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CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE - HPLC

Introduction 1 Appareillage
1.1 Rservoir de PM 1.2 Pompe 1.3 Dispositif dinjection 1.4 Les colonnes 1.5 La phase stationnaire 1.6 Les dtecteurs 1/Spectrophotomtrique +++ 2/Fluorimtrique 3/Rfractometre 4/Condutimtre 5/Electrochimique 6/SM

2 Diffrents types de chromatographie liquide

2.1 Chromatographie dadsorption (S/L) 2.2 Chromatographie de partage (L/L) +++ En phase normale En phase inverse 2.3 Chromatographie par changes dion 2.4 Chromatographie par appariements dions ou paire dions 2.5 Chromatographie dexclusion-diffusion 2.6 Chromatographie daffinit

3 Choix dune mthode chromatographique

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1 Appareillage
2 grands type dappareillage : o La chromatographie Classique : Granulomtrie > 10m Appareillage simple :Tube en verre avec plaque en verre fritt la base ou tampon de coton substances descendent le long de la colonne selon affinit recueil de lluat par petites fractions Mais : peu sensible long peu danalyse de trace ou dosage o La chromatographie haute performance (HPLC) Granulomtrie entre 2-10 m Meilleure efficacit et rsolution Trs utilis +++

Structure gnrale dun HPLC :

A : rservoir de PM B : Vanne lectro magntique de mlange des PM C : Pompe D : Egaliseur de pression E : Chambre de mlange F : Injecteur G : colonne H : Unit HPLC I : Dtecteur J : Interface PC

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1.1 Rservoir de PM
Flacon tanche (1 2L) Parfois fois munis dun syst de dgazage (vite bulles dair) Diffrents modes : o mode isocratique = PM de compo cte au cours lextraction (analyse possible avec 1 seul rservoir) o mode programmation de solvant (+ cplxe) =gradient de polarit (ncessite pls rservoirs)

NB : les appareils pouvant travailler en prog peuvent travailler en isocratique mais ce nest pas rciproque

1.2 Pompe
Fonctionne / piston alternatif (svt pls pistons) Assure un dbit cst Appareil gradient de polarit : o syst de vannes EM proportionnelles qui permet les mlanges des solvants en amont dune pompe unique (ces vannes souvrent en tps proportionnel) Qualits : -pas de pulsation -rsiste la corrosion -dbit constant

Schma Huguette gradient de PM

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Section 2 item 5 1.3 Dispositif dinjection

Injection manuelle ou automatique avec un passeur dech P leve en tte de colonne dc impossible dinjecter la seringue comme en CPG Syst dinjection particulier Injecteur boucle : o vanne boucle dchantillonnage ,command manuellement o Vol : 1 100l o Assure des injections trs rptables o Ces boucles ont des volumes variables o La boucle peut tre mise en communication par des vannes avec le rservoir de m et la colonne

Remplissage de la boucle P atm Le trop plein est rejet vers lext Pdt cette tape , la m circule en permanence sur la colonne. Puis injection du contenu de la boucle en tournant la vanne dinjection ,la m est mise en communication avec la boucle et la colonne

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Section 2 item 5 1.4 Les colonnes

Tubes droits en acier inoxydable 5 30 cm de long 3 4.6 mm de interne (auj ,en a de 2 mm) qlq fois , on place en amont une colonne de garde =petite colonne courte (1 2 cm ) remplit avec la mme s que la colonne analytique

1.5 La phase stationnaire (voir type de chromato correspondante)

Situe dans la colonne 2 types de PS : o PS imprgnes : Phase solide de silice retenant sa surface les composs Surtt utilis en chromato dadsorption (S/L) o PS greffes +++ Formes par formation de liaisons covalentes entre les gpt silanols de la silice et des molcules organiques de nature varies Le plus courant = dimthylchlorosilane Les carac de la PS greffe sont dtermines par la nature du gt grffs Mais 50 des silanols ne seront pas greffes (encombrement strique) Pics dyssymtrique Bonne efficacit, mais utilisable quentre ph2 et 8

