CULTIVO DE VIRUS

Puesto que son incapaces de reproducirse independientemente de clulas vivas, los virus no pueden cultivarse del mismo modo que los microorganismos procariotas y eucariotas. Durante muchos aos los investigadores han cultivado virus de inoculando huspedes animales adecuados o huevos embrionados huevos de gallina fertilizados incubados durante aproximadamente 6-8 das despus de la puesta. Para preparar el huevo para el cultivo de virus, la superficie de la cascara se desinfecta primero con iodo y se perfora con una pequea taladradora estril. Despus de la inoculacin, el agujero se sella con gelatina y e incuba el huevo. Algunos virus se reproducen nicamente en ciertas partes del embrin, por ello deben inyectarse en la regin adecuada. Por ejemplo, el virus del mixoma crece bien en la membrana corioalantoidea, mientras que el virus de las paperas crecen mejor en la cavidad alantoidea. La infeccin puede producir una lesin en el tejido local conocida como pustula, cuya apariencia a menudo es caracterstica del virus.

Ms recientemente se han cultivado virus de animales en cultivos de tejidos (clulas) en monocapas de clulas animales. Esta tcnica ha sido posible gracias al desarrollo de medios de cultivo para clulas animales y al uso de agentes antimicrobianos que evitan la contaminacin por bacterias y hongos. Los virus se aaden a la capa de clulas animales en una placa de Petri especialmente preparada y se deja un tiempo para que se adhieran a las clulas. Las clulas se cubren entonces con una fina capa de agar para limitar la dispersin en viriones de manera que solo las clulas adyacentes sean infectadas por los viriones recin producidos. Como resultado, se acostumbran a formar reas localizadas de destruccin celular y lisis denominadas placas o calvas, que se pueden detectar si se tien con colorantes, como el rojo neutro o el azul tripano, que permiten distinguir las clulas vivas de las muertas. El crecimiento vrico no siempre resulta en la lisis de las clulas para formar una placa. Los virus de animales, en particular, pueden causar daos o anomalas degenerativas microscpicas o macroscpicas en las clulas husped y en los tejidos. A esto se le denomina efecto citopatico. Los efectos citopaticos pueden ser letales, pero no siempre produce la formacin de placas por lisis celular. Los virus de bacterias y de arqueas se cultivan en cultivos solidos o liquidos de clulas jvenes, creciendo activamente. En algunos cultivos infectados se destruyen tantas clulas husped que los cultivos turbios se clarifican rpidamente por la lisis celular. Los cultivos son agar se preparan mezclando los virus con agar liquido atemperado y un cultivo de las clulas husped adecuadas. La mezcla se vierte rpidamente en una placa de petri que contenga una capa de agar esteril. Despus de que se endurezca, las clulas en la capa de agar superior crecern y se reproducirn, formando una capa continua, opaca o csped. All donde caiga un virion en el agar superior, el virus infectara la clula adyacente y se reproducir. Finalmente, la lisis de las clulas genera una placa o zona clara en el csped. Los virus de plantas se cultivan de varias maneras. Se pueden utilizar cultivos de tejidos de plantas, cultivos de clulas independientes, o cultivos de protoplastos (clulas que carecen de paredes celulares). Los virus tambin pueden cultivarse en plantas enteras. Las hojas se inoculan mecnicamente frotndolas con una mezcla de virus y una sustancia abrasiva. Cuando esta sustancia rompe las paredes celulares, los virus entran en contacto directo con la membrana plasmtica e infectan las clulas husped expuestas. ( En la naturaleza, el papel de la sustancia abrasiva lo desempean insectos que digieren o trituran las hojas de las plantas transmitiendo as los virus). A menudo se desarrolla una lesin necrtica localizada como consecuencia de la rpida muerte de las clulas del rea infectada. Incluso cuando no se producen lesiones, la planta infectada puede mostrar sntomas como cambios de pigmentacin o en la forma de la hoja. Algunos virus de plantas pueden transmitirse solo si una parte enferma se injerta en una planta sana.

