STPS-1998 NOM-005-STPS1998 NOM-005-STPS-1998 NOM-002-STPS-2000, CAP. 5.8, 5.9 NOM025-STPS-1999, CAP. 8, 9, 10
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algunas consideraciones especiales para la preparacin de reactivos y el uso de los materiales tpicos de la PCR.
29.1 Metodologa 1.- En un microtubo de 0.5 ml estril mezcle en el siguiente orden: 10 x Buffer de amplificacin 20 mM dNTPs 20 M Oligonucletido directo 20 M Oligonucletido reverso DNA polimerasa termoestable 100 x BSA H2O HPLC estril DNA templado Volumen total 5 l 1 l 2.5 l 2.5 l 0.5 l 0.5 l 37.5 l 0.5 l 50 l
Si no se est utilizando un termociclador de gradiente, se debe cubrir la mezcla de reaccin con una gota de aceite mineral para evitar la evaporacin del agua durante los ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento. 3.- Los tiempos y temperaturas de desnaturalizacin, alineamiento y polimerizacin, se listan a continuacin: # DE CICLOS 30 ciclos ltimo ciclo DESNATURALIZACIN 30 segundos/ 94 C 1 minuto/ 94C ALINEAMIENTO 30 segundos/ 65C 30 segundos/ 65C POLIMERIZACIN 1 minuto/ 72C 1 minuto/ 72C
Nota: Estos tiempos son apropiados para un volumen de reaccin de 50 l. La polimerizacin debe de ser de un minuto por cada 1000 pares de bases de longitud del DNA a amplificar.
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3.- Si en el paso 2 agreg aceite mineral, asegrese de eliminarlo cuidadosamente con la micropipeta. 4.- Tome una muestra de la reaccin (5-10 l), y analizarla en un gel de agarosa al 1% (p/v) asegurndose de incluir en el gel marcadores de tamao del DNA. 5.- Tia el gel con bromuro de etidio al 0.1% (p/v) para visualizar la banda de amplificacin.
Nota: Una amplificacin exitosa debe observarse como una banda claramente visible del tamao esperado.
29.2 Programa de actividades El desarrollo de la tercera prctica ser manejado en 3 etapas. El cuidado y manejo del equipo y reactivos sern responsabilidad del docente y de Usted.
ACTIVIDADES 1) El docente explicar de manera breve el manejo de los equipos y materiales que se utilizarn para el desarrollo de la prctica. 2) Cada subgrupo de estudiantes amplificar mediante la PCR un gen de interes, lo observar y analizar. 3) Investigacin de las siguientes variantes de la tcnica PCR:
RESULTADO ESPERADO A travs de la observacin guiada por el docente, el estudiante se familiariza con el equipo y el material que se utilizara para el desarrollo de la prctica, adems conoce los puntos clave para el resultado exitoso de la misma. El estudiante aprender una de las tcnicas de Biologa Molecular ms sencillas y verstiles.
2 das. El estudiante por medio de la lectura, conocer algunas de las variantes de la tcnica PCR, adems de su aplicacin prctica en la gentica mdica.
Tarea
AFLP, RT-PCR, PCRSSCP, PCR de tiempo real, PCR-RFLP, RAPD. La utilizacin en la gentica mdica de las anteriores.
INSTRUMENTOS Micropipetas
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REACTIVOS DNA
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Cmara de electroforsis
Microtubos
BSA T10E1 (estril) Agua grado HPLC (estril) Taq polimerasa o Vent polimerasa. Nota: Los Oligonucletidos. microtubos deben Agarosa ser esterilizados y Bromuro de etidio manejarse con guantes. Nota: Todos los reactivos deben ser manejados de forma cuidadosa y con el uso de guantes de ltex, no pipetear y tener cuidado de no inhalar.
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Resultado de la prctica: Indicador de su capacidad para seguir una tcnica, cuyo resultado favorable es esencial para el desarrollo de la siguiente prctica. Elaboracin de la tarea de investigacin: sta parte de la actividad en el laboratorio tiene la finalidad para que Usted: Desarrolle la habilidad de investigacin bibliogrfica. Logre identificar la aplicacin prctica en su actividad profesional futura.
