[REACCIONES DE PRECIPITACIN] Lab Inmuno 2012

LABORATORIO 2: REACCIONES DE PRECIPITACIN

LUEGO DE LEER ESTE DOCUMENTO DE APOYO, RESOLVER EL CUESTIONARIO Y RECIBIR TU LABORATORIO VAS A ESTAR EN CAPACIDAD DE: Describir los principios del mtodo de precipitacin. Fundamentar el mtodo de floculacin. Explicar el significado y utilidad del examen VDRL. Describir el principio de inmunodifusin. Reconocer lasa reacciones de identidad, no identidad e identidad parcial.

REACCIONES DE PRECIPITACIN
La interaccin de antgenos solubles con anticuerpos IgG o IgM dan reacciones de precipitacin. Las reacciones de precipitacin dependen de la formacin de complejos y ocurre mejor cuando el antgeno y en anticuerpo estn presentes en proporciones ptimas. El exceso de cualquiera de los componentes disminuye la formacin de complejos y por tanto la precipitacin.

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El test de anillo de precipitacin se realiza en un pequeo tubo.

FLOCULACIN
La floculacin es otro mecanismo que sirve para evidenciar reacciones antgeno-anticuerpo in vitro y es considerada de interaccin secundaria porque no necesita ningn reactivo o sustancia biolgica adicional para hacer visible la reaccin. En este tipo de interaccin se distinguen dos etapas: la reaccin primaria, no visual y la reaccin secundaria, que sigue a la anterior, caracterizada por la aparicin de un fenmeno visible, como es la floculacin en este caso particular. La prueba VDRL (Venereal Disease Research Laboratory), sirve para determinar los anticuerpos conocidos como reaginas (diferentes a los anticuerpos inmunoglobulina E de la alergia). Estos son heterfilos, es decir, anticuerpos no especficos contra el treponema que reaccionan con antgenos lipdicos y que estn presentes en personas infectadas por l, y los cuales tienen la capacidad de flocular frente al antgeno constituido por cardiolipina, lecitina y colesterol. Estos anticuerpos se encuentran en el suero de personas que presentan variadas entidades clnicas como sfilis, paludismo, TBC, enfermedades del colgeno y, adems en sujetos normales, en condiciones de embarazo y en pacientes de edad avanzada o recientemente vacunados. Estos hechos aumentan los resultados falsos reactivos en las pruebas de rutina. La prueba VDRL se introdujo en 1946 como un mtodo de floculacin en lmina, y se utiliza como prueba presuntiva en el diagnstico de sfilis. El antgeno que se emplea est formado por El colesterol cardiolipina, lecitina purificada, colesterol y alcohol en un adecuado equilibrio.

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proporciona los centros de absorcin, de forma que las partculas floculadas puedan visualizarse. La solucin al 1% de cloruro sdico con tampn de fosfato (pH 6) tambin es importante para la adecuada floculacin del antgeno en presencia del anticuerpo. La inespecificidad de la prueba de VDRL es evidente al ser su antgeno una mezcla de sustancias que se encuentran en alguna forma en la pared del treponema, agente etiolgico de la sfilis, pero tambin en un sin nmero de clulas del organismo. Para esta tcnica, el suero se mezcla en una lmina de fondo plano con el antgeno diluido y se somete a rotacin. El punto final se lee en el microscopio. Los resultados se califican como no reactivos (no hay floculacin), dbilmente reactivos (floculacin ligera) y reactivos (floculacin definida). El resultado reactivo de una prueba de VDRL debe ser titulado y adems confirmado. La titulacin se realiza diluyendo el suero para hallar su mximo punto de reaccin, mientras que la confirmacin requiere otro tipo de tcnicas que involucren antgenos propios del treponema como lo hace la tcnica de FTA-ABS.

INMUNODIFUSIN
La inmunodifusin, o precipitacin en gel, es una tcnica inmunolgica basada en la precipitacin de partculas (antgeno/anticuerpo). Esta funciona para antgenos y anticuerpos SOLUBLES. En esta, las partculas son aplicadas a un gel y se les deja difundir. En el momento en que el antgeno y/o el anticuerpo difunden desde el punto en el que se aplican (usualmente un agujero en un agar) en el gel, su concentracin disminuye hasta que eventualmente llegan a su zona de equivalencia (la concentracin ptima de antgeno y anticuerpo) y formando precipitacin visible en el gel. Para las reacciones de inmunodifusin, utilizaremos los siguientes trminos: Difusin-se refiere a cuantos reactivos se mueven a travs del gel. Los test de difusin simple tienen solo un reactivo que se mueve (usualmente el antgeno), mientras que el otro reactivo se encuentra fijado en el gel. En la inmunodifusin doble los dos reactivos se mueven a travs del medio. Dimensin- se refiere a la direccin del movimiento. Los tubos de reaccin tienen esencialmente una nica dimensin efectiva, arriba y abajo y por eso son conocidos como de una dimensin. Cuando un reactivo puede moverse hacia arriba y hacia abajo, as como de manera radial a travs del gen, el trmino que se utiliza es dimensin doble.
o o o o

Por tanto,

utilizando este criterio, hay cuatro combinaciones o clasificaciones de las reacciones en gel: Difusin simple una dimensin Difusin simple doble dimensin Difusin doble una dimensin Difusin doble doble dimensin

