DETECCIN DE METABOLITOS DE DROGAS DE ABUSO POR CROMATOGRAFA DE GASES ACOPLADO A ESPECTROMETRA DE MASAS

Ernesto Bernal Morales P.G.J. del Estado de Mxico

DEFINICIN DE DROGA DE ABUSO

Bajo

el nombre genrico de drogas de abuso se pueden incluir una largusima lista de sustancias qumicas de diverso origen que pueden ser susceptibles de consumo con fines no teraputicos

Gisbert Calabuig Medicina Legal y Toxiologia Ed. Masson Barcelona 2001

CLASIFICACIN DE DROGAS DE ABUSO

Alcohol

etlico Opiceos Inhalantes Cocana Anfetaminas y sustancias afines Otros estimulantes (Caf, Khat, etc.) Derivados de la Cannabis Sativa Alucingenos (PCP, LSD, etc.) Hipnticos y ansiolticos Tabaco

EFECTOS FARMACOLGICOS

Compuestos psicoactivos
Estimulantes

(cocana, anfetaminas) Depresores (alcohol etlico) Narcticos (opiceos) Alucingenos (Cannabis sativa, PCP, LSD)

REAS DE APLICACIN DE LA TOXICOLOGA FORENSE Y EL ANLISIS DE DROGAS

Medico Legal
Postmortem

Causa y modo de la muerte Identificar personas que manejan bajo la influencia de drogas (DUI y DUID) Correccionales, fianza, etc.

Laboral
Programas

pblicos y privados para la deteccin de drogas en empleados Olmpicos, Tour de France, etc.

Deporte
Juegos

FUNCIONES DE LA TOXICOLOGA FORENSE

Identificacin

de un agente lesivo Sustancias que produzcan una alteracin psquica pasajera o permanente Intoxicacin como circunstancia calificadora de un delito Intoxicacin como delito Intoxicacin como estado peligroso

INVESTIGACIN TOXICOLGICA
Es

el conjunto de procesos analticos que tienen por objeto el aislamiento, identificacin y determinacin cualitativa o cuantitativa de los txicos tanto en vivo como en el cadver, con el fin de permitir el diagnostico de intoxicacin y el esclarecimiento de los hechos.

RECOMENDACIONES PATA LA INVESTIGACIN TOXICOLGICA FORENSE (ORFILA)

Todo los analistas deben de tener experiencia en Toxicologa. El analista debe de recibir la historia completa del caso con toda la informacin disponible. Todas las evidencias correctamente etiquetadas y selladas en recipiente limpios deben ser remitidas y analizadas. Todas las pruebas analticas deben ser aplicadas. Los reactivos tendrn que ser puros y tendrn que correrse siempre blancos. El anlisis debe de hacerse por duplicado.

PASOS DE LA INVESTIGACIN TOXICOLGICA

Informacin Toma de Muestra Procesamiento de la muestra

Aislamiento, Concentracin Hidrlisis, digestin, desproteinizacion, etc.

Diferenciacin y deteccin Identificacin

Comparacin datos encontrados con bases de datos de referencia

Cuantificacin Interpretacin de los resultados

INFORMACIN QUE DEBE SER ENVIADA AL ANALISTA FORENSE

Nombre, edad, sexo, peso, nacionalidad, ocupacin Historia Clnica (Drogas prescritas, adicciones, sospechas) Cuando fue vista por ultima vez la vctima?Donde fue encontrada? Si estaba enferma Desde cuando? Datos sobre tratamiento medico, anlisis previos hechos Sntomas Declaracin de testigo de los hechos y Testigos de identidad. Descripcin de la escena del crimen Necropsia
Clarkes Analysis of Drugs and Poisons, ed. AC Moffat, MD Osselton, B. Widdop Pharmaceutical Press London (2004).

CLASIFICACIN DE TXICOS

Clarkes Analysis of Drugs and Poisons, ed. AC Moffat, MD Osselton, B. Widdop Pharmaceutical Press London (2004).

ANLISIS DE DROGAS EN MUESTRAS BIOLGICAS

El anlisis es posible en todas las muestras biolgicas Diferentes muestras biolgicas dan diferente informacin Interrelacin entre las muestras Ventanas de Deteccin

ESPECMENES PARA BSQUEDA DE DROGAS

Vivos
Sangre* Orina Fluido Pelo Sudor Aliento

Muertos
Sangre Orina Humor Tejidos

Oral

Vtreo

Muestra

Cantidad
SOFT/ Tox.Rev.2005,24 AAFS (1): 63-71

Comentarios

Sangr e total

Perifric a Corazn

10 ml 25 ml

2 x 5 ml (sellada)* 10 30 ml

Vena Femoral c/preservativo Ventrculo derecho o vena cava inferior.S/ Preservativo C/preservativo S/preservativo S/preservativo C/preservativo C/preservativo Lbulo derecho (Hgado), s/formol, en recipientes de vidrio por separado. Regin occipital. Desde la