PONDERACIN
20% 30% 30% 20 %
31. BIBLIOGRAFA
Molecular cloning. A laboratory manual. J. Sambrook. E.F. Fritsch y T. Maniatis (Eds.) Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York 1989. Current Protocols in Molecular Biology. F. Ausbel, R. Brent, R. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.G. Smith, y K. Struhl (Eds.) John Wiley & Sons Inc. 19941995. Gentica en Medicina. R.L. Nussbaum, R.R. McInnes, H.F. Williard. 5 a Edicin. Editorial MASSON. 2004.
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Mutacin de trmino de cadena. Mutacin puntual. Mutacin por transicin. Mutacin de cambio de marco. Mutacin de cambio de significado. Mutacin sin sentido.
ACTIVIDAD La secuencia de aminocidos que se presenta a continuacin representa parte de una protena. Consultando la tabla, determine la secuencia de doble cadena que corresponde al gen. Indique Qu cadena es la que lee - 42 la - RNA pol? y Cul sera la secuencia del mRNA? D.C. NORMA URTIZ ESTRADA CIENCIAS QUIMICAS -lys-arg-his-his-tyr-leu-
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CUARTA PRCTICA
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clones bacterianos que los portan ya que ofrecen resistencia especfica a antibiticos como la kanamicina, ampicilina, carbenicilina, entre otros. Los primeros plsmidos usados como vectores de clonacin fueron pSC101 (Cohen y col., 1973), colE1 (Hershfield y col., 1974) y pCR1 (Covey y col., 1976), sin embargo no eran verstiles, se replicaban pobremente, posean marcadores de seleccin inapropiados y ninguno de ellos posea mas de dos sitios de restriccin que pudieran ser usados para clonacin. El primer plsmido que combinaba todas las caractersticas deseables disponibles en aquel tiempo fue el pBR313 (Bolivar y col., 1977 a), sin embargo, este era innecesariamente largo; ya que mas de la mitad de su DNA no era esencial para su papel como vector. Sin embargo, la primera fase del desarrollo de un plsmido que pudiera ser usado como vector de clonacin termina con la construccin de pBR322 (Bolivar y col., 1977 b), un plsmido de 4.36 kb al cual se le haban eliminado la mayora de estas secuencias innecesarias. pBR322 fue en aquel tiempo el vector de clonacin ms ampliamente utilizado, y muchos de los vectores plasmdicos utilizados en la actualidad son sus descendientes lejanos.
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NOM-026-STPS-1998 Apto 5 y 5.4 NOM-026STPS-1998 Apto 9 y 9.1 NOM-026-STPS-1998 Apto 5 y 5.3 Reglamento Federal de Higiene y Medio Ambiental del Trabajo. Ttulo 2do. Cap.1 y Cap. 7mo. Reglamento Federal de Higiene y Medio Ambiental del Trabajo. Cap. 8 mo. Y 12 do. NOM-025-STPS-1999, apdo. 7 NOM-001-STPS1999, NOM-026-STPS-1998 NOM-026-STPS-1998, apdo NOM-001-STPS-1999, fracc. 7.1 NOM-005STPS-1998 NOM-087-ECOL-SSA1-2002 NOM-087-ECOL-SSA1-2002 Apdo. 4, 5, y 6 Reglamento Federal de Higiene y Medio Ambiental del Trabajo. Cap. 12, art. 109 y 110. OM-005-STPS-1998 NOM-005-STPS1998 NOM-005-STPS-1998 NOM-002-STPS-2000, CAP. 5.8, 5.9 NOM025-STPS-1999, CAP. 8, 9, 10
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La exposicin de la suspensin celular al detergente aninico fuerte SDS a un alto pH, abre la pared celular, desnaturaliza el DNA cromosmico y las protenas y libera el DNA plasmdico. Durante la lisis, las protenas bacterianas, paredes celulares rotas, y el DNA cromosmico desnaturalizado, se amasan en grandes complejos que son recubiertos con el dodecil sulfato de sodio. Estos complejos, se precipitan eficientemente de la solucin cuando los iones de sodio son remplazados por iones de potasio (Horowicz y Burke 1981). Por ltimo, el DNA plasmdico se recupera del sobrenadante, despus de que el material desnaturalizado ha sido removido por centrifugacin. 39.1 Metodologa 1).- En un tubo de ensaye estril conteniendo 3 ml de medio LB (Luria Bertani), suplementado con ampicilina (100 g/ ml) depositar una colonia transformante de Escherichia coli con la ayuda de un asa metlica. Crecer el cultivo a 37 C durante toda la noche. 2).- Cosechar las clulas por centrifugacin durante 2 min a 4 C y 13,000 rpm, en 2 microtubos estriles. Eliminar completamente el medio de cultivo.
