3.

L'ARN: Structure, Difffrents Types Et Proprits

Structure
Les ARN sont des polymres de RiboNuclotides lis par des liaisons phosophodiester 5'-3'. Les bases azotes sont A-U, C-G. Le sucre est le Ribose. L'ARN est une molcule monocatnaire, c'est- dire simple brin. Cependant il existe des structures o il y a un repliement en doubles brins .

Classification des ARN

La classification des ARN est lie leurs fonctions. Chaque type d'ARN possde des lments structuraux propres. ARN ribosoinaux (ARNr) (80% de l'ARN) Structure Les ARNr sont localiss au niveau des ribosomes : en effet, ces derniers sont en fait des particules base de 35% de protines et 65% d'ARN. On peut les isoler facilement partir de broyats cellulaires par ultracentrifugation. On les dsigne pour cette raison par leur constante de sdimentation, exprime en Svedberg (S) (cf cours mthodo centrifugation). - Chez les bactries: Les ribosomes ont une constante de sdimentation de 70S. On peut les dissocier en 2 sousunits de 50S et 30S (les constantes de sdimentation ne sont pas additives...). Ainsi: 50S: 2 types d'ARN; 31 protines

30S : 1 ARN; 21 protines - Chez les Eucarvotes: Les ribosomes ont une constante de sdimentation de 80S 60S + 40 S. 60S: 3 types d'ARN; 45 protines

40S: 1 type d'ARN; 31 protines Localisation des ribosomes Les ribosomes sont prsents: - dans le cytoplasme l'tat libre (synthse des protines cytoplasmiques). - dans le cytoplasme, lis au rticulum endoplasmique (protines destination membranaire ou intra-organite). - dans les mitochondries et les chloroplastes: toutefois, ces ribosomes se rapprochent de ceux des bactries (cf thorie endosymbiotique...). Noter que les ARNr sont synthtiss dans le noyau partir de l'ADN et s'assemblent au niveau des nucloles avec les protines, puis passent dans le cytoplasme. Fonction des ribosomes On le verra en 2nde anne, les ribosomes interviennent dans la synthse des protines (appele aussi "traduction"), partir des ARNm. ARN messagers (ARNm) (5% de l'ARN) Structure Les ARNm sont monocatnaires et ont une dure de vie trs courte. Ce sont des copies en ARN de l'ADN contenu dans les gnes : leur squence est complmentaire de certaines squences de l'ADN (cf chapitre notion de gnes).

Ces copies d'ADN sont ralises dans le noyau, puis exportes dans le cytoplasme (cf cours transcription), o elles sont ensuite traduites en protines grce aux ribosomes: cf localisation des ribosomes.

Localisation des ARNm

Fonction des ARNm

Ils sont les intermdiaires entre l'ADN et les protines. ARN de transfert (ARNt) (15% de l'ARN) Structure Ils prsentent plusieurs particularits structurales lies leur fonction: - petite taille: de 73 93 nuclotides. - structure typique en trfle, avec de nombreuses rgions en structure II (appariement de bases). - existence d'un anticodon : triplet de nuclotides, complmentaire des codons de l'ARNm - l'extrmit 3'OH fixe l'acide amin correspondant au codon de l'ARNm. Elle possde la squence CCA (constante pour tous les ARNt) - prsence de nombreux nuclotides modifis (environ 1 sur 10).

():anti-codon (3 nucleotides) (): site de fixation de l'acide amin (): boucle variable (): branche D (): branche T A :Boucle de l'anticodon D: Boucle D T: Boucle T

Localisation et fonction des ARNt Les ARNt sont synthtiss, partir de l'ADN, dans le noyau des cellules Eucaryotes. Ils passent ensuite dans le cytoplasme, o ils jouent un rle fondamental dans la traduction. En effet, ils apportent les acides amins aux ribosomes pour construire les protines. Ils sont qualifis d'adaptateurs. Il existe une soixantaine d'ARNt diffrents (compte tenu de dgnrescence du code gntique, cf plus loin). ARN chez les Virus De nombreux virus possdent un gnome base d'ARN: - Certains possdent un ARN bicatnaire, en hlice, analogue l'ADN. C'est le cas de virus des vgtaux. - les virus ARN monocatnaire possdent une ou plusieurs molcules d'ARN (cf le virus HIV qui en a 2).

Proprits de l'ARN

Ce sont globalement les mmes que l'ADN. * Comme l'ADN, il prsente un maximum d'absorption 260 nm, donc on peut le doser galement cette longueur d'onde * Solubilit: - Les proprits de solubilit des ARN sont quivalentes celles de l'ADN. Il existe cependant une petite diffrence: les ARN ne prcipitent pas 0,1 mol.L-1 en NaCl,

mais restent solubles. Cela permet de les sparer facilement de l'ADN. - Les ARN sont prcipitables par les cations lourds (exemple : Li+) * L'ARN est sensible l'hydrolyse alcaline (cf plus loin) contrairement l'ADN.

