Importana culturilor de celule i esuturi in vitro Culturile de celule i esuturi in vitro reprezint o parte component indispensabil a biotehnologiei vegetale

moderne. Culturile celulare de plante asigur o serie de avantaje, valabile n aceeai msur pentru rile industrializate i cele n curs de dezvoltare. Acestea au un minim de organizare i sunt sisteme nedifereniate n care ncorporarea anumitor compui i urmrirea lor ulterioar poate fi uor monitorizat. Aplicarea biotehnologiilor la plante poate s contribuie, n egal msur, la ameliorarea cerealelor i la protejarea speciilor ameninate. Culturile-meristem pot fi folosite la constituirea bncilor de esuturi pentru unele varieti de cereale, n special cele care snt supuse riscului de a fi eliminate prin agricultura intensiv. Producia se poate realiza continuu i nu ste limitat de sezon sau climat. Calitatea produselor obinute este superioar; ele snt n general libere de germeni patogeni i de contaminani. O alt posibilitate de aplicare a tehnicii culturilor de esuturi vegetale, i n special a celor de suspensii celulare, este aceea de a obine compui naturali (sau metabolii secundari) valoroi, produi care pot fi utilizai n industria farmaceutic i n agricultur. Culturile de celule pot fi manipulate astfel nct aceti compui s poat s fie extrai att din celule, ct i din mediul n care ele au fost cultivate. Cercetrile efectuate cu suspensii celulare induse din plante medicinale au dovedit c ele sunt capabile, n anumite cazuri, s sintezeze i s acumuleze principii farmacologice active, n cantiti care, uneori, le depesc pe cele identificate n plantele intacte. De asemenea, culturile de esuturi i celule vegetale pot fi utilizate pentru conservarea plasmei germinale i n studiul clonrii de gene, n scopul obinerii plantelor transgenice. Un alt domeniu deosebit de important este cel de utilizare a sistemelor in vitro n experimente de biotransformare. Biotransformarea poate fi definit ca fi ind procesul de conversie specific a unor substraturi exogene, ieftine, n compui utili cu ajutorul culturilor vegetale in vitro. Culturile celulare vegetale au capacitatea de a biotransforma specific, prin intermediul sistemului enzimatic, anumite substrate (naturale sau sintetice), mai rentabile din punct de vedere economic, n altele mult mai valoroase. Substraturile frecvent folosite sunt reprezentate de monoterpene, steroizi, alcaloizi indolici, warfina, taxol. Tehnicile care utilizeaz culturi de esuturi vegetale au fost aplicate cu succes mai multor specii cerealiere care joac un rol important n economia rilor n curs de dezvoltare, ct i n comerul mondial cu agroproduse. nmulirea vegetativ

realizat prin astfel de metode prezint un interes deosebit n cazul speciilor tropicale puternic heterozigote, infectate cu virusuri, i care se nmulesc pe cale vegetativ. Urmtoarele specii snt n mod curent nmulite in condiii de laborator: avocado, arborele de cacao, arborele de cafea, jojoba, arborele de cauciuc, curmalul, tutunul, morcovul, rapia, cerealele, soia etc. Repere terminologice i noionale Cultura de celule in vitro reprezint totalitatea de celule cultivate n afara organismului (in vitro- pe sticl, eprubet) pe medii nutritive artificiale. Practic orice organ al plantei poate fi izolat i inoculat pe un mediu nutritiv pentru realizarea capacitilor sale de cretere i multiplicare. Regnerarea i obinerea plantelor ntregi n condiii in vitro se bazeaz pe faptul c fiecare celul vegetal este pluripotent, adic conine n nucleul su totalitatea informaiei ereditare necesar dezvoltrii unui organism complet. Prin detaarea unui fragment de esut dintr-un organism vegetal, reeaua de semnale intra i extracelulare este mult simplificat, iar dac fragmentul de esut este plasat n condiii corespunztoare in vitro, se poate realiza att exprimarea totipotenei morfogenetice, prin reconstituirea unui organism ntreg de la celule somatice, ct i a totipotenei biochimice, prin declanarea la nivelul celulelor din cultur a ntregului potenial al metabolismului secundar caracterist ic speciei. S-a demonstrat n cazul multor specii c n condiiile asigurrii nutrienilor eseniali i a reglatorilor de cretere specifici n mediul de cultur, celulele explantelor vegetale pot fi stimulate s prolifereze i s formeze o mas de esut , cu aspect tumoral, numit calus. Calusurile tipice sunt alctuite din celule eseniale de tip parenchimatic, alturi de care coexist i alte tipuri celulare, diferite ca morfologie i ca dimensiuni, cum sunt celule xilematice i floematice, secretoare, celule de tip cambial, celule cu perei lignificai Dezvoltarea calusului are loc n dou faze: reacii la rnire i reacii de cretere. Reacia calusului la rnire se caracterizez prin diviziuni celulare limitate i printr-o cretere rapid a activitii metabolice, ceea ce nu va conduce implicit la dezvoltarea acestuia. Reacia de cretere a calusului se caracterizeaz printr-o continuare a diviziunilor celulare, pentru o anumit perioad de timp. n cazul esuturilor vegetale cultivate in vitro, reacia de cretere depinde, n special, de natura i concentraia reglatorilor de creetere vegetali prezeni n mediul de cultur.