Constitue de grains de 3 10m de de nature poreuse Cette s dpd des sparation raliser -silice -silice greffe de gpmts polaires ou apolaires ,changeur dion ou gel -zirconium (moins bonne efficacit mais utilisable entre pH1 et 12) Cette s est retenue ds colonne par des disques poreux (fritts ) aux 2 extrmits de la colonne

1.6 Les dtecteurs

Doit fournir une rponse qui reflte en continu les variations de compo de lluat la sortie Choix en fct des composs analyser Qualits requises : o linaire = rponses proportionnelles la conc chaque instant o sensible o rponse rapide, reproductible, et stable ds le tps o peu de bruit de fond (variation alatoire de la ligne de base) o limite de dtection faible compatible vec les rsultats attendus o Volume mort le plus rduit possible a- spectrophotomtrie +++ Le + courant pour les composs qui absorbent ds UV-visible (doubles liaisons) o soit directement (si gpt chromophore) o soit aprs drivation soit pr colonne soit post colonne on mesure labsorbance 1 ou pls La m ne doit pas absorber cette Ces dtecteurs peuvent tre ut en gradient dlution Rgi par la loi de Beer-Lambert : A=LC

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NB : 2 substances des conc tes peuvent donner une mme auteur de pic (dpd ) a-1. dtecteur monochromatique (spectrophotomtrie) source UV-visible syst monochromateur ( max) L=trajet optique de la cuve (c* circulation)=m dtecteur (photomultiplicateur ou photodiode) permet analyse quantitative chromatogramme choisie ne permet pas de trac spectre instantanment ,trac point point :1Aire 1 ,2aire 2... le spectre enregistr est celui ds la l cd identique celui pris en dissolvant lech ds m

a-2. dtection polychromatique (dtecteur barrette de diodes) permet enregistrer les signaux ttes les instantanment source polychromatique traverse c* de mesure en permanence absorbe +/- en fct des proprits la sortie , rseau (polychromatique ) qui disperse les l intensit chaque est enregistre sur une barrette de diode chaque diode enregistre ds un petit domaine de info en 3D A en fct du tps et en fct de A=f(T)spectre du compos au tps T (qualitative) A=f(t) donne chromatogramme info qualitative (spectre) et quantitative (calcul des aires) b- spectrofluorimtrie substances fluorescentes (directement ou aprs transformation chimique) =m* planes ,rigides doubles liaisons conjugues me I=Kc analyse quantitative (cf. fluorimtrie 2 anne) Source UV excitation slectionne / filtre ou monochromateur c* la sortie de la colonne dmission (filtre) photomultiplicateur Avantages : -trs sensible -trs slectif

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peu ut ds analyse pharma , srtt en analyse bio et en analyse environnementale aprs transformation en gnral (seulement 5% des substances sont fluorescentes) c- dtecteur rfractomtrique bas sur mesure en continue de lindice de rfraction de lluant rponse base sur la ce dindice de rfraction vs luant (n) et m (no) dtecteur universel :rpond ts les composs ) peu sensible non utilisable en gradient dlution (variation de lIr (indice de rfraction) de la m trs sensible aux variations de T (fluctuation de la rponse assez peu ut (srtt substance qui nabsorbent pas ds UV ) analyse des sucres d- dtecteur conductimtrique bas sur la conductivit des ions proportionnelle leur conc analyse des ions e- dtecteur lectrochimique bas sur la prop dun compos tre oxyd ou rduit par une lectrode porte un potentiel donn trs dlicat employer ut pour analyse des catcholamines : absorbent peu ds UV facilement oxydables llectrode f- spectromtrie de masse permet didentifier compos par leur spectres de masse ,coteux mais trs sensibles ut en pharmacocintique pour identifier mtabolites ut ds centres de recherche pour identifier les impurets

g- Autres -IR -Radioactivit -Polarimtrie -chimioluminescence

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2 Diffrents types de chromatographie