4. Dtermination Des Squences Des Acides Nucliques

La dtermination de la squence des acides nucliques est ralise selon un procd analogue celui du squenage des protines, savoir: hydrolyse chimique ou enzymatique suivie d'une sparation des fragments par chromatographie ou lectrophorse. Des mthodes modernes existent depuis une vingtaine d'annes, que nous verrons galement. La dtermination de la squence de acides nucliques et bien plus difficile que celle des protines, car il n'existe que 4 bases dans un acide nuclique donn (au lieu de 20). Les premires squences ont t ralises sur des ARNt, du fait de leur faible taille et de la prsence de bases "anormales" qui servent de point de repre..

Mthodes d'hydrolyse de l'ADN et de l'ARN

Hydrolyse alcaline des ARN L'hydrolyse alcaline se fait selon un mcanisme impliquant un compos intermdiaire cyclique 2'-3' (via le phosphate). Aprs rupture des liaisons phosphodiester, on obtient un mlange de nuclosides 2' et 3' monophosphates et l'hydrolyse des ARN est ainsi totale. En revanche, les ADN sont rsistants l'hydrolyse alcaline car ils n'ont pas de -OH sur le C2'.

Hydrolyse par les RNases RNase pancratique - Il s'agit d'une endonuclase: elle coupe l'intrieur des chanes d'ARN. Elle agit selon le mme mcanisme que lors de l'hydrolyse alcaline (d'o l'explication que les ADN y soient rsistants). - Elle a une certaine spcificit: elle ne coupe que si le nuclotide du ct 3 est pyrimidique. Elle libre donc des oligonuclotides 3'phosphate.

RNase T1 C'est une endonuclase qui coupe lorsqu'il y a du ct 3' une guanosine (ou une inosine, nuclotide rare trouv dans les ARNt). Elle libre galement des nuclotides 3'P. RNase U2 C'est une endonuclase, mais sa spcificit est plus large: A ou G ct 3'. Elle libre galement des nuclotides 3'P.

Son intrt est de l'utiliser en complment de la RNase 77. En effet, on fait agir dans un premier temps la RNase Tl, puis, sur les fragments obtenus, on fait agir la U2 qui coupe alors du ct des A. Hydrolyse par les phosphodiestrases * Phosphodiestrase de venin de serpent - Il s'agit d'une exonuclase: elle attaque les oligonuclotides partir de leur extrmit 3' si celle-ci n'est pas phosphoryle. - Elle libre cette fois des nuclosides 5'P et agit de manire rcurrente. - Elle agit sur l'ADN et sur l'ARN simple brin.

* Phosphodiestrase de rate - C'est une exonuclase qui agit sur l'ADN et sur l'ARN, simple brin. - Elle hydrolyse partir du ct 5', si celui-ci est non phosphoryl. - Elle libre des nuclosides 3'P et agit de manire rcurrente. Hydrolyse par la phosphatase alcaline - Il s'agit d'une enzyme qui dtache les groupements phosphates situs aux extrmits d'un polynuclotide. On qualifie ce type d'enzyme, pour cette raison, de phosphomonoestrase (et non plus de phosphodiestrase). Action des DNases II s'agit d'endonuclases. Les premires DNAses connues tait moins spcifiques que les RNAses. On peut citer: - la DNase I (= DNAse pancratique): elle engendre des nuclosides 5'P. - la DNase II (= DNAse acide): elle engendre des nuclosides 3'P. Il existe chez les bactries des endonuclases beaucoup plus spcifiques, qui digrent l'ADN au niveau de squences trs particulires (double brin). Ce sont les endonuclases de restriction. Elles servent aux bactries digrer tout ADN tranger qui s'introduirait dans la cellule, comme celui des bactriophages (l'ADN homologue est protg par mthylation d'une bases sur chaque brin au niveau du site de coupure). Elles coupent l'ADN bicatnaire au niveau de courtes squences (4 6 nuclotides),Je plus souvent symtriques (= palindromes) et prsentes en trs petit nombre dans les molcules d'ADN. Exemple:

Formation d'extrmits bouts cohsives, dits bouts colants

Formations d'extrmits bouts francs - Application: La coupure par une endonuclase du type EcoR I ou BamHI produit des fragments possdant des extrmits cohsives= des extrmits monocatnaires ayant des squences complmentaires : ceci permet de souder spcifiquement 2 fragments d'ADN ayant des origines diffrentes , mais ayant t hydrolyses par la mme endonuclase de restriction. Cette proprit est utilise lors d'exprience de recombinaison in vitro , en particulier pour introduire des squences d'ADN d'origine diverse dans des phages ou des

plasmides (cf cours gnie gntique).