Din punct de vedere morfologic calusul poate fi descris ca friabil sau compact. Aceste caracteristici sunt determinate de compoziia peretelui celular al celulelor componente: celulele calusului compact posed o proporie mai mare de pectine i de hemiceluloze, comparativ cu pereii calusului friabil, ca urmare acesta din urm se disperseaz cu uurin n mediul lichid, formnd culturi celulare n suspensie. Obinerea de metabolii secundari in vitro. Civilizaia este indisolubil legat de lumea plantelor, acestea constituind de milenii sursa major de obinere a uor bioproduse eseniale pentru suprvieuirea ntregului regn animal. Plantele sintetizeaz nu numai compuii de baz necesari suprvieuirii lor, din categoria hidrailor de carbon, lipidelor, proteinelor, ci i o gam larg de substane organice extractibile n cantiti suficiente pentru a prezenta o importan semnificativ ca materii prime cu variate aplicaii tiinifice, tehnologice i comerciale. Regnul vegetal continu s reprezinte principalul furnizor de compui fitochimici utilizai n diferite ramuri industriale, cum sunt cele ale produselor farmaceutice, alimentare, cosmetice, agrochimic. Plantele constituie surse de nenlocuit pentru uleiuri industriale, arome, parfumuri, rini, gume hidrocoloidale, saponine i ali surfactani, colorani pesticide, cauciuc natural, substane medicamentoase i muli ali compui eseniali. Fitochimicalele cele mai cunoscute includ medicamente ca morfina i codeina (alcaloizi analgezici derivai din latexul de la Papaver somniferum), cocaina (alcaloid anestetic local derivat din frunze de coca), chinina (alcaloid antimalaric derivat din scoar de Cichona); parfumuri i esene ca uleiul de trandafir i jasminul, materii prime industriale ca acizii grai, ulei de pin i cauciuc natural, pesticide ca piretrinele i nicotina Se apreciaz c un numr mare de compui noi sunt identificai anual in diferite specii de plante, dar este totodat semnalat i rapiditatea procesului de extincie a speciilor i de ingustare a bazei genetice a resurselor vegetale in lume. De exemplu, planta Pilocarpus pabonadi utilizat pentru producerea medicamentului pilocarpin, datorit colectrii neraionale este in prezent declarat specie ameninat cu dispariia in Himalaia i a fost inlocuit cu Pilocarpus microphyllus ca surs de principii farmacologic active . Acest fenomen a stimulat atat reconsiderarea importanei vitale a resurselor genetice cat i interesul pentru obinerea metaboliilor secundari prin metode neconvenionale. Inc din 1952 J.B. ROUTIEN i L.G. NICKEL au obinut un brevet cu titlul "Cultivarea celulelor vegetale" demonstrand cu acest prilej c celulele vegetale pot s creasc in medii lichide i c aceste celule pot fi utilizate pentru obinerea de compui chimici utili. Dar abia 30 de ani mai tarziu in 1982 Y. FUJITA i colab. au raportat producerea

