CAPTULO 2.3.8.

HEPATITIS VIRAL DEL PATO

RESUMEN
La hepatitis en los patos puede ser causada por al menos tres virus diferentes. El ms comn y extendido internacionalmente es el virus de la hepatitis del pato (DHV) de tipo I, actualmente designado como un picornavirus no clasificado, que ocasiona una infeccin aguda muy contagiosa y letal en patitos menores de 6 semanas de edad y, frecuentemente, menores de 3 semanas de edad. No se encuentra en aves ms viejas. Esta infeccin se denomina a menudo simplemente como hepatitis vrica del pato. El DHV de tipo II ha sido descrito nicamente en el Reino Unido. Apareci en patitos de entre 10 das y 6 semanas de edad, y caus cambios patolgicos similares a los del DHV de tipo I. A partir de estudios de microscopa electrnica y moleculares, se considera que es un astrovirus. El DHV de tipo III ha sido descrito solamente en los Estados Unidos de Amrica. Causa lesiones hepticas parecidas en patitos jvenes, pero es menos virulento que el DHV de tipo I. Se cree que es un picornavirus, no relacionado serolgicamente con el virus de tipo I. El diagnstico de la hepatitis en los patitos se basa en el patrn caracterstico de la enfermedad en la bandada, cambios patolgicos globales, la recuperacin del virus a partir de los patitos muertos, y la reproduccin de la enfermedad en patitos susceptibles. Identificacin del agente: No es posible distinguir entre los DHV de tipo I, II y III en base a los hallazgos clnicos y a la patologa, aunque se pueden realizar distinciones a partir de las respuestas frente a los virus aislados de los patitos, huevos embrionados y cultivos celulares. De forma alternativa, el ARN del DHV de tipo I puede detectarse por la reaccin en cadena de la polimerasa de transcripcin inversa de un solo paso a partir de hgado de patitos y tambin del lquido alantoideo y el hgado de embrin de huevos de pato inoculados. Pruebas serolgicas: Los ensayos serolgicos tienen poco valor en el diagnstico de las infecciones agudas causadas por los DHV tipos I, II y III. Se han utilizado pruebas de neutralizacin de suero in ovo con los tres virus y se han desarrollado ensayos in-vitro para el DHV de tipo I. Estas pruebas han sido utilizadas para la identificacin del virus, el ensayo de las respuestas inmunes frente a la vacunacin y estudios epidemiolgicos. Requisitos para las vacunas y el material de diagnstico: Las infecciones por el DHV de tipo I se pueden controlar mediante el uso de vacunas vricas vivas atenuadas y una vacuna vrica inactivada. Se administran a patos reproductores para conferir inmunidad pasiva en los patitos. Las vacunas de virus vivos atenuados tambin pueden inmunizar activamente a patitos de un da de edad susceptibles al DHV de tipo I. Los patitos susceptibles al DHV de tipo I pueden protegerse pasivamente con una preparacin de anticuerpo en yema de huevo. Las infecciones por DHV de tipo III se pueden controlar mediante el uso de una vacuna vrica viva atenuada administrada a los patos reproductores para conferir inmunidad pasiva a los patitos.

A. INTRODUCCIN
La hepatitis del pato est causada por al menos tres virus diferentes, concretamente los virus de la hepatitis del pato (DHV) de los tipos I, II y III. El ms comn es el DHV de tipo I, que se designa como un picornavirus no clasificado y puede requerir la asignacin a un nuevo gnero dentro de los Picornaviridae (4, 10, 15). El DHV de

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tipo II se considera un astrovirus, y el DHV de tipo III se considera un picornavirus no relacionado serolgicamente con DHV de tipo I. Se ha informado de que un nuevo serotipo de DHV denominado N-DHV puede causar una elevada mortalidad con lesiones tpicas en el hgado (16). Este virus, recuperado de patitos hbridos y gansos pequeos, no est relacionado antignicamente con el DHV de tipo I, y, aunque es filogenticamente distinto, an as est estrechamente relacionado con el DHV de tipo I. Hasta el presente, al DHV de tipo I se le ha considerado slo como causante de la enfermedad en nades y patitos de Pekn, pero actualmente se le ha descrito como causa de pancreatitis y encefalitis en patos de Moscovia (6). Estos virus que causan infecciones agudas no deberan confundirse con el virus de la hepatitis B del pato, un hepadnavirus clasificado en el mismo grupo que los virus de la hepatitis B de los mamferos. No se comprende del todo la relevancia de esta infeccin en el pato.

