ENZIMOINMUNOANLISIS (EIA) Son tcnicas inmunoqumicas cuantitativas basadas en reacciones antgeno anticuerpo.

La diferencia consiste en que, en este caso, el marcaje se hace con un enzima en vez de con un istopo radiactivo. Se puede marcar tanto el antgeno como el anticuerpo (hay distintas estrategias). La cuantificacin se hace, por tanto, basndose en la medida de la actividad del enzima marcador. Tras la formacin del complejo antgeno-anticuerpo, en el momento adecuado, se aade un sustrato que es catalizado por el enzima transformndose en un compuesto coloreado lo que permite la medida de la actividad enzimtica con ayuda de un espectrofotmetro. Esta medida de la actividad nos servir para calcular la concentracin de la molcula problema. Al igual que en el caso del radioinmunoanlisis es necesario elaborar una curva patrn. Con objeto de aumentar la sensibilidad de este anlisis es frecuente utilizar el sistema biotina-streptavidina, que acta como mecanismo multiplicador. As, por ejemplo, el anticuerpo est unido a varias molculas de biotina (vitamina). Cada molcula de biotina se une especficamente a varias molculas de estreptavidina (similar a la avidina de huevo, pero de origen bacteriano y mayor afinidad). El enzima est unido a la streptavidina. De esta forma se consigue un efecto multiplicador de la seal. (Ej. 3 molculas de biotina por anticuerpo x 4 molculas de streptavidina, cada una con un enzima, se unen a cada molcula de biotina= 12- enzima en vez de una). Las tcnicas enzimticas presentan numerosas ventajas respecto al radioinmunoanlisis (RIA): No utilizan compuestos radiactivos lo que facilita la manipulacin y evita la necesidad de instalaciones y licencias especficas) Reactivos de larga duracin Posibilidades de automatizacin (estaciones automticas ELISA) . Gran sensibilidad. Los EIA pueden ser de dos tipos: homogneos y heterogneos. Los ensayos homogneos no requieren lavado o separacin fsica de las sustancias reaccionantes antes de medir la actividad enzimtica. Los ensayos heterogneos s necesitan la separacin fsica de los reaccionantes en las fracciones libre y ligada antes de la determinacin de la actividad del enzima marcador. EIA HOMOGNEO No requiere la separacin de las fracciones ligada y libre resultantes de la reaccin inmunolgica. Los reactivos necesarios son el anticuerpo y el antgeno marcado con el enzima. Fundamento: Se basa en la competencia por el anticuerpo entre la sustancia problema y la marcada con el enzima. Cuando el antgeno marcado se une al anticuerpo, este impide el acceso del sustrato al centro activo del enzima, por lo que anula su actividad. A mayor concentracin de la molcula problema, menor cantidad de antgeno marcado se unir al anticuerpo, quedando mayor cantidad de antgeno marcado libre con el enzima activo dando una mayor actividad. En resumen, a mayor concentracin mayor actividad, sin necesidad de separar las fracciones. EIA HETEROGNEO Requiere la separacin de las fracciones ligada y libre resultantes de la reaccin inmunolgica. En esta modalidad, los reactivos son el anticuerpo y el antgeno marcado con el enzima.