Muchos virus pueden desarrollarse en cultivos celulares o en huevos frtiles en condiciones estrictamente controladas. Sigue recurrindose al crecimiento de los virus en animales para el aislamiento primario de algunos de ellos, y para los estudios de la patogenia de las enfermedades virales y de la oncognesis viral. En los laboratorios de diagnstico se intenta recuperar a los virus de las muestras clnicas para establecer los aspectos etiolgicos de las enfermedades. En los laboratorios de investigacin se cultivan virus como base de los anlisis detallados de la expresin y la replicacin virales. La disponibilidad de clulas desarrolladas in vitro ha facilitado la identificacin y el cultivo de virus recin aislados y la caracterizacin de los que ya se conocan. Hay tres tipos bsicos de cultivo celular. Los cultivos primarios se efectan mediante dispersin de clulas (por lo general con tripsina) de tejidos huspedes recin extirpados. En general no pueden crecer ms all de unos cuantos pasos en cultivo, como cultivos secundarios. Las lneas celulares diploides son cultivos secundarios que han experimentado un cambio que permite su cultivo limitado (hasta 50 pasos), pero que retienen su patrn cromosmico normal. Las lneas celulares continuas son cultivos capaces de crecimiento ms prolongado, quiz indefinido, y que se han obtenido de lneas celulares diploides o de tejidos malignos. Invariablemente tienen nmeros alterados e irregulares de cromosomas. El tipo de cultivo celular que se emplee para cultivar virus depende de la sensibilidad de las clulas a tal virus particular. Identificacin de clulas infectadas por virus: Es posible vigilar la multiplicacin de un virus de diversas maneras: l. Desarrollo de efectos citopticos, es decir, cambios morfolgicos en las clulas. Los tipos de efectos citopticos inducidos por virus consisten en lisis o necrosis celulares, formacin de inclusiones, formacin de clulas gigantes y vacuolizacin citoplsmica. La mayor parte de los virus producen algn efecto citoptico manifiesto en las clulas infectadas que es, en general, caracterstico del grupo del virus. 2. Aparicin de una protena codificada por el virus, como la hemaglutinina del virus de la influenza. Se pueden emplear antisueros especficos para identificar la sntesis de protenas virales en las clulas infectadas. 3. Adsorcin de eritrocitos a las clulas infectadas, tcnica que se llama hemadsorcin, a causa de la presencia de hemaglutinina codificada por el virus (parainfluenza, influenza) en las membranas celulares. Esta reaccin se vuelve positiva antes que sean visibles los cambios citopticos y, en algunos casos, ocurre en ausencia de stos. 4. Interferencia por un virus no citopatgeno (por ejemplo, el de la rubola) con la replicacin e induccin de efectos citopticos por un segundo virus de carga (por ejemplo, echovirus) que se aade como indicador.

5. Transformacin morfolgica por un virus oncgeno (por ejemplo, virus del sarcoma de Rous), que suele acompaarse de prdida de la inhibicin de contacto y acumulacin de clulas en focos definidos. Durante la multiplicacin de los virus en el interior de las clulas, pueden producirse estructuras especficas de virus, denominadas cuerpos de inclusin. Estas estructuras llegan a ser mucho ms grandes que las partculas individuales del virus, y a menudo muestran afinidad para los colorantes cidos (por ejemplo, la eosina). Pueden situarse en el ncleo (herpesvirus), en el citoplasma (poxvirus) o en ambos (virus del sarampin). En muchas infecciones virales, los cuerpos de inclusin son el sitio de desarrollo del virin (la fbrica del virus). En algunas infecciones (poxvirus, reovirus), el cuerpo de inclusin consiste en masas de partculas virales en el proceso de replicacin. Aun en otros casos ms, como en el cuerpo de inclusin intranuclear del herpes, el virus se multiplica en una etapa ms temprana de la infeccin y el cuerpo de inclusin parece ser un producto residual de la multiplicacin viral. Las variaciones en el aspecto del material de inclusin, dependen de la composicin del fijador tisular empleado. La presencia de cuerpos de inclusin puede ser de considerable utilidad en el diagnstico. Las inclusiones intracitoplsmicas de las clulas nerviosas, denominadas cuerpos de Negri, son patognomnicas de la rabia.