NOTA: es muy importante no dejar residuos de medio, por ello se recomienda limpiar las paredes del tubo con un padazo de papel higienico.
3).- Resuspender perfectamente las pastillas celulares, en 50 l de una solucin de Tris/HCl 25 mM, pH 8.0; Glucosa 50 mM; EDTA 10 mM. Para obtener una suspensin homognea utilice el vortex.
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4).- Adicionar 200 l de una solucin de NaOH 0.1 N, SDS 1% (p/v) (esta solucin debe prepararse al momento de su utilizacin) y mezclar suavemente, invirtiendo el microtubo de 2 a 3 veces. Incubar la mezcla en hielo durante 5 min. Es muy importante no dejar proceder la lisis por ms de 5 min, ya que esto puede afectar la estructura del DNA plasmdico. 5).- Adicionar a la mezcla 150 l de una solucin de Acetato de potasio 3 M, agitando el microtubo 3 veces (de 5 segundos cada una) en el vortex. Incubar la mezcla 5 min en hielo. 6).- Centrifugar los microtubos a 13000 rpm durante 8 min. Tomar cuidadosamente el sobrenadante (aproximadamente 450 l) con la micropipeta de 1 ml y depositarlo en un microtubo limpio. 7).- Adicionar 500 l de una mezcla de Cloroformo: Alcohol Isoamlico (1:1). Mezclar durante 20 seg en el vortex y centrifugar 5 min a 13000 rpm. 8).- Tomar la fase superior (fase acuosa) y depositarla en un microtubo limpio. Adicionar 1 ml de etanol absoluto, mezclar en el vortex y centrifugar durante 18 min a 13000 rpm. 9).- Eliminar el sobrenadante por decantacin, (se debe tener cuidado de no tirar la pastilla de DNA), se enjuaga la pastilla 3 veces con 1 ml de etanol absoluto fro. 10).- Se deja secar la pastilla a temperatura ambiente (10 min). Se resuspende en 30 l de buffer T10E1. Se analiza una alcuota de 3 l por electroforesis en un gel de agarosa al 1% (p/v) y se tie con bromuro de etidio. 11).- Se toma una alcuota de 2 l del DNA plasmdico y se determina su patrn de restriccin con la enzima EcoRI, de acuerdo al siguiente protocolo: DNA plasmdico
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2 l
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1 l 6.5 l 0.5 l
Incubar la reaccin 1 h a 37 C. Mezclar con buffer de carga y analizar la reaccin en un gel de agarosa teido con bromuro de etidio. 39.2 Programa de actividades El desarrollo de la cuarta prctica ser manejado en 3 etapas. El cuidado y manejo del equipo y reactivos sern responsabilidad del docente y de Usted.
ACTIVIDADES 1) El docente explicar de manera breve el manejo de los equipos y materiales que se utilizarn para el desarrollo de la prctica. 2) Cada subgrupo de estudiantes obtendr DNA plasmdico, lo observar y analizar por restriccin. 3) Investigacin de los siguientes vectores de clonacin:
RESULTADO ESPERADO A travs de la observacin guiada por el docente, el estudiante se familiariza con el equipo y el material que se utilizara para el desarrollo de la prctica, adems conoce los puntos clave para el resultado exitoso de la misma. El estudiante aprender la tcnica de lisis alcalina con SDS para la obtencin de DNA plasmdico de la bacteria intestinal E. coli. El estudiante por medio de la lectura, conocer la utilizacin de otros vectores distintos a los plsmidos y las ventajas que ofrecen estos para el estudio de genes.
2 das.