primului produs natural la scar comercial - shikoninul din culturi celulare de Lithospernum erythrorhizon. Introducerea conceptului de metabolit secundar i este atribuit lui A. Kossel (1891) care pentru prima dat a ncercat s defineacs aceti compui prin antitez cu ccea ce se cunotea n domeniul metaboliilor primari . un pas important s-a realizat 30 de ani mai trziu, datorit eforturilor lu F. Czapek (1921) care a dedicat un ntreg volum descrierii a ceea ce numea compui finali, derivai din metabolismul azotului prin modificri secundare. Metaboliii secundari sunt prezeni numai la anumite specii, adesea manifestnd specificitate de organ sau esut, pot fi identificai numai la un anumit stadiu al creterii i dezvoltrii n cadrul unei speii, sau pot fi activai numai pe parcursul perioadelor de stres, ceea ce a condus mult vreme la etichetarea lor drept compui de lux sau produse de excreie, rprezentnd greeli ale metabolismului primar. Sinteza lor pare fr semnificaie direct pentru celula sintetizatoare, dar poate fi decisiv pentru funcionarea organismului ca ntreg. Este plauzibil interpretarea c metaboliii secundari ofer un avantaj selectiv speciilor. De exemplu la speciile unde polenizarea este realizat de ctre insecte, acestea sunt atrase de culoare, parfum sau de prezena nectarului, caracteristici oferite de metaboliii secundari. Rolul pigemnilor este evident i n rspndirea seminelor de ctre psri i alte animale atrase de culorile vii ale structurilor vegetale. Stigmatele foarte de la Crocus sativus, utilizate drept colorant alimentar, ca i cloarea rou intesns a ardeilor iui (Capsicum frutescens), precum i iueala capsaicinei, au efet atractiv sau repelent asupra animalelor. Unii compui sunt implicai n protecia f de razele UV, de stres osmotic sau n interaciunile alelopatice cu alte plante. Recent s-a demonstrat c flavona luteolin exudat de rdcinile lucernei servete ca semnal care activeaz genele rhizobiilor din rizosfer, jucnd un rol important n colonizarea rdcinilor i stabilirea nodozitilor. Un exemplu clasic de metabolit secundar, metiljasmonatul, familiar pentru parfumul de jasmin, este recunoscut ca parte a unui lan de traducere a semnalelor care ncepe cu acidul gras a-linolenic, asociat cu membranele celulare, conducnd la efecte pleiotropice diferite, de la activarea genelor de aprare, pn la senescen. Flavonoli sunt eseniali pentru germinarea polenului i pentru creterea tubului polinic, plantele cu deficiene n biosinteza de flavonoli fiind caracterizate prin sterilitate masculin. Unii compui din categoira metaboliilor secundari , dintre care trebuie s amintim n primul rnd nicotina, piretrinele i rotenona, sunt utilizate ca pesticide. Piretrinele constituie cel mai important compus natural vegetal folosit pentru

constrolul insectelor. Alturi de cinerine i jasmoline, constituie un grup de esteri extrai din florile de Chrysanthemum cinerariaefolium. Rotenonele i rotenoizii au o larg utilizare nu numai ca insecticide, ci i ca piscicide. n Brazilia se aplic mii de tone pentru a elimina petii pirania din rurile rezervaiilor.

Tabel nr.1 Exemple de compui de interes farmaceutic obinui n scar comercial din surse vegetale (dup Balandrin i Klocke, 1988) Clasa de compui A. Steroizi Hormoni (derivai ai diosgeninei, hecogeninei i stigmasterolului) Glicozizi digitalici (digoxin, digitoxin) B. Alcaloizi Alcaloizi beladonici (atropin, scopolamin) Alcaloizi tip opium (morfin, codein) Reserpin Vincristin, vinblastin Physostigmin Pilocarpin Chini, chinidin Colchicin Cocain Atropa belladona Datura stramonium Papaver somniferum Anticolinergici Analgezici Dioscorea sp. Glicine sp. Digitalis purpurea D. lanata Contraceptivi orali i ali hormoni steroizi Cardiotonici Surse botanice Utilizare terapeutic

Rainwolfia serpentina Chatarantus roseus Physostigma venenosum Pilocarpus sp. Cinchona sp. Colchicum autumnale Erytroxylon coca

Psihotropici Anticancerigeni Colinergic Colinergic Antimalaric, antiaritmie cardiac Gut Anestezic local

Intensa concentrare a cercetrilor efectuate in diferite laboratoare din lume in scopul utilizrii culturilor de esuturi i celule vegetale ca surse poteniale de metabolii utili poate fi explicat prin avantajele importante oferite de acestea, ca de pild: metaboliii utili pot fi obinui in condiii controlate de mediu, in flux continuu, indiferent de factorii climatici sau de insuirile solului; celulele oricrei plante, tropicale sau alpine, pot fi uor multiplicate in scopul producerii metaboliilor specifici; metabolice contribuie la reducerea costului forei de munc i la imbuntirea productivitii; mai rapide decat cele ale plantei in condiii naturale. De exemplu in cazul sikoninului un ciclu de producie in bioreactoare dureaz cateva sptmani, in timp ce numai plantele in varst de 5 ani sunt recomandate pentru extracia produsului farmaceutic; prin selecie clonal i mutagenez se pot izola linii celulare care sintetizeaz metaboliii secundari in cantiti chiar mai mari decat cele prezente in organele specializate ale plantei intacte; biotransformarea unor substraturi pentru obinerea unor noi compui neidentificai in natur sau pentru producerea unor enzime utilizabile in sinteza chimic a compuilor naturali