Fundamento: El antgeno de la muestra problema y el marcado compiten por el anticuerpo, de forma que cuanto mayor sea la cantidad de antgeno presente en la muestra problema, mayor cantidad de antgeno marcado con el enzima quedar sin unirse al anticuerpo. En este caso la actividad del enzima no se anula por la unin antgenoanticuerpo. Se separan los complejos antgeno (marcado y no marcado)-anticuerpo, se aade el sustrato del enzima para que se produzca la reaccin enzimtica y se mide su actividad. La actividad ser inversamente proporcional a la cantidad de antgeno en la muestra. ELISA Hay una variedad del EIA en la que se utiliza una fase slida como mtodo de separacin, lo que es lo ms habitual, recibe el nombre de ELISA (enzyme linked immunosorbent assay). ELISA TIPO SNDWICH DE ANTGENO Es la variedad de ELISA ms utilizada y que da mejores resultados. Reactivos: Anticuerpo monoclonal ligado a la fase slida, anticuerpo monoclonal marcado con el enzima. Se usan dos anticuerpos monoclonales diferentes contra determinantes distintos del mismo antgeno, lo que permite que los dos se puedan unir al antgeno al mismo tiempo, pero por sitios diferentes. Los anticuerpos especficos se encuentran en exceso unidos a la fase slida (V.g. la pared del tubo de anlisis), de forma que toda la hormona presente en la muestra problema reacciona con ellos quedando inmovilizada. A continuacin se lava el tubo para eliminar el resto de molculas sin inters (no unidas). Se aade un exceso de anticuerpos marcados con la enzima. Estosanticuerpos tambin se unen alantgeno del complejo inmovilizado, pero por otro determinante antignico diferente. Tras otro lavado que elimina el exceso de anticuerpo marcado no unido, se aade el sustrato y se cuantifica la reaccin. La formacin de producto ser directamente proporcional a la concentracin de antgeno en la muestra. (1) LA QUIMIOLUMINISCENCIA La luminiscencia es definida como la emisin de luz asociada con la disipacin de energa con una sustancia electrnicamente excitada. Si los electrones de un componente luminiscente son estimulados por una luz en estado normal, estos dan energa en forma de luz cuando ellos regresan al estado. Tipos de luminiscencia. Hay diferentes formas de luminiscencia, distinguindose por el mecanismo que causa la Fotoluminisencia. En fotoluminiscencia tambin conocida como fluorescente la sustancia es estimulada por fotones de luz, la emisin de la luz con un trazador fluorescente es diferente. En bioluminiscencia, una reaccin qumica medida por enzimas es responsable por la excitacin, y esta reaccin est siempre emparentada a organismos vivos. En quimioluminiscencia, la emisin de luz es causada por los productos de una reaccin especfica qumica, en la cual se involucran las siguientes sustancias segn el sistema automatizado que sea utilizado: ster de acridina, perxido-cido, hidrxido de sodio, fosfatasa alcalina. En el caso de esta reaccin el agente quimioluminiscente es el ster de acridina que es oxidado por el perxido-cido y el hidrxido de sodio.

FUNDAMENTO DE CLIA. Es la cuantificacin de una sustancia, utilizando una reaccin antgeno anticuerpo, un marcador como indicador de la reaccin que puede se el ste de acrinina u otro. Que en combinacin con los reactivos: perxido-cido e hidrxido de sodio, en contacto con la muestra y el analizador proporcionan la reaccin quimioluminiscente. El perxido-cido provee el agente oxidante para el ster de acridina. El hidrxido de sodio, proporciona el cambio de pH necesario para que la reaccin de oxidacin ocurra. La emisin de luz es causada por los productos de una reaccin qumica especfica, involucran. Los ensayos de separacin y no separacin que han sido proyectados, han sido basados en la con la marcacin de ster de acridina. La combinacin de las propiedades de aplicacin de una enzima y una reaccin de deteccin usando quimiluminiscencia o bioluminiscencia proporciona una alta sensibilidad analtica. Los sistemas que la llevan a cabo esta reaccin fueron especialmente diseados para realizar inmunoensayos de una automatizada con tecnologa de vanguardia como lo es la quimilumiscencia, mtodo de lectura con mayor sensibilidad en la actualidad la cual se basa en el principio de emisin de energa luminosa a travs de una reaccin qumica (Enzima Sustrato). La gama de pruebas que conforman su men permite realizar diferentes perfiles de casi todas las reas del laboratorio clnico, empleando reactivos de alta calidad que permiten obtener resultados muy confiables. En la luminiscencia, el antgeno en la muestra del paciente compite covalentemente unido a las partculas paramagnticas para limitar los sitios sobre al anticuerpo marcado con ster de acridina. Una relacin inversa existe entre la concentracin del anticuerpo unido marcado al antgeno, y el antgeno en la muestra del paciente. El ensayo CLIA es de tipo sndwich, el cual el antgeno en la muestra del paciente es sometido en la reaccin sndwich, el anticuerpo covalentemente unido a las partculas paramagnticas y el anticuerpo marcado con ster de acridina. Una relacin directa existe entre la concentracin de antgeno en el muestra del paciente y la cantidad de luz emitida durante la oxidacin de el ster de acridina en la cubeta. Para cuantificar el antgeno en la muestra, el sistema inyecta automatizado un reactivo 1 y despus el reactivo 2 en las cubetas conteniendo la mezcla de reaccin. Esto dispara la reaccin que resulta en la emisin de fotones de luz. El fotomultiplicador (PMT), un fotodetector, detecta los fotones de luz emitida y los convierte en pulsos elctricos. Los sistemas cuentan estos pulsos elctricos, leen y los resultados comparando con una curva maestra definida para cada ensayo, calculando la concentracin. A continuacin se mencionan algunas caractersticas y beneficios generales de estos sistemas:

Los inmunoensayos por quimioluminiscencia evitan los desechos txicos y los resultados que se obtienen son equiparables con Radioinmunoanlisis. Estos sistemas cuentan con refrigeracin integrada (menos el ACS 180 plus de Bayer) conservando los reactivos en buen estado con el mnimo de manipulacin por parte del operador, evita la necesidad de reinicializar el equipo para las pruebas con lo que se puede disponer del equipo en cualquier momento. Tambin pueden trabajar directamente con tubo primario en el cual se recolecta la sangre sin necesidad de copas especiales. Cuenta con lector de cdigo de barras para identificar muestras y reactivos permitiendo un mejor control de los mismos evitando confusiones y disminuyendo el tiempo de programacin. Estos equipos trabajan al menos 5 perfiles de pruebas a una misma muestra sin necesidad de medir o de montar 5 veces la misma muestra lo que disminuye considerablemente el tiempo de trabajo de rutina en el laboratorio.

Capacidad para trabajar de urgencia sin interrumpir el trabajo ya programado en proceso obtenindose el resultado de la urgencia en el mnimo de tiempo independientemente de las otras muestras programadas. Cuentan con acceso continuo de muestras y reactivos necesarios en forma constante sin necesidad de interrumpir el trabajo que se est realizando y as, disminuye y optimiza el tiempo de trabajo de rutina. Tienen capacidad en el refrigerador para 24 reactivos diferentes permitiendo realizar 24 pruebas de manera simultnea a una sola muestra. Todas las pruebas se realizan bajo el mismo principio facilitando con lo cual no importa el orden o tipo de prueba que se le programe a las muestras. El rango de tiempo para la obtencin de los resultados de los perfiles va de 15 a 50 minutos, por ejemplo: un perfil tiroideo se obtiene en 20 o 40 min., perfil ginecolgico igual, un VIH en 20 minutos, una GCH en 17 minutos, etc. La estabilidad de las calibraciones es de 28 das optimizando el costo por prueba (no en todas las pruebas por ejemplo cido flico en el sistema ACS 180 la calibracin dura slo 24 horas). As mismo la estabilidad de los reactivos va de 8 a 12 meses. Tiene capacidad para procesar 60 muestras simultneamente con opcin a seguir programando por medio del software del sistema, el cual reporta los horarios exactos para la obtencin de los resultados. tienen disponibilidad de procesar 294 pruebas sin intervencin del operador e incubar 60 pruebas al mismo tiempo creando horarios exactos para cada prueba. Por lo tanto optimizan los tiempos de rutina. Los sistemas cuentan con deteccin ultrasnica para las muestras y reactivos facilitando la planeacin del trabajo y requerimientos. Asimismo, los equipos monitorean la cantidad de reactivos disponibles a bordo del sistema suministrando datos importantes para la estadstica interna del laboratorio. El sistema reporta los resultados tanto de muestra impresa como en pantalla y se puede consultar momento aunque se encuentre trabajando. Se puede obtener de la memoria resultados de das anteriores ya que posee una memoria para 100 resultados. Las curvas de calibracin pueden ser consultadas en cualquier momento y obtener su reporte impreso, lo que constituye un soporte para la confiabilidad de los resultados.

Los sistemas cuentan adems con una funcin especial para el control de calidad de todas y cada una de las pruebas que realiza con la posibilidad de obtener un reporte impreso diario, semanal, mensual, por lotes de reactivos de manera especfica, etc., as como la curva de levey-Jennins y datos estadsticos correspondientes. Estas y otras caractersticas y ventajas ms ofrecen estos sistemas para la realizacin de este tipo de ensayos dentro del laboratorio clnico.