2.1 Chromatographie dadsorption
Ce mode de chromatographie met en jeu un mcanisme d'adsorption du solut sur la phase stationnaire solide et un mcanisme d'lution (dsorption) par la phase mobile (luant). Adsorption = Solide liquide PS = silice (alumine + rarement) =a bsorbant (solide) SiO2caractre acide trs polaire Ut pour trait compos caractre basique Gel de silice ,rseau 3D 3 types de sites : o silanols (OH) libres o silanols lis /LH o ponts siloxanes o silanols libres hydrats o gel de silice fortement hydrats les sites actifs qui ragissent sont les silanols libres et silanols libres faiblement hydrats et lis /LH selon ltat dhydratation de la silice ,les sites sont bloqus la surf , compet vs m* de solut et m* de solvant de la m ce sont les soluts polaires qui vont se fixer solvant site

solut

SA Surf de silice a- Mca dadsorption (compet sur SA) ou partage vs eau fixe sur site et m chroma de partage la fixation se fait avec nergie dadsorption forte des composs polaires sur les sites actifs silanols libres (- forte sur silanols lis ,libres avec une m* dH2O) cest leau qui contrle lactivit de ces SA b- Rtention et rgle dlution Rtention fct : o du solut : nrj dadsorption des gpmts fonctionnels encombrement strique o de ladsorbant : surf spcifique granulomtrie porosit teneur en eau (activit) du solvant : forme luante :solvants classs daprs leur force dlution vis vis de la s elle suit la polarit pour la chromato dadsorption

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solvant faible :dplacement difficile du solut fix sur SA solvant fort : dplacement facile

srie luotrope : solvant classs du moins polaire au + polaire ,mme ordre pour silice et alumine f ther de ptrole (le = faible) hexane THF Ethanol Mthanol Eau (le + fort) F Chromato dadsorption PM peu ou moyennement polaire = mlange de solvants miscibles + acide ou base (silice 2<pH m<8.5) ajout acide pour obtenir forme m* non ionis + base ou alcalode

force luante croissante sur silice et alumine

Ex : -R COOH -R NH2

rgle dlution : -silice = polaire substances polaires les + retenues caractre polaire de m (ex :ajout H2O) rtention c- Optimisation de la slectivit de la PM Optimiser la force luante o o la capacit de la PM changer na rien voir avec force de lluant capacit vv PS o des solvants ou mlange ayant mme force luante peuvent avoir 1 slectivit te (interaction tes) slectivit : fct de la nature des solvants qui rent par leur capacit o accepteur de protons Xe o donneur de protons Xd o caractre dipolaire Xn Classement des solvants en fct de leur polarit triangle de slectivit de Snyder : o 8 groupes de solvants Ds 1 mme gpe les solvants ont mme caractre o tt solvant un certain % Xe ,Xd ,Xn o =100%

Schma snyder

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Ex : o o o Chloroforme = gpe 8 Et Acide tertiobutylique gpe 3 Ont la mme force luante mais une slectivit te car ds gpes opposs ,interactions polaires tes 25% Xe 56% Xe 41% Xd 33% Xn 20% Xd 24% Xn

Chloroforme ac. Tertio butylique

P = polarit mlange solvant = (P solvant x fraction volumique solvant) P ther hexane (52.48 ;v/v) =2.8 x 0.52 + 0 x 0.48 = 1.46 mlange chloroforme (P=4.1)-hexane(36.6 ;v/v) mme P (1.4) mais P mesure le pouvoir de solvatation dun solvant et se compose de 3 paramtres Xe ,Xd ,Xn Dmarche ds optimisation : o au dbut : solvant S polaire + solvant P ngligeable (type hexane) dont on fait varier le % pour assurer une rtention des composs convenable o on calcule P de cette m o si insuffisant ,on remplace S par un autre solvant S de prop tes de S (loign de S ds triangle) en gardant le mme P