Tabel nr.2 Produse obinute prin culturi in vitro i comercializate (dup Chrispeels i Sadava, 1994) Produsul ikonin Berberin Biomas Peroxidaz Geraniol Acid rozmarinic Digoxin Specia Lithospermum erythrorhizon Coptis japonica Panax ginseng Raphanus Geranium spp. Coleus blumei Digitalis lannata Compania Mitsui Mitsui Nitto Denki Tozobo Kanebo Natterman Boeringer ara Japonia Japonia Japonia Japonia Japonia Germania Germania

Elaborarea unei tehnologii de producie a metaboliilor secundari n culturi in vitro presupune parcurgerea mai multor etape: 1. Alegerea speciei i chemotipului Se pornete de la raionamentul, c genurile/speciile care sintetizeaz un metabolit secundar n cantiti mari vor genera culturi in vitro foarte productive. De exemplu, genurile Scopolia, Duboisia i Atropa sintetizeaz alcaloidul atropin. Speciile genului Duboisia sunt cele mai bune surse de atropin, ns nu sintetizeaz acest compus in vitro. n schimb, n aceeai cndiii, n culturile derivate din speciile genului Atropa este detectat atropina. n continuare, n cadrul speciei respectie, se selecioneaz plante foarte productive, exploatndu-se variabilitatea genetic natural 2. Obinerea unei colecii de calusuri Se iniiaz culturi de calus scopul: extinderea variabilitii genetice prin efectul mutagen al culturii per se. Sunt luai n considraie toi factorii implicai n controlul fenomenului: - Tipul de explant (se folosesc explante foarte variate, provenite din frunze, rdcini, inflorescene etc); - Tipul mediului de cultur (se folosesc diferite dze de sruri minerale i surse de energie, hormoni diveri); - Condiiile d cultur (se aplic diferite temperaturi, ftoperioade etc.). Colecia de calusuri este meninut prin subcultivri, repetate la intervale regulate de timp. n cursu acestr repicri, sunt seecinate variaiile de interes (culoare, aspect, consisten, vitez de cretere). Liniile celulare identificate sunt izolate i multiplicate n condiii de cultur bine stabilite 3. Selecia liniilor celulare nalt productive La aceast etap sunt necesare o serie de tehnici foarte eficace de extracie i de dozare a metabolitului. Tehnicile utilizate n cazul plantelor ntregi nu sunt ntotdeauna aplicabile culturilor in vitro n absena unor organe specializate pentru acumulare, pot fi selecionate tipurile celulare care rezolv aceast problem. De exemplu, celulele de busuioc i de mac acumuleaz terpenoizi sub form de glucozide i, respectiv, alcaloizi conjugai cu molecule cu greutate mare. Tot n absena organelor specializate, este posibil ca metabolitul secundar s fie eliberat n mediu (prin liza celulelor, difuzie sau excreie). Metaboliii colorai (ikonine, antociani) sau cei care sunt fluoresceni n ultraviolet (serpentina, acidul rozmarinic, se selecioneaz cel mai uor (vizual Pentru toi ceilali se poate utiliza ntreaga gam de metode biochimice cunoscute

