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INFORME DE LABORATORIO DE FISIOLOGI A ANIMAL: ENZIMAS DIGESTIVAS

Liz Olivera 1, Hernan Cunza1, Alburqueque Pastor1, Lila Rodriguez1, Dayana Rojas1, Addison Rojas1, Ana Lucia Arista1

RESUMEN
Se analizaron las clulas presentes en la sangre de la vaca. Se observaron e identificaron las clulas y corpsculos componentes de la sangre de vaca, determinamos el valor del hematocrito, as como los valores porcentuales de plasma, leucocitos y plaquetas, y por ultimo determinamos la concentracin de hemoglobina. Para ello se extrajo una muestra de sangre de vaca sobre un portaobjetos y se procedi con la tcnica del frotis sanguneo, seguido de la tcnica de Wright-Giemsa para la identificacin de eritrocitos y otros cuerpos sanguneos respectivamente, a travs del microscopio, despus se llen con sangre el tubo Wintrobe hasta 10 mL, se centrifug al 100% durante 45 minutos y se evalu el valor del hematocrito, y por ltimo se realiz el dosaje de hemoglobina utilizando el mtodo de Sahli. Encontrndose la presencia de eritrocitos, basofilos y eosinfilos en la muestra de sangre, con el segundo mtodo se obtuvo un volumen de 3.5mL de eritrocitos por cada 10 mL de sangre, proporcionado un valor de hematocrito del 35%, en el tercer experimento la concentracin de hemoglobina determinada por el mtodo de Sahli fue de 10g%. El valor obtenido del dosaje de hemoglobina en sangre de vaca se encuentra dentro de los valores normales que comprende las oscilaciones en el rango del 9g%-14g%. El hematocrito determinado en sangre de vaca se encuentra entre los valores normales para el animal, que vara entre 24%-46%. ABSTRACT Cells were analyzed in the blood of the cow. Were observed and identified the cells and blood components corpuscles cow determine the hematocrit value, and the percentage values of plasma, leukocytes, and platelets, and ultimately determine the concentration of hemoglobin. For this purpose, a blood sample extracted from cow on a slide and proceeded with the technique of the blood smear, followed by Wright-Giemsa technique for identifying erythrocytes and other blood bodies respectively, through the microscope, then filled Wintrobe blood to the 10 mL tube and centrifuged at 100% for 45 minutes and evaluated the hematocrit value, and finally the dosage was performed using hemoglobin Sahli method. Finding the presence of red cells, basophils and eosinophils in the blood sample, with the second method was obtained erythrocyte volume 3.5ml per 10 mL of blood, provided a hematocrit value of 35%, in the third experiment the concentration hemoglobin determined by the method of Sahli was 10g%. The value obtained from the blood hemoglobin dosage cow is within normal values comprising the oscillations in the range of-14g 9g%%. Determined hematocrit cow blood is between the normal values for the animal, which varies between 24% -46%.
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Alumnos de la carrera de Biologa, Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional Agraria La Molina, Per. Correo electrnico: 20110097@lamolina.edu.pe