B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
1. Identificacin del agente
a) DHV de tipo I
El DHV de tipo I causa una infeccin muy contagiosa en los patos. Se desconoce su relevancia para la salud pblica. La enfermedad consiste en una infeccin vrica aguda, a menudo fatal, de propagacin rpida en patitos jvenes. Normalmente afecta a patitos menores de 6 semanas y a menudo ms jvenes. la enfermedad clnica se caracteriza por el letargo y la ataxia. Los patitos pierden su estabilidad, caen sobre sus costados y patean espasmdicamente antes de la muerte. Durante la muerte la cabeza se coloca hacia atrs en posicin de opistotono. La secuencia completa de la enfermedad es rpida y puede durar no ms de 1-2 horas. La mortalidad completa en una bandada se producir prcticamente en 34 das, con la mayora de las muertes en el segundo da. Los cambios patolgicos patentes aparecen sobre todo en el hgado, el cual se encuentra agrandado y muestra hemorragias definidas puntuales y equimticas. Tambin puede presentarse un aumento del tamao del bazo e hinchazn de los riones, junto con la congestin de los vasos sanguneos renales. Los cambios microscpicos en el hgado se caracterizan por la extensa necrosis de los hepatocitos y la hiperplasia del conducto biliar, junto con diversos grados de respuesta de inflamacin celular y hemorragia. Las observaciones clnicas y patolgicas son muy indicativas de una infeccin por el DHV de tipo I. El virus puede recuperarse fcilmente a partir del tejido heptico mediante homogeneizacin como una suspensin al 20% (p/v) en tampn salino. Se clarifica la suspensin y adems puede tratarse (si se desea) con cloroformo al 5% (v/v) durante 1015 minutos a temperatura ambiente. El DHV de tipo I es resistente a este tratamiento. La presencia de DHV de tipo I se confirma generalmente mediante uno o varios de los procedimientos siguientes: i) Mediante inoculacin subcutnea o intramuscular del aislamiento en patitos de entre 1 y 7 das de edad que son susceptibles al DHV de tipo I. Continuara la enfermedad clnica caracterstica, ocurriendo las muertes entre las 1848 horas despus de la inoculacin, y a menudo antes de las 24 horas. Los patitos deberan mostrar la patologa evidente atribuible al DHV de tipo I. El virus debera ser reaislado a partir de hgados. Mediante inoculacin de diluciones seriadas del homogeneizado de hgado en el saco alantoideo de huevos embrionados de pato (1014 das) o de pollo (810 das). Los embriones de pato mueren entre 24 y 72 horas ms tarde, mientras que los embriones de pollo son ms variables y errticos en su respuesta, y usualmente tardan 58 das en morir. Los cambios patolgicos evidentes en los embriones incluyen atrofia y hemorragias subcutneas en todo el cuerpo, especialmente con edema en la regin abdominal y extremidades posteriores. Los hgados de los embriones pueden estar rojos, amarillentos e inflamados, y mostrar algunos focos necrticos. En los embriones que tardan ms tiempo en morir, es ms pronunciado el color verdoso del alantoide, y se hacen ms evidentes las lesiones hepticas y la atrofia. Mediante inoculacin en cultivos primarios de clulas de hgado de embrin de pato (DEL), los cuales son particularmente sensibles (17). Las diluciones del homogeneizado de hgado que contienen el DHV de tipo I causan un efecto citoptico (ECP) que se caracteriza por el redondeo celular y la

ii)

iii)

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necrosis. Cuando se cubre con un medio de mantenimiento que contiene un 1% de agarosa, el ECP da lugar a placas de un dimetro de aproximadamente 1 mm. Ensayos inmunolgicos

Estas pruebas no se han utilizado extensivamente para la identificacin rutinaria de la infeccin por el DHV de tipo I. Se han descrito varios ensayos de neutralizacin vrica (NV), que pueden tener una mayor importancia si llegan a generalizarse las infecciones por los DHV de tipo II y III. Las pruebas que se han descrito (2, 1719) incluyen: i) La inmunizacin pasiva subcutnea de patitos de 17 das de edad susceptibles frente al DHV de tipo I con 12 ml de suero especfico hiperinmune, o anticuerpos especficos de la yema del huevo. Estos patitos se estimulan intramuscularmente o subcutneamente 24 horas ms tarde con al menos 103.0 LD50 (50% de la dosis letal) del aislamiento vrico. De manera similar se estimula un grupo de patitos no inoculados. La identificacin de la infeccin se basa en la supervivencia de un 80100% de los patitos inmunes pasivamente y el 80100% de mortalidad en los controles. Se descargan intramuscularmente o subcutneamente patitos de 17 das de edad, susceptibles al DHV-I e inmunes por va materna al DHV de tipo I, con al menos 103.0 LD50 del aislamiento vrico. La identificacin se basa en las prdidas del 80100% de los patitos susceptibles y la supervivencia del 80100% de los patitos inmunes por va materna. Se mezclan diluciones seriadas decimales del aislamiento vrico con volmenes iguales de suero hiperinmune especfico frente a DHV de tipo I y diluidos 1/5 y 1/10. Las muestras se dejan reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora, y entonces se inoculan (0,2 ml) subcutneamente en patitos susceptibles, y tambin en la cavidad alantoidea (0,2 mL) de huevos de pato embrionados, y en cultivos primarios de monocapas de clulas DEL. En cada caso los controles consisten en el aislamiento vrico mezclado con el suero control.