[REACCIONES DE PRECIPITACIN] Lab Inmuno 2012 PRINCIPIO

Cuando al antgeno y a su correspondiente anticuerpo se les deja reaccionar en un gel u otro medio, estos difunden el uno hacia el otro al punto en el cual se encuentran en proporciones ptimas, y forman un precipitado visible. DIFUSIN EN GEL DE OUCHTERLONY ODD (DOBLE DIFUSIN, DOBLE DIMENSIN) Cuando un antgeno en solucin se coloca en un pozo/ agujero en la placa de agar y el anticuerpo correspondiente es colocado en un pozo adyacente, estos difunden radialmente desde su pozo respectivo uno hacia el otro. Cuando se llega al radio ptimo de los dos materiales, una lnea visible de precipitacin es formada en el gel. Este test provee una identificacin cualitativa de protenas individuales. Una de las aplicaciones de la ODD es la determinacin de la similitud entre antgenos. Antgenos de especies distintas se colocan en dos pozos y el anticuerpo conocido se coloca en un tercer pozo localizado entre los dos pozos de antgeno y un poco abajo para formar un tringulo. Tras la difusin, pueden ocurrir tres patrones (mira la figura abajo). Si los antgenos no tienen similitud la zona de precipitacin se cruzar (no identidad); si los antgenos tienen determinantes antignicas idnticas las lneas de precipitacin entre los pozos del antgeno y el antisuero se detendr en el punto de interseccin (identidad); si algunos de los determinantes antignicos se comparten una de las lneas de precipitacin entre los pozos del antgeno y del antisuero se detendr en el punto de interseccin, mientras que la otra continuar, indicando que las muestras de antgeno tienen algunos, pero no todos, determinantes antignicos en comn (identidad parcial).

Otra aplicacin de la ODD es la titulacin de anticuerpos. La tcnica de ODD para titulacin de anticuerpos es una tcnica simple que permite la visualizacin de la concentracin (ttulo) del anticuerpo en una solucin. Una concentracin conocida de antgeno se coloca en el pozo central y ttulos variables del anticuerpo se colocan en los pozos circulando el pozo del antgeno. El ttulo se ve cuando un ttulo tiene una lnea de precipitacin y el siguiente no (mir abajo). El ejemplo de abajo muestra un ttulo de anticuerpo de 1:16.

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INMUNODIFUSIN RADIAL/ RID (DIFUSIN SIMPLE, DOBLE DIMENSIN) La RID se utiliza para obtener un nivel cuantitativo de un antgeno cuando el agar contiene un antisuero apropiado (el anticuerpo esta fijado en el agar). Una serie de tres (3) estndar conteniendo una concentracin conocida de antgeno se colocan en tres pozos, mientras que un control y una muestra desconocida se colocan en los otros pozos. Mientras el antgeno difunde de manera radial, un anillo de precipitacin se forma en el rea de concentracin ptima del antgeno-anticuerpo. Se calcula una curva a partir de la concentracin del estndar y el dimetro de los anillos. Esta curva se utiliza para determinar la concentracin del control y de la muestra desconocida.

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CUESTIONARIO
1. 2. 3. 4. 5. Describa la diferencia entre precipitacin y floculacin (qumica). Investigue que es especificidad y sensibilidad de una prueba. Qu microrganismo es el causante de la sfilis? Enumere algunas caractersticas de la infeccin. Compare la tcnica de precipitacin con la de aglutinacin. Realice un diagrama de flujo del procedimiento.

PARTE PRCTICA
PRUEBA DE VDRL Tomar la placa e identificar los pozos como Mx y control positivo . Colocar una gota de reactivo en cada pozo Con la pipeta colocar una gota de la muestra (pozo de Mx) y una de control (pozo control) Mover la placa suavemente Observar en el microscopio la formacin de precipitado y cuantificar por cruces, utilizando el aumento de 10x.

INTERPRETACIN

Positivo

Negativo

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INMUNODIFUSIN TERICAMENTE: Preparacin de una lmina con agar, de la siguiente forma: Colocar la lmina horizontalmente y con la ayuda de una pipeta agregar agarosa al 3 % toda la superficie. Dejar secar por cinco minutos. Abrir con la ayuda de la pantilla cinco agujeros en el centro de la lamina Copiar el esquema de la placa en el cuaderno e dentificar los pozos y escribir las posiciones en las que se van llenando con muestras de cada paciente. Colocar en el centro el antgeno a utilizar (antiglobulina humana) y en los agujeros del la periferia suero desconocido (Anticuerpos). El llenado se realiza casi al nivel de la superficie del agar. Tener cuidado de no rebalsar. Colocar cuidadosamente la placa dentro de una caja hmeda. Dejar reposar por 24 horas. Observar la reaccin de precipitacin que se forma entre el pozo central y los de la periferia. Esto indica una reaccin positiva por la formacin del inmunocomplejo Ag-Ac NO VOLVER A USAR LOS POZOS. ESTA PRUEBA MIDE CUNTO ANTGENO EST PRESENTE EN EL SUERO Y EL VOLUMEN DEBE SER EL MISMO PARA TODOS LOS POZOS, CON EL OBJETO DE QUE LOS RESULTADOS SEAN CONFIABLES. EN LABORATORIO: Tomar una lmina de agar y luego colocar en el agujero del centro de la roseta una gota del reactivo R. Luego agregar la solucin de anticuerpos en los agujeros de las orillas de la roseta. Esperar a que difunda. Leer los resultados.