I) INTRODUCCION
El sistema digestivo en las aves tiene adaptaciones diseadas para asistir el vuelo. El tamao y el peso del tracto digestivo en las aves es menor que de los mamferos. El pico reemplaza las grandes mandbulas y los dientes. El alimento se ingiere entero y reduce de tamao en la molleja. El sistema digestivo vara entre especies de aves. En aquellas que consumen alimentos blandos de fcil digestin (nctar, frutas) es cortos y simples. Las que consumen carne y granos requieren de estmagos ms grandes e intestinos cortos; y mayor reaccin enzimtica para su digestin. Los que consumen alimentos fibrosos (pastos, vegetales) tienen ciegos desarrollados para alojar una gran cantidad de bacterias fermentadoras de celulosa. El sistema digestivo se compone de un pico, cavidad oral y faringe, esfago, buche, proventrculo, molleja, intestino delgado (yeyuno e leon), intestino grueso (ciego y recto) y cloaca. La digestin es un proceso por la cual los materiales alimenticios complejos son reducidos, mediante enzimas, a unidades simples, fciles de absorcin. As los polisacridos son desdoblados en monosacridos por carbohidrasas, las protenas en aminocidos por proteasas y los triglicridos en cidos grasos y monoglicridos por las lipasas. Los carbohidratos son fuente directa de la mayor parte de la energa de todos los animales. Las enzimas digestivas estn localizadas de forma estratgica a lo largo del tubo digestivo. En el estmago aparece una pequea actividad amilsica, aunque el principal rgano secretor de amilasa es el pncreas. Hasta la primera porcin del duodeno, las actividades disacaridsicas son prcticamente nulas y van aumentando progresivamente hasta alcanzar un mximo a nivel del yeyuno. Despus va disminuyendo y a la altura del ilen terminal, vuelve a alcanzar valores prximos a los obtenidos en la segunda porcin del duodeno. Al comienzo del intestino la actividad maltsica es ms elevada que la sacarsica e isomatsica. Ya que estos catalizadores orgnicos se encuentran en diferentes lugares a lo largo del tracto digestivo, se tiene como objetivo determinar su localizacin y accin frente a sustratos como el almidn y la sacarasa. Un componente importante en la digestin de lpidos es la bilis, una solucin salina de color amarillo verdoso que consiste sobre todo en sales biliares (sales de sodio y potasio de los cidos glucoclico y tauroclico), colesterol, el fosfolpido lecitina y pigmentos biliares, siendo las sales biliares las responsables de la digestin y absorcin de grasas (Frandson y Spurgeon, 1995). A pesar de no presentar componentes enzimticos, su capacidad de romper la tensin superficial de los lquidos y de aislar segmentos (gotitas) de lpidos en virtud a su carcter anfiptico es relevante en la absorcin de nutrientes y por ende, tambin lo es el anlisis siguiente experimental que tiene por objetivo conocer los componentes de la bilis as como sus propiedades fundamentales.

II) MATERIALES
Vsceras de pollo (proventrculo, duodeno, pncreas, molleja y vesicular biliar solo para extraerle la bilis). Equipo de diseccin (Pinzas, bistur, etc). Mortero. Tubos de ensayo. Gradillas. Pipetas. Propipetas. Bao Maria. Sacarosa. Almidn. Agua destilada. Aceite. cido ntrico concentrado. Azufre en polvo. Lugol. Reactivo de Benedict.

III) METODOLOGIA
3.1. PRIMER OBJETIVO: Determinar la localizacin y accin de la amilasa y sacarasa a lo largo del tracto digestivo.
3.1.1. DONDE HAY AMILASA Y SACARASA?

De acuerdo en los rganos seleccionamos, deseamos saber en cul de ellos estn presentes las enzimas sacarasa y amilasa. Para ello primero separamos dichos rganos, los limpiamos. Luego cada uno de ellos, por separado, pasar el procedimiento que va ser descrito a continuacin: Trituramos cada rgano en un el mortero distinto con un poco de agua destilada. Hasta que el agua destilada presentara alguna coloracin turbia. Luego extrajimos el lquido del triturado de cada rgano y colocamos 10 gotas en cada uno de los dos tubos de ensayo, despus, le agregamos 20 gotas de agua destilada a cada uno. Uno de los tubos de rotula con la letra A (activo) y el otro con la letra D (desnaturalizado). El tubo A se mantiene en la gradilla, mientras que el tubo D se lleva a Bao Mara (100oC) por 10 minutos. A partir del tubo A como del tubo D se van a preparar otros dos tubos, al final vamos a tener 4 tubos de ensayo. Los tubos se preparan a partir de lo indicado en el cuadro 1:

TUBO A.1
0.5 ml de almidon 1 ml de tampon fosfato 0.5 ml de enzima activa

TUBO A.2
0.5 ml de sacarosa 1 ml de tampon fosfato 0.5 ml de enzima activa

TUBO D.1
0.5 ml de almidon 1 ml de tampon fosfato 0.5 ml de enzima desnaturalizada

TUBO D.2
0.5 ml de sacarosa 1 ml de tampon fosfato 0.5 ml de enzima adesnaturalizada

Cuadro 1: El cuadro muestra el volumen de cada reactivo empleado en la preparacin de la batera de tubos.

