Microbiologa de los alimentos para consumo humano y animal - Gua para la preparacin y produccin de medios de cultivo - Parte 1: Directrices generales para el aseguramiento de la calidad para la preparacin de medios de cultivo en el laboratorio
Prembulo
El Instituto Nacional de Normalizacin, INN, es el organismo que tiene a su cargo el estudio y preparacin de las normas tcnicas a nivel nacional. Es miembro de la INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION (ISO) y de la COMISION PANAMERICANA DE NORMAS TECNICAS (COPANT), representando a Chile ante esos organismos.
Este proyecto de norma se estudi a travs del Comit Tcnico Microbiologa de los alimentos, para proporcionar la terminologa general relativa al aseguramiento de la calidad para la preparacin de los medios de cultivo, y especificar los requisitos mnimos de aplicacin en los anlisis microbiolgicos de productos destinados al consumo humano o animal.
Este proyecto de norma es una traduccin modificada de la versin en ingls de la Especificacin Tcnica Internacional ISO/TS 11133-1:2000 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Guidelines on preparation and production of culture media - Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory.
Para los propsitos de este proyecto de norma, se han realizado los cambios editoriales que se indican y justifican en Anexo E.
La Nota Explicativa incluida en un recuadro en clusula 2 Referencias normativas y en Anexo Bibliografa, es un cambio editorial que se incluye con el propsito de informar la correspondencia con norma chilena de la norma internacional citada en este proyecto de norma. NCh3162 II
En este proyecto de norma se han realizado modificaciones con respecto a la especificacin tcnica internacional debido a la necesidad de armonizar este proyecto de norma con otra norma chilena sobre el tema. Estas desviaciones tcnicas se han incorporado al texto del proyecto de norma, y estn marcadas con una barra simple en los mrgenes (I).
En Anexo E se incluye una lista completa de las desviaciones tcnicas, junto con su justificacin.
Este proyecto de norma NCh3162 ha sido preparado por la Divisin de Normas del Instituto Nacional de Normalizacin.
Los Anexos A, B, C, D y E no forman parte del proyecto de norma, se insertan slo a ttulo informativo. NCh3162 III
Contenido
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Prembulo I
0 Introduccin 1
1 Alcance y campo de aplicacin 2
2 Referencias normativas 2
3 Trminos y definiciones 3
3.1 Generalidades 3
3.2 Terminologa de aseguramiento de la calidad 3
3.3 Terminologa de los medios de cultivo 3
3.4 Terminologa de los organismos de control 6
4 Prcticas para el control de la calidad de los medios de cultivo 7
4.1 Documentacin 7
4.2 Almacenamiento 7
4.3 Preparacin de los medios en el laboratorio 9
4.4 Preparacin para el uso 12
4.5 Eliminacin de los medios 13
5 Control de la calidad de los productos finalizados 13
5.1 Control de la calidad fsico 13
5.2 Control de la calidad microbiolgica 14
NCh3162 IV
Contenido
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Anexos
Anexo A (informativo) Denominacin de los componentes de los medios de cultivo en las normas de anlisis microbiolgico de los alimentos para consumo humano y animal
16
A.1 Generalidades 16
A.2 Peptonas 16
A.3 Extractos 16
A.4 Agar 17
A.5 Otros 17
Anexo B (informativo) Gua para la conservacin y mantenimiento de cepas de control
18
B.1 Generalidades 18
B.2 Cepas de referencia de origen comercial 18
B.3 Reserva de cepas de referencia preparadas en el laboratorio 18
B.4 Cultivos de trabajo 18
Anexo C (informativo) Aseguramiento de la calidad de los medios de cultivo - Tabla de anomalas
20
Anexo D (informativo) Bibliografa 21
Anexo E (informativo) Justificacin de las desviaciones tcnicas y cambios editoriales
Microbiologa de los alimentos para consumo humano y animal - Gua para la preparacin y produccin de medios de cultivo - Parte 1: Directrices generales para el aseguramiento de la calidad para la preparacin de medios de cultivo en el laboratorio
0 Introduccin
En el laboratorio de microbiologa muchos anlisis y procedimientos dependen de que el medio de cultivo sea constante y proporcione resultados reproducibles. Los medios de cultivo se emplean en todas las tcnicas de cultivo tradicionales y tambin en muchas tcnicas alternativas. Numerosas frmulas de medios de cultivo deshidratados estn disponibles comercialmente y muchas ms, destinadas a crecimientos especficos, se encuentran descritas en la literatura. Adicionalmente, en los laboratorios que realizan exmenes microbiolgicos de productos alimenticios, los principales objetivos son el mantenimiento, revivificacin, crecimiento, deteccin y/o recuento de una amplia variedad de microorganismos. Los requisitos que han de reunir los medios son especficos tanto para la muestra como para los organismos que se van a detectar. Los medios de cultivo han de cumplir unos criterios mnimos de rendimiento que constituyen por ello una condicin previa a todo anlisis microbiolgico fiable. Conviene realizar un nmero de anlisis suficiente para demostrar:
i) la aceptabilidad de cada lote de medio;
ii) que el medio es adecuado al objetivo; y
iii) que el medio puede dar resultados constantes.