ii)

iii)

Existe escasa evidencia de variacin antignica entre los aislamientos del DHV de tipo I. Sin embargo, una variante, el DHV de tipo Ia, aislado en los Estados Unidos de Amrica, solamente reacciona parcialmente con el virus clsico de tipo I en pruebas cruzadas de neutralizacin de suero (12, 20). Se han descrito otras variantes en la India y en Egipto, pero no se conoce ms sobre ellas. Informes recientes sobre la enfermedad en patos de Moscovia procedentes de Francia (6), y un N-DHV procedente de Taipei, China (16), han planteado nuevas preguntas sobre la hepatitis viral del pato. Mtodos de reconocimiento de cido nucleico

Aunque algunas publicaciones recientes revelan la estructura molecular del DHV de tipo I (4, 10, 15), slo una de ellas ha descrito la reaccin en cadena de la polimerasa de trascripcin inversa de un solo paso para detectar el DHV de tipo I (9). Este es el mtodo que se esboza a continuacin. Reaccin en cadena de la polimerasa

Este mtodo se ha tomado del estudio (9). Est basado en cebadores especficos para amplificar una regin del gen 3D. Deteccin del DHV-I de los rganos del embrin de patos y pollos.

Se recogen y filtran los sobrenadantes preparados a partir del hgados de patitos infectados con DHV de tipo I (0,2 m). Se inoculan con 0,2 ml de sobrenadante vrico cada una de las cavidades alantoideas de cinco huevos embrionados de patos de 11 das y de pollos de 9 das. El fluido alantoideo y las muestras de hgado se recogen de los embriones inoculados con dos cepas de referencia y se homogeneiza cada muestra de hgado en un homogeneizador de tejidos y se aade tampn fosfato salino para hacer suspensiones al 10%. Se centrifugan las suspensiones de muestras de hgado y el lquido alantoide a 2.000 g durante 30 minutos; los sobrenadantes se tratan con el kit de extraccin de ADN/ARN vrico Viral Genespin, y se utilizan los cidos nucleicos para la RT-PCR de un paso. Extraccin del cido nucleico

Las extracciones del ARN vrico se realizan utilizando el kit de extraccin de ADN/ARN vrico Viral Genespin (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea). Se mezcla un total de 150 l del la muestra para extraccin con 250 l de tampn de lisis. Para las pruebas de sensibilidad por RT-PCR, se aaden 50 l de agua destilada tratada con dietilpirocarbonato (DEPC) a 100 l de dilucin decimal del virus de las muestras antes de mezclarla con tampn de lisis. Se aade una alcuota de 350-l de tampn de unin y se tritura; el total de 750 l se coloca en una mini-columna que se hace girar en una microcentrfuga a 13.000 rpm durante 1 minuto a temperatura ambiente. Se descarta el flujo directo y se realizan dos ciclos de lavadogiro-flujo directo utilizando tampones de lavado A y B (500 l de cada uno), seguidos de un giro final de

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1 minuto para secar la membrana. Se trasfiere la columna a un nuevo tubo de recogida de 1,5ml y se eluye el ARN aadiendo 40 l de tampn de elucin y centrifugando durante 1 minuto a 13.000 rpm. Despus de medir las concentraciones de ARN utilizando el NanoDrop ND-1000 (NanoDrop, Wilmington, DE), se almacenan las muestras a 20C. RT-PCR de un solo paso

La RT-PCR de un solo paso se realiza utilizando el kit Maxime RT-PCR PreMix (iNtRON Biotechnology). Los 20-l de mezclas de reaccin contienen 1 U de transcriptasa inversa OptiScript, 2,5 mM de dNTP, 2,5 U de Taq ADN polimerasa i-Star y tampn de reaccin RT-PCR (50 mM de Tris/HCl y 75 mM de KCl). Adems se incluirn en la reaccin los siguientes componentes: 4 l (50 ng) de ARN o ADN molde, 1 l (10 pmoles/l) de cada cebador especfico (DHV-1 ComF y DHV-1 ComR), y dH2O tratado con DEPC hasta un volumen total de reaccin de 20 l. Se utiliza un termociclador de gradiente T (Biometra, Gottingen, Germany) para la RT-PCR de un solo paso. La trascripcin inversa se lleva a cabo a 45C durante 30 minutos, y a continuacin se inactiva el enzima a 94C durante 5 minutos. La amplificacin por PCR se realiza utilizando una desnaturalizacin inicial de 20 segundos a 94C; a continuacin, 40 ciclos de templado durante 30 segundos a 52C, una extensin durante 30 segundos a 72C, y una desnaturalizacin durante 20 segundos a 94C; y una extensin final durante 5 minutos a 72C. Las reacciones se guardan a 4C. Deteccin de productos mediante la RT-PCR de un solo paso