Los tubos A.1 y A.2 se mantienen en la gradilla, mientras que los tubos D.1 y D.2 se llevan a Bao Mara (37oC) por una hora. A los tubos a los que se les aadi almidn, se les agreg lugol. A cada uno de los tubos a los que se les aadi sacarosa, se les extrajeron 10 gotas de su contenido, los cuales fueron colocados en otros tubos. A estos ltimos se les aadi 20 gotas de reactivo de Benedict. Todos ellos fueron llevados a Bao Mara por 5 minutos.

*Cabe resaltar que son varios tubos ya que este procedimiento se realiza para cada uno de los rganos seleccionados, es decir, proventrculo, duodeno, pncreas y molleja.

3.2. SEGUNDO OBJETIVO: Conocer los componentes de la bilis as como sus propiedades fundamentales. Se desarrollaron 3 experimentos independientes, dos de ellos ayudaron a reconocer las propiedades generales de la bilis: emulsificante, reductor de la tensin superficial y el tercero ayudo a reconocer la presencia de los pigmentos biliares.

Se comenz por colocar la vescula biliar, extrada y lavada, en la boca del tubo de ensayo, y con un corte del bistur se extrajo su contenido. Este procedimiento se repiti con todas las vesculas de las que se dispona, y al final se obtuvo un tubo de ensayo con cantidad suficiente para cada experiencia. 3.2.1. Experimento 1: Emulsificacin Se emple dos tubos de ensayo, de tal forma que en el primer tubo se coloc 10 gotas de agua y 2 gotas de aceite, y en el segundo, 10 gotas de agua. 2 gotas de aceite y 2 gotas de bilis. Una vez colocadas las sustancias en los respectivos tubos, se procedi a agitar, esperar y observar.

3.2.2. Experimento 2: Reduccin de la tensin superficial del agua (Reaccin de Hay) Se bas en la reaccin de Hay, la cual es un procedimiento clnico destinado a descubrir la presencia de cidos biliares en la orina. Se agreg 10 gotas de agua destilada en cada uno de los dos tubos de ensayo. Luego, se aadi azufre en polvo en ambos tubos, y a uno de ellos se le adicion 1 gota de bilis. Pasado un lapso de tiempo, se compararon ambos tubos. 3.2.3. Experimento 3: Reconocimiento de los pigmentos biliares (Reaccin de Gmelin) En un tubo de ensayo colocamos 2ml de cido ntrico y luego le agregamos 2 gotas de bilis por las paredes para poder apreciar mejor el viraje de color que presenta.

IV) RESULTADOS
4.1. PRIMER OBJETIVO:

4.1.1. Reaccin con el lugol El lugol evidencia presencia de polisacridos como la de almidn, de glucgeno y de ciertas dextrinas, mas no de monosacridos y disacridos. La presencia de polisacridos indica que no hubo accin degradante de enzimas. Se observan los siguientes resultados en cuadro nmero 2, tras aplicarse lugol a los tubos de ensayo con las siguientes muestras: Con enzimas activas + ++ ++ Con enzimas desnaturalizadas ++ ++ ++ ++

Duodeno Pancreas Molleja Proventrculo

Cuadro 2: El cuadro muestra el resultado del duodeno, pncreas, molleja y proventrculo con el lugol.

++ + -

Presencia de abundantes polisacridos. Reaccin Enzimtica negativa. Presencia de polisacridos, pero solo en trazas. Reaccin Enzimtica parcial. Ausencia de Polisacridos. Reaccin positiva.

4.1.2. Prueba de Benedict Algunos azcares, llamados reductores, tienen la propiedad de oxidarse en presencia de agentes oxidantes suaves como el ion Fe3+ o Cu2+ debido a que tienen un grupo carbonilo libre. El Cu2+ es el que est contenido en el reactivo de Benedict, cuando esta, a ebullicin, no reacciona con carbohidratos, permanece de color azul; por el contario, si hay una reaccin, se evidencia una coloracin verde, amarillo, naranja o rojo ladrillo.

Duodeno Pancreas Molleja Proventrculo

Con enzimas activas verde azul azul verde

Con enzimas desnaturalizadas azul azul azul azul

Cuadro 3: El cuadro muestra el resultado del duodeno, pncreas, molleja y proventrculo con la prueba de Benedict.

4.2.