Estos tres criterios son una parte esencial de los procedimientos de control interno de calidad y, con la documentacin adecuada, permitirn una supervisin eficaz de los medios de cultivo y contribuirn a la obtencin de los datos precisos y fiables. NCh3162 2
1 Alcance y campo de aplicacin
Esta norma proporciona la terminologa general relativa al aseguramiento de la calidad para la preparacin de los medios de cultivo, y especifica los requisitos mnimos de aplicacin en los anlisis microbiolgicos de productos destinados al consumo humano o animal.
Estos requisitos son aplicables a tres categoras de medios de cultivo empleados en los laboratorios que preparan y/o utilizan medios de cultivo para realizar sus anlisis microbiolgicos:
- medios comerciales listos para su empleo;
- medios preparados a partir de frmulas deshidratadas comerciales (sean completos, por ejemplo, agar para recuento en placa, o sean medios base a los que se les aaden suplementos, por ejemplo agar de Baird-Parker);
- medios preparados a partir de sus componentes individuales.
2 Referencias normativas
Los documentos referenciados siguientes son indispensables para la aplicacin de esta norma. Para referencias con fecha, slo se aplica la edicin citada. Para referencias sin fecha se aplica la ltima edicin del documento referenciado (incluyendo cualquier enmienda).
NCh9000.Of2001 ISO 9000:2000 Sistemas de gestin de la calidad - Fundamentos y vocabulario. EN 1659:1996 In vitro diagnostic systems - Culture media for microbiology - Terms and definitions. EN 12322:1999 In vitro diagnostic medical devices - Culture media for microbiology - Performance criteria for culture media.
NOTA EXPLICATIVA NACIONAL
La equivalencia de la norma internacional sealada anteriormente con norma chilena, y su grado de correspondencia es el siguiente:
Norma internacional Norma nacional Grado de correspondencia
ISO 9000:2000 NCh9000.Of.2001 Idntica
NCh3162 3
3 Trminos y definiciones
Para los propsitos de esta norma, se aplican los trminos y definiciones siguientes:
3.1 Generalidades
Esta clusula establece las definiciones generales referentes al aseguramiento de la calidad y proporciona diferentes tipos de terminologa relacionada con los medios de cultivo y los cultivos de control. Las normas citadas entre corchetes indican que el texto dado es idntico a la fuente citada.
3.2 Terminologa de aseguramiento de la calidad
3.2.1 aseguramiento de la calidad: parte de la gestin de la calidad orientada a proporcionar confianza en que se cumplirn los requisitos de la calidad
[NCh-ISO 9000]
3.2.2 control de la calidad: parte de la gestin de la calidad orientada al cumplimiento de los requisitos de la calidad
[NCh-ISO 9000]
3.2.3 control de calidad interno: programa de control continuo de las actividades de un laboratorio preparado por o para l, y basado en los anlisis de control y de seguimiento y sobre las acciones correctivas si fueran necesarias
3.2.4 lote de los medios de cultivo: unidad que permite una trazabilidad completa referida a una cantidad definida de producto a granel, producto semiterminado o producto final, que es coherente en tipo y calidad, y ha cumplido los requisitos de los ensayos de produccin (control durante el proceso) y de garanta de la calidad, y que ha sido producido durante un perodo de produccin definido al que se le ha asignado el mismo nmero de lote
[EN 12322]
3.2.5 rendimiento del medio de cultivo: respuesta de un medio de cultivo sometido a cepas de control bajo condiciones definidas
3.3 Terminologa de los medios de cultivo
3.3.1 medio de cultivo: formulacin de sustancias en forma lquida, semislida o slida, que contienen constituyentes naturales y/o sintticos destinados a facilitar la multiplicacin o a mantener la viabilidad de los microorganismos
NOTA - Cuando se utiliza formando parte de palabras compuetas, este trmino se abrevia a menudo con la palabra medio (por ejemplo, medio de enriquecimiento).
[EN 1659] NCh3162 4
3.3.2 Medios de cultivo clasificados segn su composicin
3.3.2.1 medio de cultivo de composicin qumica definida: medio de cultivo formado nicamente por constituyentes qumicamente definidos (es decir, de estructura molecular y el grado de pureza conocidos)
[EN 1659]
3.3.2.2 medio de cultivo de composicin qumica incompleta: medio de cultivo formado total o parcialmente por materias primas naturales, procesado o de otra manera, cuya composicin qumica no est definida de forma completa
NOTA - Para los diversos componentes no definidos qumicamente empleados en los medios de cultivo, el ISO/TC 34/SC 9 ha establecido una lista armonizada de denominaciones, ver Anexo A.
3.3.3 Medios de cultivo clasificados por su consistencia
3.3.3.1 medio de cultivo quido: medio de cultivo que consiste en una solucin acuosa de uno o ms constituyentes (por ejemplo, agua de peptona, caldo nutritivo)
NOTAS
1) En algunos casos se aaden partculas slidas al medio de cultivo lquido.
2) Los medios lquidos en tubos, matraces o frascos se denominan comnmente caldos.
[EN 1659]
3.3.3.2 medio de cultivo slido y medio de cultivo semislido: medio de cultivo lquido que contiene materiales solidificantes (por ejemplo, agar-agar, gelatina, etc.) en diferentes concentraciones
NOTAS
1) Debido a la utilizacin mundialmente extendida de los medios de cultivo solidificados con agar-agar, se utiliza el trmino abreviado agar de forma sinnima para medios de cultivo slidos y por lo tanto formando parte de otros trminos (por ejemplo, agar para recuento en placa).
2) Los medios de cultivo slidos vertidos en placas de Petri se llaman comnmente placas. Los medios de cultivo slidos vertidos en tubos que se mantienen en posiciones inclinadas mientras se solidifican se denominan a menudo agares inclinados.
