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Tcnicas moleculares I Tecnologa del ADN

Estructura y caractersticas de los cidos nucleicos

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Propiedades fsico-qumicas de los AN

Temperatura de melting
Desnaturalizacin por calor del ADN. (a) Desnaturalizacin o melting de dos especimenes de ADN. La temperatura de transicin es la tm; depende del pH, la fuerza inica, la longitud y la composicin de la hebra de AND. (b) Relacin entre la tm y el contenido GC del ADN.

DMSO, formamida, pH alto -> desestabilizan los puentes H y promueven la desnaturalizacion. Baja fuerza inica -> las fuerzas repulsivas de las cargas negativas de cada hebra son tan fuertes que permiten desnaturalizar el ADN a bajas temperaturas.

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Procariotas vs Eucariotas

Genoma de un mamfero ~3 Gb

Genoma de E.coli 1,2 Mb

Tecnologa del ADN recombinante

Clivaje del ADN en sitios especficos mediante endonucleasas de restriccin, que facilitan el aislamiento y manipulacin de genes. Hibridizacin de AN que hace posible detectar secuencias especficas de ADN y ARN. Clonado de ADN usando tanto vectores de clonado como la tcnica de PCR. Secuenciacin de los nucletidos que componen un determinado fragmento de ADN (o incluso genomas enteros: WGS). Monitoreo de la expresin de genes en una clula mediante microarrays, RNAseq.

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Enzimas como herramientas de la tecnologa del ADN

Tecnologa del ADN recombinante

A principios de 1973, Stanley N. Cohen y Annie C.Y. Chang de la Universidad de Stanford y Herbert W. Boyer y Robert H. Helling de la Universidad de San Francisco realizaron el primer experimento de ingeniera gentica utilizando una tcnica conocida como ADN recombinante. Insertaron en bacterias, plsmidos conteniendo genes resistentes a los antibiticos tetraciclina y kanamicina. Luego, sometieron a las bacterias en placas de cultivo a la accin de los antibiticos. Como era de esperar, la mayora murieron. Slo sobrevivieron aquellas modificadas mediante ingeniera gentica para resistir a los antibiticos. Haba nacido la biotecnologa moderna.

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Clivaje de secuencias especficas del ADN: Enzimas de restriccin En general reconocen secuencias palindrmicas Extremos romos Extremos cohesivos

5 protruyente (extendido)

3 protruyente (extendido)

Clivaje de secuencias especficas del ADN: Enzimas de restriccin

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Marcaje de fragmentos de ADN: ADN polimerasa y Polinucletido quinasa

Oligonucletidos: son fragmentos cortos de AN de simple cadena, cuya secuencia es conocida y se encuentra marcado para su posterior seguimiento

Tcnicas electroforticas: separacin, purificacin e identificacin de AN Permiten separar las molculas de AN por tamao.

Geles de: Agarosa Poliacrilamida

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Tcnicas de deteccin de secuencias de AN especficas: Southern blot

Northern blot

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Hibridizacin in situ

Vectores de clonado: Plsmidos Estructura CCC y su tamao es de 3-10 kb y aceptan insertos de hasta 10 kb

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Clonado de ADN: Enzima ADN ligasa y vectores de clonado

Componentes mnimos: 1- Origen de replicacin 2- Gen marcador de seleccin 3- Sitios de restriccin polylinker

Otros tipos de vectores Fagos: 50 kb y aceptan 15 kb

Csmidos: hbrido plsmido y fago L. (30-52 kb) Fsmidos: similar al csmido pero basados en el plasmido F. (50-200Kb)

Fsmidos: hbrido plsmido y fago M13 Cromosomas artificiales: BACs, PACs (P1 bacteriophage), YACs y HACs (100-500 kb)

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Transferencia de la qumera de ADN a la clula huesped

Bibliotecas genmica y de cDNA

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Bibliotecas genmica y de cDNA

Metodologas de screening

PCR Hibridacin RFLP Actividad enzimtica Anticuerpos

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Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

Ciclos: Desnaturalizacin (92-95 C) Hibridacin (35-60 C) Polimerizacin (72 C)

PCR

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Introduccin a los TP 1 y 2

Extraccin de ADN plasmdico a partir de bacterias Miniprep- Hidrlisis alcalina

Cuantificacin y anlisis de pureza

Chequeo del extracto mediante electroforesis en gel de agarosa

TP n 1: Extraccin y cuantificacin de DNA plasmidico

Miniprep de ADN plasmdico Soluciones necesarias: Solucin 1: glucosa 50mM, EDTA 10mM (pH 8,0), Tris HCl 25mM (pH 8,0). Solucin 2: NaOH 0,2N, SDS 1% (w/v). Preparar en el momento de usar. Solucin 3: Kac 3M + Hac, pH 4,8. RNAsa Cloroformo Isopropanol

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Secuenciacin del ADN

Mtodo qumico: Maxan y Gilbert

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Secuenciacin del ADN Mtodo enzimtico: Sanger

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