SEGUNDO OBJETIVO

4.2.1. Experimento 1: Emulsificacin En ambos casos, el aceite se dispuso en la parte superior por diferencia de densidades. El contraste radic en la disgregacin (es decir, agrupado en partculas ms pequeas) de este aceite, producto de la accin de la bilis en el segundo tubo (fig. 2). Esta accin se conoce como emulsificacin.

Fig. 1: Se observa la capa de aceite por encima del agua destilada (A) mientras que en el otro tubo se observan pequeas partculas de aceite (B)

4.2.2. Experimento 2: Reduccin de la tensin superficial del agua (Reaccin de Hay) Se observ que en el tubo que contena solo agua destilada, el azufre se concentraba en la superficie del lquido; mientras que en el tubo que contena la bilis, el azufre se concentraba en la parte inferior. (fig. 1)

Fig. 2: Se observan el tubo (A) con bilis y el tubo (B) con agua destilada. El azufre en polvo, de color amarillo, se ubic en la parte inferior en el tubo A

4.2.3.

Experimento 3: Reconocimiento de los pigmentos biliares (Reaccin de Gmelin) El color de la bilis extrada de la vescula, y del cual se parti, se deba al pigmento biliverdina. El cido ntrico concentrado ayud a diferenciar los otros pigmentos de la bilis. La muestra del tubo se disgreg en dos sustancias distintas: Uno, de color fucsia, situado inicialmente en la parte superior del tubo, pero que solo se pudo apreciar por un corto tiempo luego del cual desapareci; y el otro, de color amarillo, que inicialmente ocup la parte basal del tubo, y luego todo el volumen (fig. 4).

Fig. 3: se observa la diferencia de colores por la presencia de los 2 pigmentos de la bilis

V) DISCUSIONES
Las sales biliares poseen la propiedad de reducir la tensin superficial (Hickman et al. 1998). Colectivamente, los enlaces de hidrgeno mantienen la sustancia (el agua) unida, mediante un fenmeno denominado cohesin, en relacin con esta fuerza existe la tensin superficial, una medida de la dificultad para estirar o romper la superficie de un lquido (Campbell et al. 2007). De todo ello, se deduce que las sales biliares (principalmente taurocolato sdico y glicolato sdico) rompen los enlaces de hidrgeno entre las molculas de agua, de tal modo que el azufre aadido cae hacia la parte inferior del tubo. La bilis facilita la formacin de unas estructuras denominadas MICELAS, las cuales favorecen la accin de las enzimas lipolticas pancreticas. Las sales biliares orientan los enlaces ster de los lpidos hacia la superficie de la micela, logrando que estn ms dispuestos a la digestin por parte de las lipasas pancreticas a nivel del duodeno (fig. 4).

Fig. 4: Visualizacin de las micelas con los enlaces ster orientados por las sales biliares

La bilis, principal va de eliminacin del colesterol, es una solucin isotnica, formada por cidos, sales y pigmentos biliares, as como de colesterol, fosfolpidos, electrolitos inorgnicos, mucina, mltiples metabolitos y agua. Presenta osmolaridad semejante a

la del plasma (300 mOsm/mL) y un pH entre 6 y 8,8. En la siguiente tabla se encuentran las concentraciones de sus principales componentes.

Concentracin de Electrolitos en la Bilis Humana Componente Na K


+ ++ ++ +

Concentracin (mEq/L) 132 a 165 4,2 a 5,6 0,6 a 2,4 0,7 a 1,5 96 a 126 17 a 55 3 a 45