[EN 1659]
3.3.4 Medios de cultivo clasificados por el uso al que se destinan
3.3.4.1 medio de transporte: medio de cultivo diseado para conservar y mantener la viabilidad de los microorganismos durante el perodo de tiempo entre el momento del muestreo y el procesamiento de la muestra en el laboratorio
NOTA - Los medios de transporte contienen normalmente sustancias que no permiten la multiplicacin de los microorganismos pero que aseguran su conservacin (por ejemplo, medio de transporte de Stuart o de Amies).
[EN 1659] NCh3162 5
3.3.4.2 medio de conservacin: medio de cultivo diseado para conservar y mantener la viabilidad de los microorganismos durante un perodo de tiempo prolongado, para protegerlos contra las influencias adversas que pueden ocurrir durante su almacenamiento a largo plazo y para permitir su recuperacin despus de este perodo (por ejemplo, medio de huevo de Dorset)
[EN 1659]
3.3.4.3 medio de revivificacin: medio de cultivo que permite a los microorganismos lesionados y daados, reparar y recuperar su capacidad de crecimiento normal, sin promover necesariamente su multiplicacin
[EN 1659]
3.3.4.4 medio de enriquecimiento: medio de cultivo generalmente lquido, que debido a su composicin, proporciona unas condiciones particularmente favorables para la multiplicacin de los microorganismos
[EN 1659]
3.3.4.4.1 medio de enriquecimiento selectivo: medio de enriquecimiento que favorece la multiplicacin de microorganismos especficos mientras que inhibe parcial o totalmente el crecimiento de otros microorganismos (por ejemplo, medio de Rappaport-Vassiliadis)
3.3.4.4.2 medio de enriquecimiento no selectivo: medio de enriquecimiento que favorece el crecimiento de la mayora de los microorganismos (por ejemplo, caldo nutritivo)
3.3.4.5 medio de aislamiento: medio de cultivo slido o semislido que favorece el crecimiento de microorganismos
3.3.4.5.1 medio de aislamiento selectivo: medio de aislamiento que favorece el crecimiento de microorganismos especficos, a la vez que inhibe otros microorganismos (por ejemplo, agar PALCAM, agar MacConkey)
[EN 1659]
3.3.4.5.2 medio de aislamiento no selectivo: medio de aislamiento que no est diseado para la inhibicin selectiva de microorganismo (por ejemplo, agar nutritivo)
[EN 1659]
3.3.4.6 medio diferencial: medio de cultivo que permite el estudio de una o ms caractersticas fisiolgicas/bioqumicas de los microorganismo para su identificacin (por ejemplo, medio de urea, agar de Kligler)
NOTA - Los medios diferenciales que se pueden utilizar como medios de aislamiento se denominan medios de aislamiento/diferencial [por ejemplo, agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)].
[EN 1659] NCh3162 6
3.3.4.7 medio de identificacin: medio de cultivo diseado para producir una reaccin de identificacin especfica que no precisa ningn anlisis posterior de confirmacin
NOTA - Los medios de identificacin que se pueden emplear como medio de aislamiento se denominan medios de aislamiento/identificacin.
[EN 1659]
3.3.4.8 medios para usos mltiples: ciertos medios de cultivo se pueden asignar a varias categoras, por ejemplo, el agar-sangre es un medio de revivificacin segn 3.3.4.3, un medio de aislamiento segn 3.3.4.5, y un medio diferencial segn 3.3.4.6, utilizado para la deteccin de hemlisis
3.3.5 Medios de cultivo clasificados segn el mtodo de preparacin
3.3.5.1 medio listo para su empleo: medio de cultivo que se suministra en recipientes bajo la forma de producto listo para su empleo (por ejemplo, placas de Petri, tubos u otros recipientes)
3.3.5.2 medio de cultivo preparado a partir de frmulas comerciales deshidratadas: medio de cultivo desecado que no est listo para su uso inmediato (por ejemplo, productos en polvo, granulados o liofilizados). La rehidratacin producir uno de los dos tipos de medios siguientes:
- un medio completo listo para su empleo;
- un medio incompleto al cual se aaden componentes lbiles justo antes de su uso.
3.3.5.3 Medio de cultivo preparado en el laboratorio a partir de sus componentes individuales
3.4 Terminologa de los organismos de control
3.4.1 Generalidades
Se trata de microorganismos utilizados generalmente para el control de la calidad y de los anlisis del rendimiento de los medios de cultivo. Se definen segn su origen de la forma siguiente:
3.4.2 cepa de referencia: microorganismo definido al menos a nivel de gnero y especie, catalogado y descrito segn sus caractersticas y preferiblemente indicando su origen
[EN 12322]
3.4.3 cepa de reserva de referencia: lote de cultivos obtenido en el laboratorio por una sola propagacin a partir de una cepa de referencia, ya sea en el laboratorio o desde un proveedor
[EN 12322]
3.4.4 cultivo de trabajo: subcultivo primario de una cepa de reserva de referencia (ver 3.4.3)
NCh3162 7
4 Prcticas para el control de la calidad de los medios de cultivo
4.1 Documentacin
4.1.1 Documentacin requerida desde el fabricante
El fabricante debera suministrar la informacin siguiente:
- nombre del medio, constituyentes individuales y cualquier suplementos, y sus cdigos de productos;
- nmero de lote;
- pH del medio antes de su uso;
- condiciones de almacenamiento y fecha de caducidad;
- cualquier evaluacin de su rendimiento y organismo de control utilizado;
- ficha tcnica;
- certificado de control de la calidad;
- ficha de datos de seguridad y/o peligrosidad, cuando sea necesaria.