Orina Contenido Gstrico Humor vtreo Bilis Vsceras Hgado

Rin Cerebro

Toda Todo Todo Toda 50 g

5 ml (sellada) 20 50 ml 25 50 ml Ambos ojos (sellado) 10 ml 10 20 g

Pelo

Mechn ancho de

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE DIFERENTES MUESTRAS

Muestra
Sangre
(Total /Suero/plasm a)

Ventajas
Detecta Droga, anlisis cuantitativo Volumen elevado, altas concentraciones Altas concentraciones

Desventajas
Volumen reducido, bajas concentraciones, droga padre y metabolitos

Orina

No siempre disponible, metabolitos, anlisis cuantitativo no siempre til Muestra variable, No siempre til

Contenido Gstrico Pelo y uas Humor Vtreo

Siempre disponible Requiere alta sensibilidad, exposicin de semanas a meses Putrefaccin limitada Volumen limitado

DIFICULTAD DEL ANLISIS QUMICO DE ESPECIMENES BIOLGICOS

de Fluidez Muestra
Lquido Cefalorraqudeo Lagrimas Saliva Orina Bilis Mixto Plasma Suero Sangre Slidos Cerebro Corazn, rin, hgado Pulmn, msculo

Lquido

Hueso

APROXIMACIONES AL ANLISIS TOXICOLGICO

Enfocado
A

una droga en particular una familia de Drogas gran cantidad de drogas

Limitado
A

Comprensivo
Una

MTODOS PARA EL ANLISIS DE DROGAS DE ABUSO

Presuntivas Inmunoensayos enzimaticos (EIA) Inmunoensayo por fluorescencia polarizada (FPIA) Radioinmunoanlisis (RIA) Cromatografa de capa fina (CCF) Confirmacin Cromatografa de lquidos espectrometria de masas (CL-EM) Cromatografa de gases - Espectrometra de masas (CG-EM) Electroforesis CapilarEspectrometria de masas (EC-EM)

MTODOS PRESUNTIVOS

Anlisis inicial Screening

Identificar muestras negativas

Selectivos a familias de drogas Sensibles Rpidos Barato

Negativo es negativo Positivo necesita confirmarse Inmunoensayos Cromatografa en capa fina

INMUNOENSAYOS
Radioinmunoensayo (RIA) Inmunoensayo enzimtico (EMIT, CEDIA) Inmunoensayo por Polarizacin de la fluorescencia (FPIA) Interaccin cintica de microparticulas en solucin (KIMS) Ensayo por enzima unida a inmunoabsorbente (ELISA)

INMUNOENSAYOS PRINCIPIO -

CARACTERSTICAS GENERALES DE LOS INMUNOENSAYOS

EIA Instrumentacin Si Estabilidad de los reactivos Costo de los reactivos Automatizacin Pruebas/ 8 horas FPIA Si RIA Si LAI No

Meses Meses 3-4 aos semanas ++ Si 100400 ++ Si 250300 + Si 200-400 +++ No 200-350

ANLISIS TOXICOLGICO PRUEBAS PRESUNTIVAS -

Equipo Viva Twin P.G.J.E.M.

PROCESO DE LA MUESTRA PARA INMUNOENSAYOS

Orina

Centrifugar la muestra Desproteinizacion

Sangre

Disolventes
Metanol Acetona Cloroformo Acetonitrilo

Acido sulfosalicilico N,N Dimetilformamida Humor vtreo

Centrifugacin Dilucin

ANLISIS TOXICOLGICO

- PRUEBA CONFIRMATIVA

Un segundo anlisis, empleando generalmente una tcnica con un principio qumico diferente a la prueba presuntiva.

Tcnica cromatografica acoplada a una espectrometra

CG/EM, CL/EM

Identifica sustancias Sensibilidad Generalmente, cuantitativa Mas confiable (Validez Legal)

CROMATOGRAFA

Definicin
Es

un mtodo de separacin basado en la diferente distribucin de los componentes de una muestra entre una fase mvil y una fase estacionaria. Adsorcin: basado en diferencias en la afinidad entre una fase mvil y la fase estacionaria. Particin: Diferencias en la solubilidad entre una fase liquida estacionaria y una fase mvil lquida o gaseosa.
Principles on Forensic Toxicology Barry Levine AACC Press (2004)

CROMATOGRAFA HISTORIA 1903 -1906 Tswett 1929 Lederer 1938 -1939 Ismailov y Shraiber (CCF) 1941 1952 Martin, Synge and James (CG) 1950 M.J.E. Golay 1960 CL 1960 CG- EM

TCNICAS DE SEPARACIN Y SISTEMAS DE FASES

Extraccin lquido lquido (ELL) Extraccin en fase slida (EFS) Cromatografa en capa fina Cromatografa en columna Cromatografa de Lquidos Cromatografa de Gases L/S

L/L L/S L/S L/S L/L L/L y

CROMATOGRAFO DE GASES

Sustancias trmicamente estables y voltiles

QUE PROPORCIONA LA CROMATOGRAFA DE GASES?