Los productos de la PCR (10 l) se separan por electroforesis (100 V) en geles horizontales de agarosa al 1,5% (iNtRON Biotechnology) y tampn Tris-acetato (40 mM de Tris-acetato, 1 mM de cido etilndiamino tetraactico). Los geles se tien con bromuro de etidio (0,5 ug/ml), se observan con luz ultravioleta y se fotografan. Interpretacin de los resultados

Se amplifica un fragmento de ADN de 467 pb mediante una RT-PCR de un solo paso utilizando ARN extrado de los hgados de los patitos infectados con cepas de referencia del DHV de tipo I. El control negativo de ARN se obtiene de un hgado de patito no infectado y no se amplifica en las mismas condiciones.

b)

DHV de tipo II
La infeccin de los patos por el DHV de tipo II solamente se ha descrito en el Reino Unido (1, 5). Se trata de una infeccin aguda y fatal de los patitos que produce unos signos clnicos y patolgicos similares a los del DHV de tipo I. Las aves afectadas pueden mostrar signos de polidipsia y normalmente mueren entre 1 2 horas despus de mostrarse enfermos. Los cambios patolgicos generales incluyen hemorragias mltiples, bandas puntuales y confluentes en el hgado, riones plidos e hinchados con vasos sanguneos congestionados, y bazos hipertrofiados. A menudo el tracto alimenticio se encuentra vaco, aunque el intestino delgado puede contener moco, y ocasionalmente se observan zonas hemorrgicas. A veces se observan hemorragias petequiales en el corazn. Histolgicamente, los cambios en el hgado son parecidos a los observados en infecciones por el DHV de tipo I; el alcance de la hiperplasia del conducto biliar puede ser mayor que con el DHV de tipo I, pero esto es relativo. El DHV de tipo II tiene una morfologa parecida a la del astrovirus y los viriones tienen un dimetro de 2830 nm. Se le clasifica como perteneciente a la familia Astroviridae como astrovirus I del pato (DAstV-I) (5, 11). El virus se puede recuperar en suspensiones homogeneizadas de hgado al 20 % (p/v) en tampn salino. Se puede utilizar para inocular: i) Patitos susceptibles, en los que la respuesta puede ser variable. Puede aparecer un porcentaje de mortalidad de hasta un 20% en un periodo de 24 das. La patologa general es similar a la observada en casos de campo (5). Esto contrasta con las caractersticas de la infeccin por el DHV de tipo I, que es ms virulenta y rpida en sus efectos. Huevos de pollo o pato embrionados, bien por va de la cavidad amnitica o en el saco de la yema. Pueden responder de manera imprevisible despus de cuatro pases, pero pueden no observarse muertes durante los pases ms tempranos. Los embriones tardan 610 das en mostrar los sntomas de la infeccin; cuando esto ocurre existe atrofia con hgados verdes necrticos.

ii)

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Ensayos inmunolgicos

Los ensayos inmunolgicos no se han empleado rutinariamente, ya que la respuesta serolgica en los patitos y en los embriones de pato frente a la infeccin es escasa. Sin embargo se ha aplicado un ensayo de neutralizacin (5) para la identificacin del virus inoculando embriones de pollo en la cavidad amnitica con mezclas de suero constante/virus variable. Se han llevado a cabo pruebas de proteccin cruzada en patitos de 24 das de edad (5); se inoculan con antisuero frente a los tipos I o II y se estimulan 3 das ms tarde con el aislamiento vrico. Esta tcnica puede distinguir el DHV de tipo II de los tipos I y III.

c)

DHV de tipo III

El DHV de tipo III ha sido descrito solamente en EE.UU. Aparecen prdidas de hasta el 20% en patitos inmunes al DHV de tipo I (7, 13). El DHV de tipo III causa una infeccin aguda en patitos jvenes con signos clnicos similares a los observados en las infecciones de tipo I. La patologa general es tambin parecida a la infeccin de de tipo I. La superficie del hgado es plida y veteada con muchas bandas rojas y algunas hemorragias petequiales. El bazo est ms plido, aunque no notoriamente hinchado, y los riones pueden mostrar una congestin desigual. El virus se puede recuperar a partir de suspensiones homogeneizadas de hgado y es resistente al tratamiento con cloroformo al 5%. El virus se puede aislar: i) Inoculando intramuscularmente el aislamiento en patitos susceptibles. El porcentaje de mortalidad puede alcanzar un 20%, con un 60% de morbilidad. No aparecen muertes durante las primeras 24 horas y todas las prdidas siguen entre el da 2 y 4 despus de la inoculacin. La inoculacin intravenosa es ms efectiva; la infeccin de tipo III es menos virulenta que la de tipo I. Inoculando el aislamiento en la membrana corioalantoidea (CAM) de huevos embrionados de pato de 10 das de edad. La respuesta es imprevisible, pero siempre se dan algunas muertes del embrin a los 710 das. Las membranas adoptan un aspecto seco y crujiente, por debajo de ellas se encuaentran edematosas. Los embriones pueden encontrarse atrofiados y edematosos con hemorragias en la piel. El hgado, riones y bazo estn hinchados.