4.1.2 Verificacin realizada por el laboratorio
Cuando se recibe el medio, el laboratorio comprueba los datos siguientes:
- nombre del medio y nmero de lote;
- fecha de recepcin;
- fecha de caducidad;
- condiciones e integridad del embalaje.
4.2 Almacenamiento
4.2.1 Generalidades
En todos los casos se seguirn las instrucciones del fabricante, cuando existan, en lo referente a condiciones de almacenamiento, fecha de caducidad y uso. NCh3162 8
4.2.2 Gestin y control de la calidad de medios deshidratados y suplementos
Los medios se adquieren generalmente de fabricantes comerciales. Se suministran en forma de polvo deshidratado o en grnulos en recipientes sellados, y los suplementos de las diferentes sustancias selectivas o de diagnstico se suministran bajo forma liofilizada o lquida. Sin embargo, es conveniente planificar la recepcin para asegurar una rotacin regular de los productos almacenados (es decir, primero que entra primero que sale). Para mantener un inventario eficaz se deberan efectuar verificaciones suplementarias que comprenden:
- una nueva verificacin del sellado;
- fecha de la primera vez que se abre;
- evaluacin visual del contenido de los recipientes abiertos.
La calidad del medio puede depender del ambiente del almacenamiento, especialmente despus de abrir un nuevo recipiente. La prdida de la calidad de los medios deshidratados se manifiesta por un cambio en las caractersticas de flujo del polvo, homogeneidad, apelmazamiento, cambios de color, etc. Se debera desechar todo medio deshidratado que haya absorbido humedad o muestre signos manifiestos de cambio en la apariencia fsica.
4.2.3 Medios comerciales listos para su empleo
Seguir las instrucciones del fabricante en lo referente a las condiciones de almacenamiento, fecha de caducidad y uso.
4.2.4 Medios preparados a partir de frmulas deshidratadas disponibles comercialmente y a partir de componentes individuales bsicos
El tiempo de conservacin de estos tipos de medios es variable. Por ello es difcil establecer lmites de tiempo generales para el almacenamiento de los medios preparados. Las normas internacionales o nacionales especficas pueden estipular las condiciones especficas y el tiempo de conservacin.
Los medios de cultivo esterilizados dispensados en placas, tubos o frascos y los reactivos que no vayan a ser utilizados inmediatamente deben ser protegidos de la luz y de la desecacin.
A menos que se haya establecido una fecha de caducidad validada o est especificado en la norma en cuestin, los medios parcialmente completos estriles, es decir los medios a los cuales los componentes finales se aaden inmediatamente antes de su uso, se deben mantener en refrigerador como mximo tres meses y un mes como mximo a temperatura ambiente, en condiciones que eviten toda modificacin de su composicin. Sin embargo, se recomienda que los medios a los que se les ha aadido suplementos selectivos lbiles sean usados en el mismo da de su preparacin. No es conveniente que los medios slidos que contengan reactivos qumicos y/o sustancias lbiles se almacenen en masa para refundirlos posteriormente. NCh3162 9
Hay que observar cualquier cambio de color, signo de evaporacin/deshidratacin o crecimiento microbiano. Los lotes de medios que presenten tales cambios, no deberan ser usados.
Se recomienda que antes de usar o antes de un calentamiento adicional, la temperatura de los medios de cultivo se equilibre con la temperatura ambiente.
4.3 Preparacin de los medios en el laboratorio
4.3.1 Generalidades
La preparacin precisa de los medios de cultivo es una de las etapas fundamentales en el examen microbiolgico y se le debe dedicar un cuidado especial.
Se han de respetar las buenas prcticas de laboratorio y las instrucciones del fabricante respecto a la manipulacin de los medios deshidratados y otros componentes, particularmente aquellos que contengan materiales peligrosos, es decir sales biliares u otros agentes selectivos.
Cuando los medios se preparan a partir de frmulas deshidratadas comerciales, se seguirn fielmente las instrucciones del fabricante. Hay que documentar todos los datos importantes, es decir peso/volumen, pH, fecha de preparacin, condiciones de esterilizacin, tcnico.
Para los medios preparados a partir de componentes individuales, se seguir fielmente la receta y se registrarn todos los detalles (ver 4.1.2), as como la identificacin completa (es decir cdigo y nmero de lote) de todos los constituyentes utilizados.
4.3.2 Agua
El agua utilizada debe ser destilada o agua de calidad equivalente, es decir libre de sustancias que puedan inhibir o influir en el crecimiento de los microorganismos en las condiciones de anlisis. Si el agua destilada se prepara a partir de agua clorada, neutralizar el cloro antes de la destilacin.
El agua destilada debe ser almacenada en recipientes fabricados preferiblemente de materiales inertes (por ejemplo, vidrio neutro, polietileno, etc.) que deben estar libres de toda sustancia inhibidora antes de ser usados por primera vez.
NOTA - En algunos casos puede ser necesario usar agua recin preparada, libre de dixido de carbono disuelto.
Para que el agua destilada se pueda considerar de buena calidad, debe tener una resistividad de al menos 300 000 cm.