Ca Cl
-

Mg

HCO3Ac. Biliares

Las bilirrubinas proceden del catabolismo de la hemoglobina en el sistema retculo endotelial de varias localizaciones en el organismo como el bazo y la mdula sea, a partir de la abertura del anillo tetra-pirrlico del radical heme, originando la biliverdina-ferro-globina. El hierro y la globina se separan formando la biliverdina que, tras la reduccin, da origen a bilirrubina no conjugada o indirecta, insoluble en agua, pero que es llevada al hgado por la albmina, donde en el interior del hepatocito se liga a glutation-S-transferasa y a protena Z, siendo entonces conjugada a cido glucurnico, formando monoglucurnidos de bilirrubina, proceso catalizado por la uridina-difosfato-glucuronato-glucuronil-transferasa (UDPGT), pasando a bilirrubina conjugada (diglucurnica) o bilirrubina directa, que es hidrosoluble y es excretada hacia los canales biliares y de ah hacia el intestino, donde es reducida por la accin de bacterias a urobilingeno (mesobilirrubingeno, estercobilirrubingeno y dbilirrubingeno). Cerca del 80% del urobilingeno es excretado en las heces y el 20% es reabsorbido por la circulacin entero-heptica, siendo nuevamente transformado en bilirrubina. Apenas una pequea parte escapa de este proceso, siendo excretado por la orina (Mies & Alfieri, 2001). La reaccin de Gmeil, realizada en la experiencia, evidenci precisamente el proceso de reduccin de la biliverdina hasta la bilirrubina; el cual fue verificado por los cambios de coloracin respectivos a cada estado de oxidacin. Los cidos biliares provienen esencialmente del catabolismo del colesterol y son sintetizados exclusivamente por el hgado, formando derivados glucoclicos y tauroclicos, presentes en la bilis como sales de sodio y de potasio. En el intestino, promueven la formacin de micelas de lpidos provenientes de la ingesta alimentaria, despus son reabsorbidos en el leon terminal, formando una circulacin enteroheptica, 6 a 8 veces al da. La capacidad de emulsificar los lpidos est atribuida a la naturaleza antiptica de tales cidos, que en su interaccin con el medio acuoso, altera la tensin superficial de la matriz provocando la formacin de micelas de menor volumen y aumentando su superficie de contacto. Estas propiedades fueron verificadas con la prueba de Hay.

En el pncreas, la reaccin de Lugol fue negativa, lo cual indica la ausencia de almidn. Este resultado, a su vez, nos indica la presencia de la enzima amilasa en dicho rgano. Sin embargo, en la prueba de Benedict, se produjo una reaccin negativa (coloracin azul), lo que quiere decir que no haba presencia de azucares reductores y por lo tanto se dedujo que enzimas como la sacarasa (que degrada sacarosa, un disacrido compuesto por glucosa y fructosa) estaban ausentes en dicho rgano. Esto concuerda con Leonel Vaca (1998), quien afirma que las secreciones pancreticas en el pollo se componen de enzimas como las amilasas, proteasas y lipasas que actan sobre almidn, protenas y grasas, respectivamente. En la molleja, la reaccin con Lugol fue positiva, lo que nos indic la presencia de almidn en la muestra estudiada. A su vez, en la prueda de Benedict, se produjo una reaccin negativa, lo cual significa que no haba azucares reductores en la muestra. A partir de estos resultados, deducimos que ni la enzima amilasa ni la sacarasa se encuentran presentes en el rgano analizado. Ambos resultados concuerdan con Ilena Brautigan (2002) quien afirma que la molleja es el estmago muscular encargado de la digestin mecnica (trituracin de los alimentos) y que, por lo tanto, dicho rgano no presenta secreciones enzimticas. El proceso digestivo en el duodeno se realiza gracias a tres secreciones, las cuales consisten en: el jugo pancretico, producido por el pncreas; la bilis, producida por el hgado, y el jugo intestinal, producido por la mucosa intestinal (Le Vay, 2008). El jugo pancretico est compuesto por enzimas, agua y bicarbonato de sodio. Este ltimo sirve para neutralizar la acidez del quimo proveniente del estmago, para que puedan actuar las enzimas. Las enzimas del jugo pancretico son la tripsina y quimiotripsina (proteasas activadas), la amilasa pancretica y la lipasa pancretica, cuya accin requiere de la bilis, que emulsifica las grasas. Por ltimo, el jugo intestinal contiene algunas enzimas proteolticas, lipasa intestinal, y disacaridasas, por ejemplo, la invertasa sacarasa, la maltasa, y la lactasa. Los resultados de la experiencia con el lugol indican que s hubo accin enzimtica sobre los polisacridos en el duodeno, pero en poca medida a comparacin del pncreas, donde la accin enzimtica fue total. Esto era de esperar debido a que el pncreas contiene amilasa, mientras que el jugo intestinal contiene disacaridasas. Por otro lado, la accin enzimtica parcial sobre los polisacridos puede haberse causado gracias al jugo pancretico, debido a que este es vertido en el duodeno junto a la bilis como parte del proceso digestivo (Le Vay, 2008).