SEPARACION
Diferencia

analitos entre ellos y entre los componentes de la matriz por las diferencias de afinidad del analito por la fase estacionaria y la fase mvil

PARAMETRO DE RETENCION
Determinado

Parmetro cualitativo RESPUESTA DEL DETECTOR

Seales

del detector son proporcionales a la concentracin de la sustancia

Parmetro cuantitativo

DETECTORES CG
REF

Conductividad trmica El par de filamentos se calienta cuando la muestra diluye el gas portador

PMT

2 H

Fotomtrico de llama Un filtro ptico selecciona longitudes de onda especficas de compuestos de P o S

32

Air e
H

Ionizacin de llama La combustin produce partculas cargadas que el colector convierte en una corriente

Termoinico NP Los compuestos de N o P aumentan la corriente en el plasma de la sal metlica vaporizada

Captura electrnica La prdida de electrones lentos por absorcin de la muestra disminuye la corriente en la celda

Ion Fuente Analizado r EM

Detector selectivo de masas La muestra ionizada es medida en un analizador de masas

COMPARACIN ENTRE DETECTORES DE GC

TCD FID ECD NPD(N) NPD(P) FPD(S) MSD (SIM) 10-15 fg 10-12 pg (SCAN) 10-9 ng 10-6 ug 10-3 mg

1 ng en 1 ul lquido (sg = 1) es concentracin 1 ppm El detector selectivo de masas es: Especfico y universal

DETECCIN MULTIDIMENSIONAL

Espectrometra de masas
Analitos

son transformados en iones cargados o fragmentos los cuales son subsecuentemente separados de acuerdo a su radio masa /carga y sus abundancias son medidas informacin acerca de la estructura molecular del analito de los analitos (comparacin con bases de datos)

Proporciona

Identificacin

PROCESO

UN ESPECTRO DE MASAS TPICO

Abundancia 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 m/z-> 20 29 55 98 40 60 80 100 113 128 141 140 170 159 160 180 85 <--[C H ] + 6 13 43 71 + <--[C H ] 5 11 Dodecano: C12H26 Espectro medio de dodecano por EVALDEMO.D 57 <--[C H ] + (Pico base) 4 9

+ . M (Precursor)

120

Ion molecular (ion precursor): prdida de un electrn Pico base: ion ms abundante en el espectro

 Preparacin
Disgregar

de la muestra

la materia orgnica (slidas) Hidrlisis (protena, glucuronidos) Extraccin con una fase orgnica

EXTRACCIN DE DROGAS DE MUESTRAS BIOLGICAS

Muestras slidas
Extraccin lquido-slida (soxhlet, bligh & Dyer) Dispersin de la matriz en fase slida (MSPD) Extraccin de Fluidos supercrtico (SFE) Extraccin acelerada de disolvente (ASE) Extraccin asistida por microondas (MAE)

Matrices Lquidas Extraccin lquido-lquido Extraccin en fase slida (discos, cartuchos) Microextraccin en fase slida

ERRORES EN EL ANALISIS DE COMPUESTOS ORGANICOS

METABOLISMO

FACTORES QUE DETERMINAN LA DETECTABILIDAD DE LAS DROGAS

Tipo de droga Dosis consumida Frecuencia de uso Espcimen biolgico utilizado Diferencias individuales en metabolismo Momento de recoleccin vs consumo Sensibilidad del mtodo

Chiang y Hawks, 1986

LIMITACIONES ANLISIS DE DROGASDrogas detectables pero debajo del nivel de corte (Negativo) No pueden indicar la cantidad de droga consumida No puede indicar cuando se consumi No puede indicar la fuente de la droga

LIMITACIONES ANLISIS DE DROGAS -

Muchos inmunoensayos no detectan algunos opiceos sintticos o semisinteticos (oxicodona, metadona, etc) No existen inmunoensayos para muchas drogas Algunas drogas requieren de inmunoensayos especficos

Lic. Mario Alberto Carrasco Alcntara Director del Instituto de Servicios Periciales de la P.G.J.E.M. Q. Moiss Saldvar Rodarte Jefe del Laboratorio de Qumica del Instituto de Servicios Periciales de la P.G.J.E.M.