colorimetrice, cromatografice, imunologice. Metodele de detectare trebuie s fie rapide, sensibile,fiabile, reproductibile i aplicabile att celulelor, ct i mediului . 4. Obinerea unei suspensii celulare stabile i nalt productive Pentru utilizarea tehnologiilor industriale aplicate n mod obinuit la microorganism, este necesar trecerea culturilor n mediu lichid. Trecerea se face treptat, ncepndu-se cu vase de 250 ml. noile condiii de cultur pot determina ns modificri ale capacitii de biosintez, impunnd o nou selecie pentru izolarea unor cloni cu randament stabil. Odat obinut, o linie stabil n mediul lichid, se poate trece la optimizarea produciei. Altfel spus, la stabilirea factorilor chimici i fizici care determin cele mai nalte niveluri ale produciei compusuli vizat. Se studiaz efectele modificrii: - Surselor de elemente minerale (azot, fosfor) i/sau de energie din mediu - Valorii pH - Condiiilor de mediu (temperature, calitatea luminii, oxigenul) asupra produciei metabolismului secundar. Dac sinteza se realizeaz la nivelul cloroplastelor (de exemplu, producerea alcaloizilor in vitro la lupin), trebuie stability un protocol de cultur fotoautotrof la lumin, n absena zaharozei i n atmosfer bogat n CO2. Trebuie determinat, de asemenea, momentul sintezei metabolitului: la sfritul culturii, n faza staionar sau n faza de ncetinire a creterii. Frecvent, se stabilesc condiiile optime de cretere a culturilor i sintez a metaboliilor, care pot s nu coincid. De exemplu, producerea comercial a ikoninelor (compui colorai, antimicrobieni) se realizeaz n dou etape: - O etap cu durata de 9 zile, n care se produce biomasa; - O etap de producie a metaboliilor, cu durata de 5 zile, ce se desfoar ntr-un mediu mbogit cu azot i calciu (creterea coninutului de calciu de 30 de ori determin creterea produciei de metabolii de 3 ori), dar lipsit de vitamine i citokinine. Optimizarea produciei se mai poate realize prin: - Adiionarea n mediul de cultur a unui precursor al metabolitului; - Aplicarea unor stresuri de natur biotic (provocate de filtrate ale culturilor unor patogeni) sau abiotic (generate de metale grele). Suspensiile celulare stabile i foarte productive trebuie conservate la temperaturi sczute, eventual n azot lichid. 5. Extracia i purificarea Se efectueaz prin metode clasice, chimice i biochimice. Exist dou situaii: - Metabolitul secundar este secretat n mediul de cultur, de unde poate fi extras;

- Metabolitul secundar este acumulat n celule, urmnd s fie extras din biomasa recoltat. Metoda culturii de celule i esuturi in vitro Cultivarea in vitro a plantelor se realizeaz innd cont de o succesiune de etape: 1. Alegerea explantului primar. Explantul sau fragmentul de esut vegetal ce urmeaz a fi cultivat in vitro este prelevat de pe o aa numit plant-mam. Culturile celulare vegetale pot fi iniiate att din speciile de cormofite monocotiledonate, ct i din cele dicotiledonate. Fragmentul poate fi izolat din orice parte a organismului vegetal cu condiia s conin esuturi vii. . Succese notabile au fost obinute mai ales n condiiile cultivrii unor explante structurate, cum snt vrfurile de cretere, embrionii, mugurii, nodurile, dar i n cazul folosirii unor segmente de tulpin, rdcin, frunz, floare sau fruct. Rezultate remarcabile au fost nregistrate, de asemenea, i n cazul cultivrii de antere, polen, ovare, ovule i celule. Acestea din urm sunt izolate fie mecanic, fie enzimatc, aplicarea ultimului procedeu ducnd i la debarasarea de peretele celular, cu obinerea de protoplati. Diversitatea explantelor utilizate se poate diviza n dou grupe principale: explantele ce conin celule nedifereniate: celule meristematice caulinare (apex, muguri, noduri, meristeme) -mediul nutritiv trebuie s permit declanarea funcionrii celulelor n aa fel, nct programul lor s se desfoare normal; explante din esuturi difereniate cu celule specializate -Mediile trebuie s induc dediferenierea i redobndirea capacitii de diviziune i constituirea unei structuri meristematice. Pentru iniierea calusului, materialul vegetal folosit ca explant trebuie s fie tnr, sntos i viguros, nefiind indicat utilizarea esuturilor plantelor care sunt pe cale de a intra n senescen. Totipotena celular- capacitatea oricrei celule vegetale de a reproduce integral planta din care provine- se exprim cu att mai eficient cu ct plantele-mam sunt mai tinere. Folosirea plantulelor foarte tinere este avantajoas i pentru iniierea calusurilor, n special n cazul celor provenite din semine sterilizate i germinate aseptic. Din aceste motive, este necesar ca pentru inducerea de culturi calusale dintr-o anumit specie, s fie testate ct mai multe surse de explante (esuturi i organe). La Dioscorea caucasica a fost testat capacitatea calusogen a mai multor tipuri de explante- de rdcini, hipocotile i frunzulie- excizate din plantule provenite din semine germinate aseptic, precum i embrioni zigotici, maturi, prelevai din

semine. Dintre toate aceste tipuri de explante, cele mai adecvate pentru iniierea calusului s-au dovedit a fi embrionii intaci, maturi, embrioni din care s-a dezvoltat mult mai rapid i ntr-o cantitate mult mai mare biomasa calusal. Alegerea judicioas a explantului constituie una dintre condiiile eseniale ale reuitei unei culturi in vitro.