ii)

Los intentos para cultivar el virus en huevos de gallina no han tenido xito. Los intentos con el virus para inducir un ECP en cultivos de tejidos no han tenido xito, pero el virus ha sido detectado mediante inmunofluorescencia indirecta en cultivos en monocapa de clulas DEL y rin de embrin de pato (DEK) infectadas experimentalmente (7).

2.

Pruebas serolgicas

Estas pruebas no se emplean para el diagnstico ya que la enfermedad clnica es demasiado aguda. Los tres tipos de DHV se han utilizado en ensayos de neutralizacin de virus in ovo, pero su xito depende de la expresin del virus en el sistema de ensayo utilizado; con los virus de tipo II y III esto puede ser un problema. Se han desarrollado pruebas in-vitro para el DHV de tipo I; incluyen un ensayo de reduccin de placa y una prueba de microtitulacin (17, 18). El ensayo de reduccin de placa se puede realizar utilizando bien clulas DEK o DEL. Se preparan cultivos monocapa de clulas primarias en medio mnimo esencial de Eagle (MEM) que contenga suero bovino fetal (FCS) al 510%, glutamina 2mM, 0.17% de bicarbonato sdico y gentamicina. Las clulas tripsinizadas se siembran en placas de Petri de 5 cm de dimetro, y se incuban a 37C en una atmsfera de CO2 al 5%. Las monocapas deberan estar casi confluentes a las 2448 horas post-siembra. Las monocapas se lavan dos veces con MEM libre de suero o solucin balanceada salina de Hank para eliminar todo residuo de FCS antes de infectar con el DHV de tipo I. Se mezclan volmenes iguales de DHV de tipo I resuspendido en MEM libre de suero y ajustado a 200 unidades formadoras de placa (PFU) por 0,1 ml con volmenes iguales de suero de pato diluido seriadamente (diluciones dobles en MEM). Las muestras de suero deberan inactivarse a 56C durante 30 minutos antes de probarse. Las mezclas virus/suero se incuban a 37C durante 1 hora, y entonces se aaden aliquotas de 0.1 ml a las monocapas celulares confluentes, a tres placas por dilucin. Las placas se dejan durante 30 minutos a temperatura ambiente (2022C), y entonces se recubren con medio de mantenimiento con agarosa (MEM que contiene suero de pollo al 2% y 0,10,2% de FCS al que se ha aadido agarosa hasta una concentracin final del 1% p/v). las placas se colocan entonces a 37C en una atmsfera de CO2 al 5%. Se registra el numero de placas producidas despus de una incubacin de 48 horas. Las placas pueden observarse utilizando una fuente de luz indirecta, o alternativamente las monocapas se pueden fijar con tampn salino con formol al 10% y ser teidas con cristal violeta al 1%. Los ttulos sricos del anticuerpo se expresan como el inverso de la dilucin ms alta de suero que reduce el contaje de placas en un 50%.

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Se puede llevar a cabo un ensayo de neutralizacin por microtitulacin empleando clulas primarias DEK. Se preparan diluciones seriadas dobles de cada muestra de suero (inactivado por calor) en 50 l de medio basal de Eagle (BME) libre de suero en placas de microtitulacin. Se aaden a cada pocillo aproximadamente 102.0 DICC50 (50% de la dosis infectiva de cultivo celular) unidades de DHV de tipo I en 50 l de BME, y se deja que reaccionen las mezclas a 37C durante 1 hora. Se resuspenden las clulas primarias DEK en BME suplementado con caldo de triptona fosfato al 10%, 2mM glutamina, 0.17% de bicarbonato sdico y 24% de suero de pollo, y se ajustan para contener 3 105 clulas/ml. Se aaden las clulas a las placas a 100 l por pocillo, y las placas se incuban hasta 96 horas a 37C en una atmsfera humidificada con CO2 al 5%. Despus de la incubacin, se fijan las clulas con tampn salino con formol al 10% y se tien con cristal violeta al 1%. Entonces se leen las placas macroscpicamente. El ttulo de la actividad neutralizante del virus se expresa como el inverso de la dilucin ms alta de suero a la que creci una monocapa, es decir, no existe evidencia de ECP y, por tanto, ha tenido lugar la neutralizacin completa del virus. Un ttulo menor de log2 4 se considera negativo. Estas pruebas de neutralizacin se han usado para probar las respuestas inmunes humorales frente a la vacunacin y para encuestas epidemiolgicas, as como para la identificacin del virus.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNSTICO

El DHV de tipo I puede controlarse mediante el uso de una vacuna vrica viva atenuada. Se administra a los patos reproductores de manera que la inmunidad se transmite a travs de la yema a las aves recin salidas del huevo. La vacuna vrica viva tambin puede utilizarse para inmunizar activamente patitos recin salidos del huevo susceptibles al DHV de tipo I (3). Tambin es efectiva una vacuna inactivada de DHV de tipo I cuando se administra a patos reproductores que han sido sensibilizados con la vacuna viva o expuestos previamente en el ambiente al DHV de tipo I; la progenie de estos reproductores recibe inmunidad por va materna (18). Los patos tambin pueden ser protegidos pasivamente mediante la inoculacin de los anticuerpos de la yema de huevo de pollo. Se ha utilizado una vacuna viva de virus DHV de tipo II para proteger a los patitos unicamente bajo condiciones experimentales (5). Las infecciones por DHV de tipo III han sido controladas mediante el uso de vacunas de virus vivos atenuados administradas a patos reproductores, de forma que la inmunidad se transfiere a travs de la yema a los patitos eclosionados. Las guas para la produccin de vacunas veterinarias se dan en el captulo 1.1.8. Principios de produccin de vacunas veterinarias. Las directrices dadas aqu y en el captulo 1.1.8 estn destinadas a ser de naturaleza general y pueden ser complementadas por requisitos nacionales o regionales.

1.
a)

Control del inculo

Caractersticas del inculo
La vacuna del virus de tipo I ms comnmente utilizada en Europa est derivada de un aislamiento pasado en huevos embrionados de pollo 5355 veces; el de EE.UU. para vacunas vivas e inactivadas se ha pasado 8489 veces. El inculo del virus de tipo II se origin a partir de un aislamiento atenuado mediante 25 pases seriados en huevos embrionados de pollo (1), y ha sido utilizado experimentalmente slo bajo condiciones de campo (R.E. Gough, comunicacin personal). El inculo de la vacuna de tipo III ha sido atenuado mediante 30 pases seriados en huevos de pato embrionados inoculados va CAM.

b)

Mtodo de cultivo
Los inculos de los virus de los tipos I y II se manejan de manera similar. Deberan prepararse en huevos embrionados de pollo especficamente libres de patgenos (SPF) de 910 das de edad por va alantoidea, e incubados a 37C. Se pueden almacenar como homogeneizados de embrin en tampn salino a 70C o a una temperatura menor durante varios aos. El virus de tipo III se prepara en embriones de pato de 10 das de edad, inoculados en la CAM, e incubados durante 610 das a 37C. Se puede almacenar como un homogeneizado de la CAM y los embriones a ki 70C o a menor temperatura.

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c)

Validacin como vacuna

Todos los inculos de los virus deberan encontrarse libres de virus externos que son patgenos para los patos, pollos o pavos. Los inculos deberan encontrarse libres de toda contaminacin microbiolgica y fngica. En el caso de patitos recin eclosionados, el DHV de tipo I vivo atenuado se replica rpidamente y resulta en inmunidad entre las 4872 horas de la vacunacin. Esta inmunidad persiste durante el tiempo de vida susceptible (3). Sin embargo, en patitos protegidos mediante vacunacin de sus padres, el nivel de inmunidad derivada a travs de la madre disminuye durante las 2 primeras semanas de vida, aunque dichos patitos pueden ser reinmunizados activamente con virus atenuado administrado subcutneamente u oralmente alrededor de los 710 das de edad (8, 14). Alternativamente, la inmunidad se puede mejorar mediante la administracin de suero especfico hiperinmune o de los anticuerpos de la yema de huevo preparados a partir de huevos puestos por pollos inmunizados activamente frente al DHV de tipo I. Los patos reproductores estimulados con el DHV de tipo I vivo y administrados intramuscularmente con una dosis nica de vacuna de tipo I inactivada produjeron una progenie inmune va materna a travs de un ciclo completo de puesta (18).

2.