En cuanto a la experiencia con el reactivo de Benedict en el duodeno, tambin era de esperar que hubiera una reaccin enzimtica positiva, debido a las disacaridasas presentes en el jugo intestinal, propias de este rgano. El duodeno era el nico rgano que deba presentar disacaridasas, pero los resultados tambin dieron positivos para el proventrculo. Segn Hinsch (1967) existen aldolasas en el proventrculo, adems del HCl y la pepsina, los constituyentes ms conocidos. Estas aldolasas catalizan la

escisin de la fructosa-1,6-bisfosfato en dos triosas, dihidroxiacetona fosfato y gliceraldehdo 3-fosfato, ambos azcares reductores que pueden dar resultados positivos con la prueba de Benedict. Esto explicara el cambio de color tanto en el duodeno y en el proventrculo, ms no en la molleja ni en el pncreas, al tener estos ltimos respectivamente, funciones de digestin mecnica, y de digestin qumica de polisacridos.

VI) CONCLUSIONES
La regin intestinal del sistema digestivo del pollo es la que realiza el mayor porcentaje de degradacin, a juzgar por la mayor cantidad de enzimas presentes (las amilasa y sacarasa intestinales frente a la sacarasa proventricular) y por su mayor actividad enzimtica. La bilis es un compuesto anexo a la digestin, el cual, a pesar de no contener enzmas, constituye una sustancia coadyuvante de la digestin, ya que sin su presencia, la accin de enzimas como la lipasa pancretica se vera reducida en mucho. Los diferentes rganos que componen el sistema digestivo presentan un conjunto de enzimas caractersticas que varan de acuerdo a los procesos de digestin particulares que cada uno llevan a cabo.

VII) RECOMENTACIONES
El seccionamiento y lavado del tracto gastrointestinal debe realizarse con mayor precisin y limpieza. Procurar que la extraccin de la bilis no se contamine con algn tipo de partculas de la vescula biliar o del medio

VII) BIBLIOGRAFIA
Campbell y Reece, P. 2007. Biologa. Sptima Edicin. Editorial Medica Panamericana. Espaa. 1351 pp. Hill; Wyse y Anderson. P. 2006. Fisiologa Animal. Sptima Edicin. Editorial Medica Panamericana. Espaa. 932 pp. Mies S, Alfieri Jr F. Anatomia e Fisiologia do Fgado. In: Kalil NA, Coelho J, Strauss E. Fgado e Vias Biliares, Revinter Ed, Rio de Janeiro, 2001, pp 3-10. Le Vay, David (2008). ANATOMA Y FISIOLOGA HUMANA. Segunda edicin. Barcelona: editorial Paidotribo. Pp. 224-225. Hinsc, Gertrude W. Oxidative enzyme histochemistry of the chick esophagus and proventriculus. Journal of Morphology. - New York, NY : Wiley-Liss, ISSN 0362-2525, ZDB-ID 1479991-1 Vol. 123 (2. 1967), p. 121-131 Frandson, R. D. Spurgeon T. L. Anatoma y fisiologa de los Animales Domsticos. 5ta Edicin. 1995. Editorial Mac-Graw Hill Interamericana. Impreso en Mxico. Pg. 354. Hickman. Roberts. Larson. Principios Integrales de Zoologa. 10ma Edicin. Editorial McGraw-Hill-Interamericana. 1998. Impreso en Espaa. Pgs. 709, 734 y 735 Hoar, W. Hickman, C. Manual de Laboratorio para Fisiologa General Y Comparada. 1978. Ediciones Omega, S. A. Impreso en Barcelona, Espaa. Pg. 13. Distribucin de enzimas digestivos. Hoffmann, G. Vlker, H. Anatoma y Fisiologa de las Aves Domsticas. Primera Edicin en Espaol. 1969. Editorial Acribia. Impreso en Espaa. Pgs. 74, 81. Martnez Rodrguez, Ricardo. Fundamentos Tericos y Prcticos de la Histoqumica. Primera edicin. Editorial de la CSIC-Dpto. de Publicaciones. Espaa. 2008. pg 339.