2. Pregtirea explantului. Unul dintre cele mai importante criterii care trebuie respectat cu strictee n cazul culturilor de celule vegetale este meninerea sterilitii lor. Aceasta const n neutralizarea tuturor microorganismelor de pe suprafaa esuturilor externe, ns fr a deteriora interiorul lor. Pentru sterilizare mai des se folosesc compui care conin clor activ (hipoclorat de calciu, hipoclorat de natriu, peroxid de hidrogen, etanol, biclorat de mercur, caronat de clor), de asemenea unele preparate ce conin metale grele. Procedura are loc n felul urmtor: se detaeaz frunzele materialului vegetal, se spal cu ap i detergent i se in sub uvoiul de ap cteva minute. Apoi se spal cu ap distilat i se sterilizeaz. 3. Alegerea mediului de cultur. Printre factorii de valoare major, de care depinde succesul culivrii plantelor in vitro, este mediul nutritiv optimal, echilibrat dup factorii principali: nutriia mineral, nutriia glucidic, reglatorii de cretere, factorii fizici de cultivare.De foarte multe ori, reuita cultivrii in vitro depinde de realizarea unor amestecuri nutritive care s corespund compoziional, necesitilor vitale ale celulelor inoculate, pentru a compensa lipsa celor mai importani factori de care depindea existena lor la locul de origine, n plantele intacte. Plantele trebuie plasate pe medii nutritive potrivite ca i compoziie, pentru inducerea formrii de calus. Mediile utilizate n cultivarea variatelor tipuri de explante in vitro se bazeaz pe amestecuri alctuite din cel puin 20 de componente, n care sunt combinate elementele organice cu cele anorganice. Specii diferite de plante au nevoie de medii specifice, iar esuturile calusale, derivate din diverse pri ale plantei, manifest cerine nutriionale variate. Au fost elaborate numeroase medii de cultur care au fost testate la diferite specii de plante. Mediul este identificat dup compoziia n sruri minerale. Vitaminele, hormonii i ali compui difer considerabil cantitativ i calitativ. Alegerea mediului depinde de specia cu care se experimenteaz i de scopul cercetrii. n funcie de scopul urmrit mediile de cultur prezint particulariti de compoziie, de exemplu: anumite medii de cultur sunt recomandate pentru culturi de antere (Nitsch), pentru culturi de rdcini (White), pentru culturi de meristeme de

calus(Murachige-Skoog). Sunt utilizate frecvent, pentru diferite scopuri mediile Murashige-Skoog (1962) i Gamborg (1968), asociate de la caz la caz cu diferite formule de vitamine i diverse concentraii de hormoni. Mediile nutritive utilizate trebuie s conin: Nutrieni anorganici, clasificai n macroelemente (N, P, S, K, Mg, Ca, Na, Cl) i microelemente (Fe, Zn, Mn, I, B, Mo, Co, Cu). A. Macroelementele. Unul din principalele elemente care intr n alctuirea tuturor mediilor nutritive este azotul. [2]. Pentru creterea esuturilor vegetale ese necesar azotul n form accesibil. El se adaug la mediu n form de nitrai (NO3) i/sau amoniu (NH4). [7]. n majoritatea cazurilor, prezena ionului de amoniu ca i unic surs de azot este improprie asigurrii unei mai bune evoluii a culturilor, deoarece, pH-ul mediului are tendina de a scdea la valori de sub 5, pe durata perioadei de cultivare. Aceast scdere a pH-ului poate s conduc la reducerea accesibilitii azotlului pentru celule, fenomenul fiind demonstrat la mai multe specii cultivate in vitro, sub form de suspensii celulare, aa cum au fost cele de soia, de orez sau de morcov. [2]. Ca surse de baz ale azotului servesc nitraii. n cadrul experimentelor s-a demonstrat c cantitatea biomasei proaspete de celule vegetale n suspensie este direct proporional cu valoarea concentraiei de azot n mediul nutritiv . [10] Creterea i diferenierea celulelor vegetale izolate necesit, de asemenea, prezena n mediul nutritiv a fosforului, care se adaug, de regul, sub form de ortofosfat. n cazul macroelementelor de calciu i magneziu s-a observat c exist un anumit antagonism, deoarece mrirea concentraiei unuia dintre cele dou elemente atrage dup sine necesitatea sporirii concentraiei celuilalt. (11, p.289). B. Microelemente care intr n mod obinuit n alctuirea mediilor de cultur sub form de sruri, sunt: nichel, aluminiu, bor, mangan, iod, cobalt, cupru, molibden. [2]. Acestea pot determina n cele din urm reita exerimentelor, iar lipsa unuia poate s conduc uneori la apariia unor perturbri profunde a creterii culturilor de suspensii celulare. Nutrieni organici A. Hidraii de carbon. Capacitatea diferiilor hidrai de carbon de a asigura creterea calusurilor i a suspensiilor celulare vegetale a fost evideniat nc n anul 1974, de ctre Maretyki i colaboratorii si. Autorii au ajuns la concluzia c zaharoza, sau monozaharidele care o compun, respectiv glucoza i frutoza, ca surse de carbon, pot asigura o cretere optim esuturilor vegetale cultivate in vitro. Alte dizaharide care pot fi utilizate de esuturile vegetale , n funcie de specia din care provin sunt:

maltoza, lactoza, celobioza, melibioza i trehaloza. De asemenea trizaharide ca rafinoza, tetrazaharide ca stahioza sau polizaharidul amidon pot fi metabolizate de ctre anumite esuturi i celule cultivate in vitro, cum ar fi cele de morcov, ori trestie de zahr. n afar de glucoz i fructoz, au mai fost citate ca accesibile pentru anumite specii monozaharidele ca: galactoza, manoza, manitolul, sorbitolul, riboza sau glicerolul. S-a constatat c arabinoza, xiloza i ramnoza nu asigur energia necesar creterii culturilor de esuturi i celule vegetale. De asemenea, s-a observat c nici pentozele, aa cum sunt acidul uronic sau inozitolul, ca surse unice de carbon i energie, nu ntrein creterea esuturilor i celulelor vegetale cultivate in vitro. B. Reglatori de cretere Reglatorii de cretere sunt componenii de baz ai mediilor nutritive. n lipsa lor practic nu are loc diferenierea celulelor i esuturilor vegetale izolate. Diferite organe i esuturi vegetale conin diverseconcentraii de hormoni endogeni. Din aceste considerente, la cultivarea esuturilor izolate in vitro este necesar prezena n mediu a reglatorilor de cretere n diferite concentraii acetia stimuleaz diviziunea celular i provoac formarea i dezvoltarea mugurilor noi. Principalele grupe de reglatori de cretere sunt: auxinele, citochininele i giberelinele. Reglatorii de cretere posed anumite caracteristici comune, i anume: -acioneaz n doze mici; -reacioneaz n mod specific la nivelul celulelor prin intermediul receptorilor; -acioneaz n echilibru unii cu ceilali; -induc efecte variabile n funcie de concentraiie utiizate; -n doze mari pot fi inhibitori sau toxici Auxinele au fost depistate n diferite organe ale plantelor cu cretere activmuguri, frunze tinere, apexul rdcinii i tulpinii, cotiledoane i reprezint unicii fitohormoni care au analog n lumea animal. [4]. Auxinele intervin n numeroase procese fitofiziologice i interacioneaz cu diferite substane endogene, n special cu ali fitohormoni. Aciunea fiziologic a auxinelor asupra plantelor, dei este foarte complex o putem rezuma astfel: - Acioneaz asupra creterii n lungime a celulelor, mrind plasticitatea pereilor pectocelulozici a acestora - Permeabilizeaz membranele plasmatice pentru ap i anumii ioni - Stimuleaz diviziunea celular - Au aciune retardant asupra cderii frunzelor i fructelor [2]