Mtodo de fabricacin

Los virus de DHV de los tipos I y II se manejan de forma similar. La vacuna se produce en huevos embrionados de pollo SPF de 910 das de edad inoculados a travs de la va alantoidea e incubados a 37C. Las mayora de las muertes de los embriones ocurren entre los 2 y3 das en el caso del DHV de tipo I, pero con el de tipo II las muertes no ocurren hasta 610 das despus de la inoculacin, aunque se recogen a los 35 das para obtener un mximo rendimiento de virus. Los concentrados de embriones se homogeneizan en tampn salino y se clarifican mediante una centrifugacin a baja velocidad. La preparacin se diluye apropiadamente y se distribuye en viales que preferiblemente se congelan rpidamente a 70C o a menor temperatura. Posteriormente se pueden almacenar de manera satisfactoria entre 20 y 40 C. La vacuna atenuada de DHV de tipo I tambin se encuentra disponible como una preparacin liofilizada que puede almacenarse a 28C. La vacuna reconstituida se puede utilizar con o sin la incorporacin de hidrxido de aluminio en el diluyente. En el caso de la vacuna inactivada de DHV de tipo I, los concentrados de embriones se homogeneizan y clarifican mediante centrifugacin a baja velocidad y posteriormente se purifican mediante tratamiento con cloroformo (concentracin final del 10% v/v). Entonces esta preparacin se inactiva con etilenimina binaria (BEI) recin preparada. El virus inactivado se mezcla con un adyuvante como el LSE-STM1; y como conservante se aade un 0,2% (v/v) de formol (18). La vacuna de tipo III se prepara en huevos de pato SPF de 10 das de edad inoculados a travs de la CAM con DHV de tipo III atenuado, e incubados a 37C. La mayora de las muertes de los embriones ocurren entre 6 y 10 das. Los huevos que contienen los embriones muertos junto con sus CAMs se concentran y homogeneizan en tampn salino y se clarifican mediante centrifugacin a baja velocidad. La preparacin se diluye adecuadamente y se dispensa en viales que preferiblemente se congelan rpidamente a 70C o a menor temperatura.

Anticuerpo de yema de huevo

El DHV de tipo I virulento preparado a partir de hgados de patitos o el virus atenuado se puede utilizar para hiperinmunizar pollos SPF con vistas a la produccin de anticuerpo en yema de huevo. Se recogen los huevos a partir de aves hiperinmunizadas y se almacenan a 4C hasta el momento de la produccin. Se separan las yemas, se juntan y se mezclan con un agente antiespumante. La mezcla se diluye con tampn salino que contenga no ms de un 0,2% (v/v) de formol como conservante. El producto dispensado se almacena a 4C y tiene una vida media de 1 ao. Las pruebas de esterilidad se llevan a cabo de forma habitual para garantizar la ausencia de contaminantes.

3.

Control interno

Todo embrin muerto dentro de las 24 horas de la inoculacin debe ser descartado por muerte inespecfica. La identidad del tipo de virus debe ser confirmada mediante prueba de NV realizada con antisuero especfico mediante mtodo de suero constante y virus variante. En el caso de los Tipos de virus I y II, la prueba se realiza

Una preparacin de Salmonella typhimurium (STM), un mitgeno de clulas B, en un sistema de emulsion lpido (LES). Disponible en Ribi Inmunochem Research, Hamilton, Montana 59840, USA.

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en huevos embrionados de pollo; con virus de Tipo III, la prueba se realiza con huevos embrionados de pato. El antisuero debe reducir el ttulo de virus especfico en por lo menos 102.0 ELD50 (50% dosis letal de embrin).

4.
a)

Control de lotes
Esterilidad
Las pruebas para comprobar la esterilidad y la ausencia de contaminacin de los productos biolgicos biolgicos se puede encontrar en el captulo 1.1.9.

b)

Inocuidad
Se debera inocular a un grupo de patitos de 13 das de edad susceptibles al virus de que se trate subcutneamente o intramuscularmente (en el caso de los tipos I y II), o subcutneamente (en el caso del tipo III), con la vacuna atenuada a diez veces la dosis recomendada, y a continuacin se deberan manterner en observacin por si apareciese alguna reaccin adversa a los 1021 das. Las vacunas vivas atenuadas deberan ser estables y no revertir a virulentas en pases repetidos en patitos susceptibles. Se realiza una prueba de inocuidad con la vacuna inactivada de DHV de tipo I inoculando la dosis recomendada (0,5 ml) intramuscularmente en un grupo de patitos de un da de edad; no deberan observarse efectos adversos durante el periodo de prueba. Las pruebas de inocuidad con los anticuerpos de yema de huevo se realizan inoculando subcutneamente 1 ml en cada uno de los patitos de un grupo, los cuales se mantienen bajo observacin de los sntomas de los efectos adversos durante 3 das.

c)