ADVERTENCIA: El agua procesada a travs de un intercambiador de iones (desionizada) puede tener un alto contenido en microorganismos; es por ello recomendable no utilizar este tipo de agua sin haber verificado antes que el contenido de microorganismos en el agua es bajo. Es conveniente consultar al fabricante sobre la mejor manera de minimizar la contaminacin microbiana. El agua desionizada muy contaminada que haya sido esterilizada por filtracin, puede todava contener sustancias inhibidoras para el crecimiento de algunos microorganismos. NCh3162 10
4.3.3 Pesada y rehidratacin
Se pesa cuidadosamente la cantidad apropiada de medio deshidratado (teniendo cuidado de no inhalar polvo, especialmente con medios que contengan sustancias txicas) y se aade progresivamente la cantidad necesaria de agua evitando que se formen grumos.
4.3.4 Disolucin y dispersin
Los medios deshidratados necesitan para su disolucin una dispersin rpida mediante una agitacin inmediata y repetida, seguida por calentamiento si es necesario. Para la disolucin de los medios que contengan agar, es conveniente dejarlos a remojo durante varios minutos antes de calentarlos con agitacin para disolverlos. Para los medios preparados a partir de sus componentes individuales, cada componente se debera aadir separadamente y dejarlo disolver antes de completar el volumen final.
4.3.5 Medida y ajuste de pH
Se mide el pH utilizando un pHmetro y se ajusta si es necesario, es decir para los medios preparados a partir de sus componentes individuales en el laboratorio se ajusta de tal forma que despus de la esterilizacin y enfriamiento a 25C el medio est al pH requerido 0,2 unidades de pH, salvo que se indique otra cosa. El ajuste se realiza normalmente empleando una disolucin de hidrxido sdico (NaOH) de aproximadamente 40 g/L (alrededor de 1 mol/L) o de cido clorhdrico (HCl) de aproximadamente 36,5 g/L (alrededor de 1 mol/L).
NOTA - Los medios de cultivo comerciales pueden mostrar cambios significativos de pH antes y despus de ser sometidos al autoclave. Sin embargo, siempre que se use agua destilada o desionizada de buena calidad, el ajuste del pH antes de introducir en el autoclave no debera ser necesario.
4.3.6 Dispensacin
Se dispensa el medio en recipientes adecuados que tengan un volumen de 1, 2 a 3 veces el del medio.
4.3.7 Esterilizacin
4.3.7.1 Generalidades
La esterilizacin de los medios de cultivo y de los reactivos se puede realizar empleando esterilizacin mediante calor hmedo (ver 4.3.7.2) o esterilizacin mediante filtracin (ver 4.3.7.3).
Ciertos medios no necesitan esterilizacin por autoclave sino que se pueden utilizar despus de haber sido llevados a ebullicin. Por ejemplo, medios para Enterobacteriaceae que contienen verde brillante son particularmente sensibles al calor y a la luz y deberan ser enfriados rpidamente despus de la ebullicin y protegidos de la luz intensa. Igualmente algunos reactivos se pueden usar sin esterilizacin (referirse a la norma apropiada o a las instrucciones del fabricante). NCh3162 11
4.3.7.2 Esterilizacin mediante calor hmedo
La esterilizacin mediante calor hmedo se realiza en autoclave o en un aparato preparador de medios. Generalmente la esterilizacin por autoclave se efecta durante 15 min a 121C. Para volmenes mayores que 1 000 ml, es necesario adaptar el ciclo de esterilizacin. En todos los casos, se seguirn las instrucciones dadas en las normas o las instrucciones de los fabricantes. Es conveniente controlar el funcionamiento del autoclave mediante perfiles de temperatura empleando termopares y papel reactivo bajo condiciones de cargas tpicas para asegurar que las temperaturas deseadas se puedan alcanzar.
NOTA - Se puede producir un sobrecalentamiento cuando se someten al autoclave grandes cantidades de medio (> 1 000 ml).
El control de la eficacia de la esterilizacin es esencial.
Despus del calentamiento del medio, es esencial enfriarlo de manera que se evite que se desborde. Esto es particularmente importante en los medios sensibles como por ejemplo, para las Enterobacteriaceae y para los medios en grandes volmenes.
4.3.7.3 Esterilizacin por filtracin
La esterilizacin por filtracin se puede realizar por vaco o por presin. Se usan membranas o filtros con un dimetro de poro de 0,22 m. Deben haber sido esterilizados en el autoclave. Para el empleo de filtros o membranas que se hayan adquirido estriles, referirse a las instrucciones del fabricante. Los diferentes elementos de los aparatos de filtracin, montados o no, deben ser esterilizados en el autoclave durante 15 min a 121C. Si es necesario, el montaje asptico se puede realizar en una cmara de flujo laminar despus de ser sometidos al autoclave.
NOTA - Algunos filtros de membrana pueden retener protenas (como los antibiticos). A fin de obtener la concentracin adecuada, el usuario debera humedecer previamente el filtro.
4.3.7.4 Monitoreo
Despus de la esterilizacin por autoclave, ebullicin o filtracin, todos los medios se deberan monitorear, en particular en lo referente al pH, color, esterilidad y consistencia.