Tarea
Nota:
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DNA T10E1 (estril) Acetato de Sodio SDS NaOH Agua grado HPLC (estril) Enzima de restriccin EcoRI Los Agarosa
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microtubos deben Bromuro de etidio estar estriles y deben manejarse Nota: Todos los reactivos deben ser manejados con guantes. de forma cuidadosa y con el uso de guantes de ltex, no pipetear y tener cuidado de no inhalar.
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Desarrolle la habilidad de investigacin bibliogrfica. Logre identificar la aplicacin prctica en su actividad profesional futura.
PONDERACIN
20% 30% 30% 20 %
41. BIBLIOGRAFA
Molecular cloning. A laboratory manual. J. Sambrook. E.F. Fritsch y T. Maniatis (Eds.) Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York 1989. Current Protocols in Molecular Biology. F. Ausbel, R. Brent, R. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.G. Smith, y K. Struhl (Eds.) John Wiley & Sons Inc. 19941995. Gentica en Medicina. R.L. Nussbaum, R.R. McInnes, H.F. Williard. 5 a Edicin. Editorial MASSON. 2004.
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Sitio de clonacin mltiple Origen de replicacin Casete de resistencia Gen de la galactosidasa Opern pUC19 Extremos cohesivos o pegajosos
Extremos romos o rasurados Recombinacin homloga Recombinacin tipo Campbell alfa complementacin X- Gal Transformacin Clulas competentes
ACTIVIDAD Un paciente con una enfermedad gentica tiene una mutacin (T por G) en el exn 18 de un gen. Diga que consecuencia tiene esta mutacin en la funcin gnica (cada tres nucletidos de las secuencias constituyen un codn del gen).
SECUENCIA DEL GEN DE UNA PERSONA NORMAL CTGTGCCGTATGAAAAGACCAATCCGAGAAGTTCCTGTTACCAAACTCATAGAC SECUENCIA DEL GEN DEL PACIENTE CTGTGCCGTATGAAAAGACCAATCTGAGAAGTTCCTGTTACCAAACTCATAGAC
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5 prctica
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EL
ESTUDIANTE
ESTAR
CAPACITADO
PARA
OBTENER
CLULAS
COMPETENTES, TRANSFORMARLAS Y ANALIZARLAS CUANDO: m. Se asegure de tener a la mano todo el material requerido para realizar la prctica. n. Trabaje de manera ordenada, segura y limpia. o. Siga cada uno de los pasos indicados para el desarrollo exitoso de la tcnica, teniendo cuidado de no omitir, o equivocarse en alguno. p. Obtenga como resultado final, clulas transformadas genticamente.
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NOM-026-STPS-1998 Apto 5 y 5.4 NOM-026STPS-1998 Apto 9 y 9.1 NOM-026-STPS-1998 Apto 5 y 5.3 Reglamento Federal de Higiene y Medio Ambiental del Trabajo. Ttulo 2do. Cap.1 y Cap. 7mo. Reglamento Federal de Higiene y Medio Ambiental del Trabajo. Cap. 8 mo. Y 12 do. NOM-025-STPS-1999, apdo. 7 NOM-001-STPS1999, NOM-026-STPS-1998 NOM-026-STPS-1998, apdo NOM-001-STPS-1999, fracc. 7.1 NOM-005STPS-1998 NOM-087-ECOL-SSA1-2002 NOM-087-ECOL-SSA1-2002 Apdo. 4, 5, y 6 Reglamento Federal de Higiene y Medio Ambiental del Trabajo. Cap. 12, art. 109 y 110. OM-005-STPS-1998 NOM-005-STPS1998 NOM-005-STPS-1998 NOM-002-STPS-2000, CAP. 5.8, 5.9 NOM025-STPS-1999, CAP. 8, 9, 10
PLANTA FISICA
CONDICIONES GENERALES
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metablico ajustado a 250 rpm y 37 C. Tomar lecturas (muestras de 1 ml) en un espectrofotmetro ajustado a 600 nm, hasta llegar a una lectura de 0.5. 3).- Incubar el matraz en hielo, durante 10 min. Transferir el cultivo a tubos estriles para rotor JA-20 (o equivalente), previamente enfriados en hielo. Centrifugar el cultivo durante 5 min a 4000 rpm y 4 C. 4).- Eliminar el sobrenadante y resuspender suavemente las clulas en 10 ml de una solucin estril de CaCl2 50 mM en Tris/HCl 10 mM. pH 8.