Potencia
Para los virus DHV de los tipos I y II, el ttulo vrico de la vacuna debera determinarse en huevos embrionados de pollo de 910 das de edad inoculados en la cavidad alantoidea e incubados a 37C. La inmunogenicidad de la vacuna para los patitos susceptibles a los virus de tipo I o II se puede valorar inoculando subcutneamente un mnimo de 103.0 LD50 de virus DHV virulento de tipo I o II por patito (3). Al menos deberan sobrevivir un 80% de las aves vacunadas y , en el caso del de tipo I, deberan morir al menos un 80% de los controles; en el caso del de tipo II, es ms realista una mortalidad del 20% de los controles. La inmunogenicidad de la vacuna inactivada se considera satisfactoria si se puede demostrar un incremento de cuatro o ms veces en el ttulo de neutralizacin del anticuerpo despus de la administracin a patitos que han sido previamente sensibilizados con el DHV de tipo I vivo y atenuado. Para el virus de tipo III, el ttulo de la vacuna debera determinarse en huevos embrionados de pato de 10 das de edad inoculados en la CAM. La pruebas de inmunogenicidad en patitos han mostrado ser difciles debido a la patogenicidad variable del virus administrado en los patitos. Los ensayos de potencia con anticuerpos de yema de huevo se realizan determinando el ndice de neutralizacin (IN) para el producto en huevos embrionados de gallina utilizando el mtodo yema de huevo constante/ virus variable. Se considera satisfactorio un IN mnimo de 103.0. La eficacia del producto se determina inoculando un grupo de patitos susceptibles con la dosis recomendada de anticuerpo de yema de huevo. Se deja un segundo grupo sin tratar. Despus de 24 horas, se inocula cada grupo con virus DHV de tipo I virulento. El producto se declara eficaz si al menos sobreviven un 80 % de los patitos tratados y mueren al menos un 80% de los controles.

d)

Duracin de la inmunidad
Los patos reproductores inoculados con una vacuna viva atenuada de DHV de tipo I dos o tres veces a las 12, 8 y 4 semanas antes de entrar en la puesta, y los patos reproductores inoculados con una vacuna viva atenuada del DHV de tipo III dos veces en las semanas 12 y 4 antes de entrar en la puesta, deberan producir una progenie inmunizada pasivamente a los largo de una temporada de cra. Sin embargo, por lo general, se recomienda revacunar cada tres meses con la vacuna DHV de tipo I y cada 6 meses con la vacuna DHV de tipo III despus del comienzo de la puesta. La vacuna atenuada de DHV de tipo I tambin puede suministrarse como una preparacin liofilizada que, justo antes de la administracin, se mezcla con un diluyente que contiene hidrxido de aluminio. Esta se administra a las 7 semanas de edad, siguiendo una segunda dosis 2 semanas antes del comienzo de la puesta. Este mtodo debera proporcionar la

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inmunidad maternal a la progenie a lo largo de un ciclo completo de puesta. No existe informacin disponible sobre el uso de la vacuna de DHV de tipo II en los patos reproductores. La vacuna viva atenuada de DHV de tipo I o de tipo II administrada subcutneamente o intramuscularmente a patitos de 1 da de edad protege frente a la enfermedad durante la duracin de su susceptibilidad. No existe informacin disponible sobre el uso de la vacuna de DHV de tipo III para inmunizar activamente patitos de 1 da de edad. Los patos sensibilizados con vacuna viva de DHV de tipo I, y administrados con una sola dosis intramuscular de vacuna inactivada de DHV de tipo I, deberan producir una progenie inmunizada maternalmente durante un ciclo completo de puesta (18). El anticuerpo de yema de huevo ofrece inmunizacin pasiva en el inicio de un brote. La duracin de su eficacia es efmera.

e)

Estabilidad
Las preparaciones acuosas de las vacunas vivas atenuadas de DHV de tipo I, II y III deberan permanecer estables durante al menos 1 ao cuando se almacenan congeladas a 70C o a menor temperatura. Una vez descongeladas, estas vacunas deberan mantenerse a 4C y usarse en una semana. Las vacunas vivas liofilizadas pueden almacenarse a 28C y deberan retener su potencia durante al menos 1 ao. La vacuna inactivada de DHV de tipo I se mezcla con un adyuvante y puede almacenarse a 4C durante al menos 20 meses sin prdida de inmunogenicidad. El anticuerpo de yema de huevo puede almacenarse durante 1 ao a 4C.

f)

Conservantes
No se aaden conservantes a las vacunas vivas atenuadas del DHV de tipo I, II y III. Se aade formol (hasta un 0,2% v/v) a la vacuna inactivada del DHV de tipo I y a la preparacin de anticuerpos en yema de huevo.

g)

Precauciones (riesgos)
La vacuna inactivada de DHV de tipo I debera agitarse bien para asegurar que est completamente mezclada antes de usarse.

5.

Pruebas en el producto final

Las vacunas vivas atenuadas del DHV de tipo I y III se emiten como viales de vacuna concentrada liofilizados o congelados junto con botellas de diluyente estril en los que se han realizado las pruebas estndar de esterilidad (vase la seccin C.4.a.). La vacuna viva atenuada de DHV de tipo II solamente se ha fabricado de forma experimental.

a)

Inocuidad
No se realizan pruebas adicionales despus del ensayo del lote en ninguno de los productos.

b)

Potencia
No se realizan pruebas adicionales despus del ensayo del lote en ninguno de los productos.

REFERENCIAS
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