Citochininele. n anul 1955, a fost izolat prima citochinin- chinetina de ctre Miller i colaboratorii, n laboratoarele lui Skoog. [2]. Grupul acestor hormoni mai includ benzilaminopurina, zeatina i izopentiladenina. Semnificaia biologic a acestora: - Stimuleaz diviziunea celular i germinaia seminelor - n vitrocultur stimuleaz formarea de mugurai i tulpinie (caulogeneza) - Mresc rezistena la frig i substane toxice - Previn senescena [4] Giberelinile sunt fitohormoni de mai mic importan pentru vitrocultur, fiind mai frecvent utilizate n practica agricol. n vitrocultur, sunt utilizate numai atunci cnd se dorete o favorizare a alungirii meristemelor caulinare, apicale, n absena acidului giberelic din substratul de cultur, meristemele caulinare, apicale prezint uneori o cretere globular, iar adaosul de giberelin face ca miniinternodurile meristemelor caulinare s se alungeasc. [2] C. Vitamine La mediile nutritive se adaug de asemenea i unele vitamine (B1- tiamina, b3acidul pantotenic, B6- piridoxina, B5- acidul nicotinic, B2- riboflavina). [7] Vitamina B1, sau tiamina, este frecvent recomandat ca adaos la mediile de cultur destinate cultivrii in vitro deoarece stimuleaz creterea celulelor i a esuturilor. Vitamina B6, este o vitamin nelipsit din mediile de cultur, fiind considerat ca un precursor al unor enzime. Acidul nicotinic a fost utilizat nc din anul 1938 n prepararea mediil or, fiind un component nelipsit, considerat ca optim pentru creterea in vitro a variai inoculi de natur cormofitic. Vitamina C, n concentraii de 1-50 mg/l, este recomandat ca factor antioxidant, prezena sa n mediile de cultur prentmpinnd oxidarea fenolilor (compui eliminai n medii de ctre unele explante, mai ales prelevate de la speciile lemnoase), fenolii oxidai exercitnd o aciune nociv asupra inoculilor. [2] D. Agarul Agarul reprezint o polizaharid care se utilizeaz n calitate de solidificator al mediului nutritiv. n unele cazuri, n aceast calitate se pot utiliza diferite geluri. [7]. Cantitatea de agar, recomandat pentru a fi adugat mediului de cultur, difer n funcie de natura culturilor i inoculilor, variind ntre 0,6-1%. De curnd au fost introduse ca agent gelificant cu excelente rezultate, agregatele microcristaline de celuloz. n condiiile utilizrii ca agent gelificant a gelatinei, n concentraie de cca 10 %, creterea esuturilor vegetale este diminuat, din cauza

compacticitii gelului i a unei insuficiente aerri a esuturilor, a ngreunrii schimburilor ionice i a frnrii absorbiei elementelor nutritive din substratul de cultur. n gelificarea mediilor de cultur, optime pentru cultivarea in vitro a explantelor, cu rezultate bune sunt folosite i biogelurile, silicagelul sau gelurile de poliacrilamid. [2] Creterea i diferenierea esuturilor vegetale depind i de o serie de factori fizicochimici de cultivare, i anume: pH-ul mediului -determin activitatea biocatalizatorilor, direcia i viteza diferitor reacii biochimice, stabilitatea i accesibilitatea unor factori ai mediului nutritiv (AIA, AG, vitamine); aeraie -determin diferenierea celulelor i esuturilor vegetale; presiune osmotic -determin direcia i viteza transportului de substane prin membrana citoplasmatic temperatur -determin activitatea enzimelor, parcursul normal al proceselor metabolice, creterea celular; iluminare -determin realizarea informaiei genetice, activitatea mitotic a celulelor, creterea celular. [7] 4. inocularea culturilor Inocularea culturilor se realizeaz n camera de operaie (box) care eventual se sterilizeaz. ncperea n primul rnd se cur de praf, apoi se sterilizeaz folosind razele ultraviolete, care distrug complet microorganismele. Ca surs de radiaie se folosesc lmpile bactericide utlraviolete. Lucrnd n camera aseptic se cere respectarea unui ir de reguli: - de nchis ermetic ua camerei; - de mbrcat halatul; - de dezinfectat minile u alcool de 80%. Inocularea culturii const n fragmentarea explanilor, anterior sterilizai, cu instrumente sterile i introducerea acestora n vase cu medi aseptice .

5. Iniierea culturilor Iniierea formrii de calus, la nivelul explantelor cultivate in vitro, pote fi observat ca o dilataie a zonei ce cuprinde esuturile rnite, tiate. Ea are loc dup cca 5 sptmni de la inocularea explantelor pe medii adecvate. Deoarece celulele au o densitate minim la inoculare, dup care ele pot rmne viabile fr s creasc, calusul trebuie s rmn ataat explantului timp suficient pentru ca el s ajung la un volum de cca 0,3 cm cubi. Dup aceea, calusul poate fi desprins de explant, cu ajutorul unui bisturiu steril, fiind apoi transferat separat, pe un mediu de cultur proaspt.[2] 6. Incubarea culturilor Creterea i dezvoltarea explantelor inoculate pe medii septice depinde foarte mult nu numai de compoziia substratului de cultur, ci i de regimul de lumin i temperatur existent n camerele de creteree. Culturile sunt incubate n incinte climatizate, cu regim fotoperiodic reglabil. Regimul termic cel mai des utilizat este de 25-27 grade C, iar umiditatea de 90-100 %.