NOTAS: a).- La solucin de calcio debe de estar ajustada a una temperatura de 4 C. b).- Durante la resuspensin de las clulas no utilizar la micropipeta, as como tampoco el vortex.
5).- Centrifugar nuevamente el cultivo, bajo las condiciones descritas en el punto 3. Eliminando el sobrenadante. 6).- Resuspender suavemente las clulas en aproximadamente 1.5 ml de la solucin fra de calcio. 7).- Tomar 2 alcuotas de 0.2 ml y depositarlas en microtubos estriles. Adicionar a uno de los tubos 0.01 ml de la muestra de DNA plasmdico (el obtenido en la cuarta prctica). Dejar el otro tubo como control. 8).- Incubar los tubos en hielo durante 30 min. 9).- Calentar los tubos durante 2 min en un bao ajustado a 42 C. 10).- Transferir los tubos a hielo, adicionarles 1 ml de LB lquido estril, transferir las clulas a tubos de ensaye estriles y agitarlas durante 45 min a 37 C y 220 rpm. 11).- En microtobos estriles efectuar diluciones seriadas (10 en 10) de 0.5 ml, hasta un factor de 1 X 106.
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12).- Sembrar por duplicado 0.1 ml de la resuspensin original y 0.1 ml de las diluciones 10-2, 10-3, 10-4, en placas de LB slido conteniendo ampicilina a 100 g/ ml. 13).- Incubar las cajas a 37 C durante 24 h. Contar las colonias y calcular la eficiencia de transformacin en # de clulas transformantes/ g de DNA. 14).- Se toman muestras de las colonias transformantes, se cultivan, se cosechan y se analizan por restriccin del DNA plasmdico obtenido (tcnica descrita en la cuarta prctica). 49.2 Programa de actividades El desarrollo de la cuarta prctica ser manejado en 3 etapas. El cuidado y manejo del equipo y reactivos sern responsabilidad del docente y de Usted.
ACTIVIDADES 1) El docente explicar de manera breve el manejo de los equipos y materiales que se utilizarn para el desarrollo de la prctica. 2) Cada subgrupo de estudiantes obtendr clulas competentes, las transformar y analizar las colonias transformantes mediante restriccin enzimtica de los plasmidos extrados. 4) Investigacin de los siguientes mecanismos de resistencia a antibiticos:
RESULTADO ESPERADO A travs de la observacin guiada por el docente, el estudiante se familiariza con el equipo y el material que se utilizara para el desarrollo de la prctica, adems conoce los puntos clave para el resultado exitoso de la misma. El estudiante aprender la tcnica de obtencin de clulas competentes de la bacteria intestinal E. coli y su transformacin con DNA plasmdico.
6 das.
Tarea
El estudiante por medio de la lectura, conocer algunos de los mecanismos mediante los cuales las bacterias adquieren resistencia a ciertos antibiticos.
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06/2006
REACTIVOS DNA plasmdico Solucin de CaCl2 en Tris/HCl 10 mM pH 8 Enzimas de restriccin. Agarosa Bromuro de etidio
Nota: Los microtubos deben Nota: Todos los reactivos deben ser manejados estar estriles y de forma cuidadosa y con el uso de guantes de deben manejarse ltex, no pipetear y tener cuidado de no inhalar. con guantes.
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06/2006
Elaboracin de la tarea de investigacin: sta parte de la actividad en el laboratorio tiene la finalidad para que Usted: Desarrolle la habilidad de investigacin bibliogrfica. Logre identificar la aplicacin prctica en su actividad profesional futura.
PONDERACIN
20% 30% 30% 20 %
52. BIBLIOGRAFA
Molecular cloning. A laboratory manual. J. Sambrook. E.F. Fritsch y T. Maniatis (Eds.) Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York 1989. Current Protocols in Molecular Biology. F. Ausbel, R. Brent, R. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.G. Smith, y K. Struhl (Eds.) John Wiley & Sons Inc. 19941995. Gentica en Medicina. R.L. Nussbaum, R.R. McInnes, H.F. Williard. 5 a Edicin. Editorial MASSON. 2004.
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