PURIFICACION Y ENSAYOS VIRICOS

Los virlogos deben ser capaces de purificar los virus y determinar de forma precisa su concentracin para estudiar la estructura vrica, la reproduccin, y otros aspectos de su biologa. Estos mtodos son tan importantes que el crecimiento de la virologa como disciplina moderna dependi de su desarrollo. PURIFICACION DE VIRUS La purificacin saca provecho de varias caractersticas de los virus. Los viriones son muy grandes en relacin a las protenas, y a menudo son ms estables que los componentes celulares normales, y tienen protenas de superficie. Gracias a estas caractersticas, se pueden emplear para aislar virus muchas tcnicas tiles para el aislamiento de protenas. Cuatro de los mtodos ms ampliamente utilizados son 1. 2. 3. 4. Centrifugacin diferencial y en gradiente de densidad Precipitacin de virus Desnaturalizacin de contaminantes Digestin enzimtica de constituyentes celulares.

La centrifugacin diferencial y en gradiente de densidad se utiliza a menudo en los pasos iniciales de la purificacin para separar las partculas vricas de la clula husped. El proceso se realiza con clulas husped en fases tardas de la infeccin ya que contienen viriones maduros. Primero las clulas infectadas se rompen en un tampn para obtener una suspensin acuosa u homogenado consistente en componentes celulares y virus. Los virus pueden aislarse entonces por centrifugacin diferencial, la centrifugacin de una suspensin a diferentes velocidades para separar partculas de tamaos diferentes. Normalmente el homogenado se centrifuga primero a una velocidad elevada para sedimentar los virus y otras partculas celulares grandes. El liquido sobrenadante, que contiene las molculas solubles del homogenado, se descarta. A continuacin, se resuspender el sedimento y se centrifuga a una velocidad baja para eliminar sustancias mas pesadas que los virus. Finalmente, la centrifugacin a elevada velocidad sedimenta los virus. Este proceso puede repetirse para purificar aun mas las partculas vricas.

Se puede lograr una purificacin adicional de una preparacin vrica mediante centrifugacin en gradiente. Se aade una solucin de sacarosa a un tubo de centrifuga de manera que su concentracin aumente suave y linealmente desde la parte superior del gradiente y se centrifuga. Los virus pueden separarse de otras partculas en base a diferencias de densidad muy pequeas. Los gradientes tambin pueden separar los virus en base a diferencias en su velocidad de sedimentacin (centrifuga zonal en gradiente). Cuando se hace esto, las partculas se separan en base al tamao y a la densidad; normalmente los virus mas grandes se movern mas rpidamente hacia abajo en le gradiente. Por ello este tipo de centrifugacin en gradiente son muy efectivos en la purificacin de virus.

Aunque los procedimientos de centrifugacin eliminan gran parte de los materiales celulares, pueden quedar algunos componentes celulares en las preparaciones de virus. Los virus se pueden separar de cualquier contaminante celular restante mediante precipitacin, desnaturalizacin o degradacin enzimtica de los contaminantes. Muchos procedimientos de precipitacin utilizan sulfato amnico para precipitar los contaminantes celulares . Inicialmente, el sulfato amnico se aade a una concentracin justo por debajo de la necesaria para precipitar partculas vricas. En consecuencia muchos componentes celulares precipitan mientras que los virus permanecen en