4.3.8 Preparacin de los suplementos
Los suplementos comerciales que contengan agentes txicos, particularmente antibiticos, deben ser manipulados con cuidado, evitando la dispersin del polvo que podra dar lugar a alergias o a otras reacciones en el personal del laboratorio. Se tomarn las precauciones necesarias y se seguirn las instrucciones del fabricante durante la preparacin de las disoluciones. No se sobrepasar la fecha lmite de conservacin, que es generalmente el mismo da para las disoluciones de trabajo de antibiticos. Bajo ciertas circunstancias, las disoluciones de antibiticos pueden ser almacenadas congeladas en alcuotas apropiadas, pero no se deberan volver a congelar despus de ser descongeladas. La prdida potencial de actividad debido a la congelacin se debera discutir con el fabricante o ser determinada por el usuario. NCh3162 12
4.4 Preparacin para el uso
4.4.1 Fusin de los medios de cultivo con agar
Se funde un medio de cultivo situndolo en un bao de agua hirviendo o por cualquier otro procedimiento que d resultados idnticos (por ejemplo, en autoclave a vapor fluente). Los medios que han sido previamente esterilizados en autoclave deberan ser recalentados durante un tiempo mnimo para mantener la calidad de los medios. Hay que evitar un calentamiento excesivo y retirarlo cuando est fundido. Se enfra el medio fundido a 47C 2C en un bao de agua controlado termostticamente hasta el momento de su empleo. El tiempo necesario para alcanzar los 47C depende del tipo de medio, del volumen y del nmero de recipientes que haya en el bao de agua. Los medios de cultivo refundidos se deberan usar lo ms pronto posible, y se recomienda no conservarlos ms de 4 h.
4.4.2 Desgasificacin de los medios de cultivo
Si es necesario, justo antes de su uso, calentar el medio de cultivo en agua hirviendo o bajo vapor fluente durante 15 min, con tapones flojos; despus del calentamiento, se aprietan los tapones y se enfra rpidamente hasta la temperatura de utilizacin.
4.4.3 Adicin de suplementos
Los suplementos termolbiles se deberan aadir al medio despus de que ste haya sido enfriado a 47C 2C. Los suplementos estriles se deben estabilizar a temperatura ambiente antes de aadirlos al medio de agar. Los lquidos fros pueden hacer que el agar se solidifique o que se formen copos transparentes. Se mezclan con precaucin y completamente todos los suplementos con el medio y despus se transfiere a los recipientes finales lo ms rpidamente posible.
4.4.4 Preparacin y almacenamiento de los medios en placas de Petri
Se vierte el medio de cultivo de agar fundido en placas de Petri de manera que se obtenga un espesor de al menos 2 mm (por ejemplo, para placas de 90 mm de dimetro, se necesitan normalmente 15 ml de agar). Se deja el agar solidificar y enfriar situando las placas de Petri, con las tapas en su lugar, en una superficie fresca y horizontal.
NOTA - Durante la incubacin se produce una prdida de humedad del medio de agar. Una prdida mayor que 15% del contenido en agua puede en algunas circunstancias afectar adversamente al crecimiento de microorganismos. Los factores que influyen en la prdida de agua son la composicin del medio, la cantidad de medio en las placas, el tipo de estufa de incubacin (es decir, con ventilacin o de otro tipo), humedad de la atmsfera en la estufa de incubacin, la posicin y el nmero de placas en la estufa de incubacin y la temperatura de incubacin. NCh3162 13
El medio solidificado se emplea inmediatamente o se conserva en condiciones que eviten toda modificacin de su composicin, es decir en oscuridad y/o en refrigerador entre 4C y 12C en bolsas selladas, durante un tiempo mximo de una semana o lo indicado por el fabricante o la norma especfica. Se etiquetan las placas en la base con la fecha de preparacin y/o la fecha de caducidad y la identificacin del medio. Alternativamente se pueden utilizar sistemas de cdigos que renan estos requisitos.
El tiempo de conservacin de las placas se incrementar si se almacenan en bolsas de plstico selladas. Para evitar que se produzca condensacin, las placas se debern enfriar antes de introducirse en las bolsas. No se deben secar las superficies de las placas de agar antes de almacenarlas en el refrigerador.
En general, para la siembra en superficie de un medio de cultivo slido, se secan las placas, preferiblemente con las tapas retiradas y con la superficie del agar mirando hacia abajo, en una estufa regulada entre 25C y 50C o en una cabina de flujo laminar, hasta la desaparicin de las gotas de la superficie del medio. No se deben secar demasiado. Las placas comerciales listas para su empleo se deberan almacenar y utilizar segn las instrucciones del fabricante.
4.4.5 Incubacin
Apilar las placas en nmero no mayor a seis unidades y dejar espacio para que circule el aire, de tal forma que el medio de cultivo se equilibre con la temperatura de incubacin lo ms rpidamente posible. En el caso de medios lquidos, el tiempo para alcanzar la temperatura de incubacin depende de varios factores, por ejemplo, el volumen, la carga, el recipiente, el tipo de estufa. Si se utilizan jarras de anaerobios puede ser necesario apilar ms de seis placas.
4.5 Eliminacin de los medios
Tanto los medios contaminados como los no utilizados deben ser eliminados de una manera que sea segura y que cumpla las reglamentaciones locales o nacionales.
5 Control de la calidad de los productos finalizados
5.1 Control de la calidad fsico
Los controles de laboratorio deberan incluir como mnimo:
- valor del pH medido entre 20C y 25C;
y mediante observacin:
- cantidad repartida y/o espesor de la capa;
- color; NCh3162 14
- claridad/presencia de defectos pticos;
- estabilidad del gel/consistencia/humedad.