Dtermination de la squence des acides ribonucliques

Le squenage de l'ARN est utilis pour dterminer la squence des ARNr, ARNt, ou encore l'ARN gnomique de certains virus (= ARN). Pour cela, plusieurs techniques sont utilisables. Hydrolyse enzymatique suivie de sparation des fragments A l'aide des diffrentes techniques vues au 4.1, on ralise l'hydrolyse partielle ou totale puis on spare les fragments obtenus: - par chromatographie d'exclusion en colonne: mthode lourde car elle ncessite une grande quantit de matriel, mais permet par la suite la caractrisation des nuclotides, en particulier les nuclotides rares. - par lectrophorse sur gel d'agarose ou de polyacrylamide: cette technique requiert le marquage radioactif des ARN au 32P, pour permettre la visualisation des fragments d'ARN (par application d'un film d'autoradiographie sur l'lectrophorgramme). Rq: marquage radioactif de l'ARN: - in vivo, en cultivant les cellules sur un milieu contenant du 32P, - in vitro, aprs coupure par les enzymes, - en remplaant le phosphate en 5' par du phosphate contenant du 32P, - ou en ajoutant en 3'-OH un phosphate contenant du 32P. Cas d'ARN courts (<70 nuclotides) - Seule l'extrmit 5' de l'ARN est marque au 32P (par une polynuclotide kinase et de l'ATP32P). - On soumet ensuite diffrents aliquotes une digestion enzymatique par diffrentes enzymes spcifiques (cf 4.1) dans des conditions, o, statistiquement il n'y aura qu'une coupure par chane. - Les fragments sont ensuite fractionns par lectrophorse sur gel de polyacrylamide: seuls les fragments marqus au 32P seront visualisables par autoradiographie. - Paralllement une hydrolyse alcaline plus ou moins partielle permet de gnrer des fragments de toutes les tailles possibles = repres.

Dtermination de dsoxyribonucliques

la

squence

des

acides

Depuis 20 ans, des mthodes ont t mises au point pour dterminer la squence de l'ADN. L'ADN squencer tant parfois de taille importante, on procde en plusieurs tapes: - hydrolyse de l'ADN par les endonuclases de restriction - sparation des fragments et squenage de ceux-ci. Pour ce squenage, 2 mthodes existent. La mthode de Maxam et Gilbert Le principe est semblable celui prsent pour les ARN, sauf que l'ADN est hydrolyse de manire chimique et non enzymatique. 1- Le fragment d'ADN est marqu au 32P une extrmit, et divis en 4 aliquots. 2- Chacun d'eux est soumis une hydrolyse chimique diffrente, dans des conditions telles qu'il n'y ait qu'une coupure (ou un faible nombre de coupures) par chane.

- un traitement au dimthylsulfate, qui mthyle surtout la guanine en N7 ; sous l'effet de la chaleur, la guanine est dtache et la chane polynuclotidique est rompue ce niveau: on obtient des fragments se terminant par une guanine. - un traitement au dimthylsulfate en milieu acide, qui mthyle la guanine en N7 et l'adnine en N3: on obtient des fragments se terminant l o dans la chane, il y avait une guanine et une adnine. Par comparaison avec la raction prcdente, on en dduit la position des adnines. - un traitement par l'hydrazine en milieu NaCl 1 mol.L -1 permet de dterminer les fragments se terminant par C - un traitement par l'hydrazine sans NaCl permet de couper au niveau des C et des T. Par comparaison avec la raction prcdente, on en dduit la position des thymidines. 3- Les fragments engendrs par ces 4 ractions sont spars en parallle par lectrophorse sur gel de polyacrylamide en fonction de leur taille. Le fragment le plus court se retrouve au bas du gel, le plus long en haut. Deux fragments successifs ont une taille qui ne diffre que d'un seul nuclotide. 4- La rvlation se fait par autoradiographie. On lit ainsi, de bas en haut, la squence de l'ADN sur une autoradiographie. Actuellement, on spare des fragments allant de 1 300 nuclotides (gels de 40 cm de long). Pour tablir la squence de fragments d'ADN plus longs, on rpte l'opration sur des fragments de prfrence lgrement chevauchants obtenus par diffrentes enzymes de restriction. en 1976) Cette mthode est pratiquement utilise l'heure actuelle la place de la prcdente. - L'ADN squencer est clone (c--d insr) sous forme simple brin dans un vecteur particulier, le phage M13. - On utilise ce fragment pour raliser, au moyen de l'ADN polymrase I, le brin complmentaire (on fait en fait, grce une amorce, une rplication in vitro ). La rplication ncessite des nuclotides tnphosphates dNTP. L'un d'eux est marqu par du 32P sur le Pu. - On ralise 4 ractions de polymrisation indpendantes, en introduisant dans chaque cas un type de didoxynuclotide = ne possdant d'-OH ni en 2', ni en 3'. Lorsqu'un tel nuclotide est incorpor, il y a donc arrt de la synthse. Le rapport ddNTP/dNTP (pour 1 N donn) est tel que qu'on arrive avoir une incorporation de ddNTP au hasard et donc des fragments de tailles diffrentes ayant tous le ddNTP en 3'. - On obtient ainsi une srie de fragments d'ADN ne diffrant que d'un seul nuclotide et se terminant par un didoxynuclotide. On peut alors, aprs lectrophorse et autoradiographie, lire de bas en haut la squence du brin nosynthtis ( = complmentaire du brin ayant servi de matrice), et donc en dduire la squence du brin d'ADN de dpart. La mthode de Sanger, dite des didoxynuclotides (Nobel