solucin. Despus de eliminar los contaminantes precipitados, se aade mas sulfato amnico y los virus precipitados se recogen mediante centrifugacin. Los virus sensibles al sulfato amnico se purifican a menudo mediante precipitacin polietilenglicol. Puesto que los virus acostumbran a ser menos sensibles a las condiciones desnaturalizantes que muchos componentes celulares, la exposicin de una preparacin vrica al calor o a cambios en el pH se pueden utilizar en los pasos finales de la purificacin vrica. Adems, algunos virus toleran tambin el tratamiento con solventes orgnicos como butanol y cloroformo. As, el tratamiento con solventes puede utilizarse tanto para desnaturalizar contaminantes proteicos como para extraer cualquier lpido de la preparacin. El solvente se mezcla bien con la preparacin. El solvente se mezcla bien con la preparacin de virus, entonces se deja reposar y se separan las fases orgnicas y acuosas. Los virus inalterados permanecen suspendidos en la fase acuosa mientras que los lpidos se disuelven en la fase orgnica. Las sustancias desnaturalizadas por los solventes orgnicos se recogen en la interface entre las fases acuosas y orgnicas. Uno de los ltimos pasos utilizados para purificar virus es la degradacin enzimtica de contaminantes. Estos se suele utilizar para eliminar cualquier resto de protenas y acidos nucleicos celulares de la preparacin vrica. Aunque los virus estn formados por una cubierta proteica que rodea un cido nucleico, normalmente son ms resistentes al ataque por nucleasas y proteasas de lo que lo son los cidos nucleicos y las protenas libres. Por ejemplo, la ribonucIeasa y la tripsina acostumbran a degradar cidos ribonucleicos y protenas celulares mientras que los viriones permanecen inalterados. ENSAYOS VIRICOS La cantidad de virus en una muestra se puede determinar bien directamente haciendo un recuento de nuemro de partculas o bien indirectamente midiendo el efecto observable del virus. Los valores obtenidos por los dos mtodos no suelen estar estrechamente correlacionados; no obstante, ambos son valiosos. Los viriones pueden contarse directamente con el microscopio electrnico. En un procedimiento la muestra con los virus se mezcla con pequeas bolitas de latex de concentracin conocida y se pulveriza sobre una rejilla recubierta. Las bolitas y los viriones se cuentan; la concentracin vrica se calcula a partir de estos recuentos y la concentracin de bolitas. Esta tcnica acostumbra a funcionar con preparaciones concentradas de virus con una morfologa conocida. Los virus se pueden concentrar por centrifugacin antes del recuento si la preparacin esta demasiado diluida. Sin embrago, si las bolitas y los virus no estn uniformemente distribuidos ( como veces ocurre), el recuento final ser incorrecto.

Un mtodo indirecto de recuento de partculas vricas es el ensayo de hemaglutinacin. Muchos virus pueden unirse a la superficie de glbulos rojos. Si la proporcin de virus respecto a clulas es suficientemente grande, las partculas vricas unen los glbulos rojos entre si- es decir, los glbulos rojos se aglutinan, formando una red de precipita. A la prctica, los glbulos rojos se mezclan con diluciones seriadas del virus y se examina cada mezcla. El titulo de hemaglutinacin es la dilucin de virus ms elevada(o el reciproco de la dilucin) que todava causa hemaglutinacin. Este ensayo es un mtodo rpido y preciso para determinar la cantidad relativa de virus tales como el virus de la gripe. Si el nmero real de virus necesarios para causar hemaglutinacin se determina mediante otra tcnica, el ensayo se puede utilizar para establecer el nmero de viriones presentes en una muestra. Una variedad de ensayos indirectos determinan el nmero de virus en trminos de inefectividad y muchos de ellos se basan en als mismas tcnicas utilizadas para el cultivo de virus. Por ejemplo, en el ensayo de formacin de placas o calvas se mezclan varias diluciones de virus con las clulas husped adecuadas. Cuando el numero de virus utilizado es mucho menor que el nmero de clulas husped disponibles para la infeccin y cuando los virus estn distribuidos de forma uniforme se asume que cada placa o calva en una capa de clulas husped proviene la reproduccin de un nico virin. Por los tanto un recuento de las placas producidas a ena dilucin en particular proporcionara el nmero de viriones infecciosos, denominados unidades formadas de placas (UFP), y la concentracin de unidades infecciosas en la muestra original pueden