5.2 Control de la calidad microbiolgica
5.2.1 Contaminacin
Una cantidad apropiada de cada lote debera ser analizada para verificar la ausencia de contaminacin.
5.2.2 Cepas de control
Un lote de cepas de control debera contener slo microorganismos con caractersticas estables, que sean representativos de sus especies y que se hayan mostrado fiables para la comprobacin del comportamiento ptimo de un medio en particular preparado en el laboratorio. Las cepas de control deberan incluir principalmente cepas que estn disponibles fcilmente en colecciones de cultivos de referencia, pero tambin se pueden incluir cepas bien caracterizadas aisladas en el laboratorio. Se deberan examinar y registrar en el laboratorio las caractersticas principales de los cultivos de reserva y renovar las cepas si aparecen caractersticas atpicas. Se utilizarn preferentemente cepas de origen alimentario, aunque no todas las colecciones de cultivo suministran este tipo de informacin sobre su origen.
Las cepas de control para cada medio pueden incluir:
- cepas robustas positivas que muestren caractersticas tpicas;
- cepas positivas que crecen dbilmente (es decir de una naturaleza ms sensible);
- cepas bioqumicamente no reactivas, por ejemplo, aquellas que muestren reacciones diferentes de fermentacin o de fluorescencia;
- cepas completamente inhibidas.
NOTA - El grupo de trabajo sobre medios de cultivo (WPCM) del International Committee for Food Microbiolgoy and Hygiene ha recomendado una coleccin validada de cepas de control para la evaluacin de los medios (ver Anexo D, [1]).
5.2.3 Medios y reactivos listos para su uso
Los fabricantes de medios comerciales listos para su uso, particularmente si estn certificados segn ISO 9001 (ver Anexo D, [2]), tendrn un programa de calidad en funcionamiento y pueden acompaar los medios que suministren con un certificado de calidad. Bajo estas condiciones el usuario puede no necesitar realizar pruebas extensas de dichos medios, pero se debera asegurar que las condiciones de conservacin establecidas se mantengan. NCh3162 15
5.2.4 Medios preparados a partir de formulaciones deshidratadas disponibles comercialmente
Para los propsitos de esta norma, las exigencias mnimas son unas pruebas cualitativas para cada lote del medio preparado, pero cuando se van a realizar exmenes cuantitativos de muestras, las pruebas cuantitativas de cada lote darn una mayor seguridad de la calidad de los medios. Para aquellos medios que no contienen indicadores o agentes selectivos, es suficiente el uso de una sola cepa de control positiva. Para aquellos medios que contienen indicadores o agentes selectivos, se deben utilizar cepas que demuestren la funcin del (de los) indicador(es) y la selectividad. Para los medios complejos, es decir con suplementos adicionados, cada lote se debera verificar con cepas con las caractersticas indicadas en 5.2.2. Lo mismo se aplica al caso de los medios listos para su uso a los cuales se han adicionado suplementos preparados en el laboratorio.
5.2.5 Medios preparados a partir de componentes bsicos individuales
Se recomienda que adems de las pruebas cualitativas descritas en 5.2.4 se realicen algunas pruebas cuantitativas utilizando tcnicas como la de Miles & Misra modificada (ver Anexo D, [1]) o siembra en espiral, para evaluar as la calidad de los componentes de base, la productividad del medio y los procedimientos internos de elaboracin en el laboratorio.
NOTA - Estas son directrices mnimas, pero en la prctica los alimentos pueden contener microorganismos lesionados. Se debera tener en cuenta la capacidad del medio respecto a la recuperacin de las clulas lesionadas. Para informacin sobre las tcnicas de conservacin, mantenimiento y sobre las colecciones de cultivos de referencia, ver Anexo B. NCh3162 16
Anexo A (Informativo)
Denominacin de los componentes de los medios de cultivo en las normas de anlisis microbiolgico de los alimentos para consumo humano y animal
A.1 Generalidades
Con el fin de armonizar la descripcin de los diferentes componentes en la composicin de los medios de cultivo en los mtodos microbiolgicos normalizados, el ISO/TC 34/SC 9 Productos agrcolas y alimenticios - Microbiologa decidi las denominaciones para las categoras de los componentes designados en clusulas A.2 a A.5.
A.2 Peptonas
- digerido enzimtico de casena 1) ;
- digerido enzimtico de harina de soja;
- digerido enzimtico de tejidos animales 2) ;
- digerido enzimtico de corazn;
- digerido enzimtico de gelatina;
- digerido enzimtico de tejidos de animales y plantas.
A.3 Extractos
- extracto de carne;
- extracto de cerebro-corazn;
- extracto de levadura;
- bilis de buey para uso bacteriolgico;
- sales biliares;
- sales biliares N 3.
1) Incluye digerido pptico de casena, digerido trptico de casena y triptona.
2) Incluye peptona de carne, digerido pptico de carne, digerido pancretico de carne. NCh3162 17
A.4 Agar
- agar bacteriolgico.
A.5 Otros
- emulsin de yema de huevo;
- leche descremada en polvo;
- hidrolizado cido de casena.
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Anexo B (Informativo)
Gua para la conservacin y mantenimiento de cepas de control
B.1 Generalidades
Para la conservacin y el mantenimiento eficaz de todos los microorganismos de inters en microbiologa de los alimentos hay varios mtodos disponibles, como la liofilizacin, conservacin en bolitas a -70C o empleando nitrgeno lquido. Un mtodo puede no ser apropiado para todas las cepas.
