EXTRACCIN DE RNA El RNA es una cadena formada por ribonucletidos que est presente en clulas procariotas, eucariotas y virus.

El RNA celular es lineal y de hebra sencilla, en los virus es de doble hebra. El RNA es definido por tamao y secuencia y puede ser aislado prcticamente puro. Debido a que los residuos de ribosa llevan grupos hidroxilo en las posiciones 2 y 3 el RNA es qumicamente ms reactivo que el DNA, y es fcilmente destruido por enzimas RNasas, las cuales son liberadas en el proceso de lisis celular e hidrolizan los enlaces fosfodister, as que es necesario tener mucho cuidado para evitar contaminacin con estas enzimas. Estas RNasas a diferencia de las DNasas no requieren iones divalentes para su actividad, y pueden ser inactivadas con la inclusin de EDTA u otro compuesto quelante en solucin buffer. La rapidez en la extraccin es la clave para la purificacin exitosa del RNA, igualmente el uso de denaturantes fuertes como el hidrocloruro de guanidinio o tiocianato de guanidinio destruye las clulas solubilizando sus componentes y denaturando las RNasas simultneamente.

as que si aparecen es necesario incluir en el proceso una extraccin orgnica. Protocolo de extraccin de RNA con TRIzol Homogenizacin: lisis celular con el reactivo TRIzol (solucin monofsica de isotiocianato de guanidinio y fenol). Homogenizacin vigorosa en vortex e incubar por 15 minutos sobre hielo para permitir la disociacin completa de las nucleoprotenas complejas. Fase de separacin: adicin de cloroformo. Centrifugar por varios minutos a 4C, se separa la fase orgnica (fenol - cloroformo) de la acuosa, y en la acuosa queda el RNA. Precipitacin del RNA: adicin de alcohol isoproplico a la fase acuosa mezclar y dejar en reposo por una hora o ms a -20C. Lavado del RNA: se emplea etanol al 75%, se centrifuga, y se repite el procedimiento una vez ms. Redisolucin del RNA: disolver con agua tratada con DEPC (dietilpirocarbonato) para evitar la presencia de RNasa que pueda daar la muestra aislada.

Tratamiento con DNAsa. La extraccin del RNA en tejidos puede no ser tan eficiente debido a la presencia de tejido adiposo ya que es rico en triglicridos. La extraccin por lisis con guanidinio es algunas veces contaminado significativamente por polisacridos y proteoglicanos. Estos contaminantes pueden prevenir la solubilizacin del RNA, Combinar el RNA con: Buffer One-Phor-All Plus: glutamato de potasio 1M, trisacetato 250 mM, acetato de magnesio 100 mM, pH 7,5. RNasin: inhibe RNasa eucariota, similar al inhibidor de RNasa placental humano.

RQ1 DNasa libre de RNasa: desoxiribonucleasa I que degrada en DNA de cadena sencilla o doble. Agua tratada con DEPC. Incubar a 37C por 30 minutos. Extraer el RNA tratado con una solucin de TRIzol. Precipitar con isopropanol. Lavar con etanol al 70%.

El rendimiento de la extraccin de RNA depende si es de tejidos o de clulas, para tejidos est entre 4-7 g/mg y en clulas de 5-10 g/106 clulas. La relacin A260/A280 est generalmente entre 1.8-2.0. Tambin se tiene la relacin A260/A230, la cul debe ser mayor a 1,8; esta relacin se encuentra por debajo de este valor evidencia la presencia de contaminantes como compuestos aromticos, pptidos y carbohidratos. BIBLIOGRAFA SAMBROOK, J. RUSSELL, D. W. Molecular Cloning A Laboratory Manual. Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, 2001. P. 7.2 - 7.6 http://fds.oup.com/www.oup.co.uk/ pdf/pas/5-7-4.pdf

http://medicine.yale.edu/keck/ycga/ Images/TRIZOLRNAIsolation_0921 07_tcm240-21453.pdf W.M. Keck Foundation Biotechnology Microarray Resource Laboratory at Yale University. TRIZOL RNA Isolation Protocol. Denovan-Wright, E., Gilby, K., Howlett, S., Robertson, H. DNase treatment of total cellular RNA to remove contaminating genomic DNA. Department of Pharmacology, Dalhpusie University, Sir Charles Tupper Nedical Buildind, Halifax, Nova Scotia, B3H 4H7, Canada. http://php.med.unsw.edu.au/cellbiol ogy/images/5/5e/TRIzol_Method.p df http://www.cmbn.no/tonjum/repuffe r.html http://www.promega.com/products/ dna-and-rna-purification/rnapurification/rnasin-plus-rnaseinhibitor/