calcularse fcilmente. Por ejemplo, supngase que 0.10 ml de una dilucin 10-6 de la preparacion en de virus da lugar a 75 placas o calvas. Los virus que produzcan calvas con morfologa diferente en una misma placa pueden contarse por separado. Aunque el numero de UFP no equivale el nmero de viriones, su relacin es proporcional: una preparacin con dos veces ms virus tendr dos veces ms unidades formadas de placas. El mismo mtodo utilizado en el ensayo de formacin de placas puede utilizarse con embriones y plantas. Los embriones de pollos pueden inocularse con una preparacin diluida o als hojas de planta pueden frotarse con una mezcla de virus diluido y la sustancia abrasiva. El nmero de pstulas en las membranas embrionarias o de lesiones necrticas en las hojas se multiplica por el factor de dilucin y se divide por el numero de inoculo para obtener la concentracin de unidades infecciosas. Cuando los efectos biolgicos no son fcilmente cuantificables, se puede determinar la cantidad de virus necesaria para causar enfermedad o muerte mediante el mtodo de punto final. Los organismos o los cultivos celulares se inoculan con diluciones seriadas de una suspensin vrica. Los resultados se utilizan para hallar la dilucin de punto final a la que el 50% de las clulas husped u organismos han muerto. La dosis letal (LD50) es la dilucin que contiene una dosis suficientemente grande como para destruir el 50% de las clulas husped u organismos. En un sentido similar, la dosis infecciosa (ID50) es la dosis que, cuando se administra muchos huspedes, causa infeccin en el 50% de los huspedes bajo las condiciones utilizadas. PRINCIPIOS DE TAXONOMIA VIRICA La clasificacin de los virus se encuentra en un estado menos satisfactorio que la de los microorganismos celulares. En parte, esto se debe a la falta de conocimiento de su origen e historia evolutiva. En1971, el comiteinternacional para taxonoma de virus (ICTV, del ingles Internacional Committee for Taxonomy of Viruses) desarrollo un sistema de clasificacin uniforme. Desde entonces el nuemro de virus y categoras taxonmicas a continuado aumentando. En su octavo informe, el ICTV describi al menos 2000 especies de virus y als clasifico en 3 ordenes, 73 familias, 9 subfamilias, y 287 generos. El comit otorga el mayor peso a ciertas caractersticas para definir las familias:tipo de cado nucleico, cadena doble o simple, sentido ( positivo i negativo) de los genomas ssRNA, presencia o ausencia de capside, y dimensiones del virion y la capside.

Los nombres de los ordenes vricos terminan en virales, los nombres de familais vricas en viridae; los nombres de subfamilias, en virinae; y los nombres de generos ( y virus), en virus. Aunque los informes del comit ICTV son la autoridad oficial en taxonoma vrica, muchos virlogos encuentran til un esquema de clasificacin alternativo ideado por el laureado con el Nobel David Baltimore. El sistema Baltimore complementa el sistema ICTV pero se centra en el genoma del virus y el proceso utilizado para sintetizar el mRNA vrico. El sistema original de Baltimore reconocia 6 grupos de virus. Desde entonces el sistema se ha ampliado para incluir 7 grupos. Esto se llevo a cabo en la parte al considerar la replicacin genmica ala vez que la sntesis del mRNA en el esquema de clasificacin. Este sistema ayuda a los virlogos a simplificar la gran variedad de ciclos de vida vrico en un numero relativamente pequeo de tipos bsicos