Estas directrices de conservacin se presentan en Figura B.1.
B.2 Cepas de referencia de origen comercial
Si las cepas de referencia procedentes de colecciones de referencia o de proveedores comerciales aprobados segn ISO 9001 (ver Anexo D, [2]), se adquieren y mantienen en sus recipientes originales, se deben seguir las instrucciones de los fabricantes para su cultivo y utilizacin.
B.3 Reserva de cepas de referencia preparadas en el laboratorio
Los cultivos de reserva de cepas de referencia (ver clusula B.2) para el control de calidad y para ensayos de rendimiento, se deben mantener y manipular de manera que se reduzca al mnimo la posibilidad de contaminacin cruzada, mutacin o alteracin de las caractersticas tpicas. Las reservas de cepas de referencia se deberan almacenar en mltiples alcuotas ya sea ultracongeladas (-70C) o liofilizadas. Se debera documentar exhaustivamente las caractersticas de crecimiento para cada uno de los medios sobre/en los que sern utilizadas como cepas de control.
B.4 Cultivos de trabajo
Los cultivos de trabajo se preparan a partir de las reservas de cepas de referencia liofilizadas o ultracongeladas (ver clusula B.3). Las alcuotas deben ser manejadas de tal manera que se evite la posible contaminacin cruzada de la cepa de reserva de referencia y/o su deterioro. Los cultivos de trabajo se deberan preparar resuspendiendo una alcuota de la cepa de reserva de referencia en un medio de crecimiento no selectivo e incubndolo hasta obtener una fase de cultivo estacionaria.
En el caso de sistemas de conservacin comerciales, las instrucciones del fabricante se deben seguir rigurosamente. NCh3162 19
NOTA - No se deberan realizar subcultivos a partir de cultivos de trabajo. Sin embargo, los cultivos de trabajo se puede utilizar ms de una vez, siempre que sean manipulados y conservados adecuadamente, es decir evitando las contaminaciones cruzadas y/o su deterioro, y nunca durante ms de una semana.
Cepa de referencia
Obtenida de una coleccin de cultivos de referencia, liofilizada y al vaco; o un organismo definido al menos al nivel de gnero y especie, altamente caracterizado y de origen conocido
Cepa de reserva de referencia
Una serie de alcuotas de cultivos idnticos obtenidos en el laboratorio de un subcultivo nico de la cepa de referencia
Cultivo de trabajo
Un subcultivo primario a partir de una alcuota de la cepa de reserva de referencia
Figura B.1
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Anexo C (Informativo)
Aseguramiento de la calidad de los medios de cultivo - Tabla de anomalas
Anomalas Razones posibles No se solidifica el medio de agar Sobrecalentamiento del medio durante su preparacin pH bajo que produce una hidrlisis cida Pesada incorrecta del agar utilizado Agar no disuelto totalmente Mala mezcla de los ingredientes pH incorrecto Sobrecalentamiento del medio durante su preparacin Mala calidad del agua Contaminacin qumica externa Medicin del pH a temperatura inadecuada Calibracin incorrecta del pHmetro Mala calidad del medio deshidratado Color anormal Sobrecalentamiento del medio durante su preparacin Mala calidad del agua Mala calidad del medio deshidratado pH incorrecto Contaminacin externa Formacin de precipitados Sobrecalentamiento del medio durante su preparacin Mala calidad del agua Mala calidad del medio deshidratado Control del pH inadecuado Medio inhibidor/baja productividad Sobrecalentamiento del medio durante su preparacin Mala calidad del medio deshidratado Mala calidad del agua Uso de una formulacin incorrecta, por ejemplo, ingredientes que no se han pesado correctamente, suplementos adicionados a concentracin errnea Dbil selectividad Sobrecalentamiento del medio durante su preparacin Mala calidad del medio deshidratado Uso de una formulacin incorrecta Suplementos mal adicionados, por ejemplo, cuando el medio est demasiado caliente o adicionados a concentracin errnea NCh3162 21
Anexo D (Informativo)
Bibliografa
[1] Culture media for Food Microbiology - Progress in Industrial Microbiology, Vol. 34 (1995). Eds. Corry J.E.L., Curtis, G.D.W. and Baird, R.M. Elsevier, Amsterdam.
[2] NCh9001.Of2001 ISO 9001:2000 Sistemas de gestin de la calidad - Requisitos.
NOTA EXPLICATIVA NACIONAL
La equivalencia de la norma internacional sealada anteriormente con norma chilena, y su grado de correspondencia es el siguiente:
Norma internacional Norma nacional Grado de correspondencia
ISO 9001:2000 NCh9001.Of.2001 Idntica
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Anexo E (Informativo)
Justificacin de las desviaciones tcnicas y cambios editoriales
Tabla E.1 Desviaciones tcnicas
Clusula/Subclusula Desviaciones tcnicas Justificacin 3.2.1 Se reemplaza la definicin por la contenida en NCh9000.Of2001 - ISO 9000:2000 Actualizar definicin 3.2.2 Se reemplaza la definicin por la contenida en NCh9000.Of2001 - ISO 9000:2000 Actualizar definicin 5.2.3; B.2; Anexo D Se elimina la referencia a ISO 9002 Norma anulada
Tabla E.2 Cambios editoriales
Clusula/Subclusula Cambios editoriales Justificacin 5.2.4 Se reemplaza esta parte de la norma ENV ISO/TR 11133-1 por esta norma La norma es de alcance nacional