NB : important : la valeur de P utilise ici nest valable que pour la chromato dadsorption Elle varie si s nest pas polaire Pb avec silice : -sparation peu reproductible si teneur en eau non contrle -inutilisable en gradient de polarit -ut limite en CLHP sur colonne

2.2 Chromatographie de partage

Partage = liq-liq Mcanisme de partage entre solvants que constituent respectivement par la PS et la PM. La PS peut tre constitue par un film liquide (non miscible avec la phase mobile bien sr) imprgn sur un support rigide (silice) ou fix par liaison covalente (phases greffes++).

PS = silice dont la surf a t modifie par greffage covalent (prsence de silanols rsiduels ) fig 17 18 CH3 CH3 SiOH = Cl-Si-R Si O Si R CH3 CH3 o R polaire : fct diols ,phnyle ,amine ,nitrile o R apolaire : chane alkyle C8 ,en C18 , phnyle + chane apolaire longue + silice greffe a caractre apolaire greffage nest jamais une raction totale silanols non grffs phno dadsorption srtt pour compos basique pour lim trane de pics , ractif pour cacher ces sylanols rsidu endcapping =recouvrement les silices greffes ne sont ut en gnral qu pH 2.5 et 8 : o pH acide : hydrolyse de la chane o pH alcalin ,la silice se dissout o actuellement des silices qui peuvent rsister des pH acide v Si R polaire et m polaire que s chromato de partage en normale (NP) v Si R apolaire et m + polaire chromato de partage polarit de invers (RP =reverse )

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Rtention en chromato de partage fct : o Du solut o De la s (polarit) o Du solvant (polarit Une bonne phase mobile doit avoir 2 proprits : o Une force luante telle que le facteurs de capacit des soluts soit compris entre 2 et 5 pour un mlange simple, 0,5 et 20 pour un mlange complexe o Une bonne slectivit pour le couple le plus difficile sparer. 2.2.1 En phase normale a) rtention et rgle dlution substance P les + retenues (idem chromato dadsorption sur silice P) PS = polaire PM : o solvant apolaire (Hexane ,heptane ,cyclohexane ,isoctane) o + solvant peu polaire ou polaire (= modificateur polaire = chloroforme ,dichloromthane ,THF ,thanol ,ACN ) pour rgler force luante la teneur en solvant polaire augmente en mme temps que la force luante de la PM rgle dlution #silice : de caractre polaire de m rtention Plus un compos sera polaire, plus il sera retenu, plus, il sortira tard. eau = solvant le + fort Force luante = Eau > MeOH > ACN > THF b) mcanisme de partage on suppose que sur silice greffes aminopropyles que le solvant le + polaire de la m solvate les greffons polaires aminopropyles qd injecte solut ,il se partage vs greffon solvat/m =partage liq/liq du solut S :greffon solvat/m c) Optimisation de la slectivit de la PM idem chromato dadsorption dmarche : mel solvant polaire avec solvant dpourvu de force luante (polarit ngligeable)

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2.2.2 Polarit de phase inverse a) rtention et rgle dlution les substances les + apolaires sont mieux retenues PS = apolaire ou peu polaire (greffon R = polaire) PM = moyennement polaire ou polaire (+ polaire que s) o Mlange dun solvant polaire auquel on ajoute un solvant polaire qui rgle llution (on lappelle modificateur organique) o mlange ACN (actonitrile) et/ou MeOH (THF qlq fois ut) + eau ou tampon Valeurs de P redfinies : o THF o ACN o Mthanol o Eau P=4.5 P=3.2 P=2.6 P=0

Plus un compos sera apolaire, plus il sera retenu, plus, il sortira tard. Force luante = THF > ACN > MeOH > eau b) mcanisme de partage L-L

2 thories proposes sur silice greffe alkyle : o partage du solut le polaire de la PM avec le greffon solvat /m o adsorption du solvant le polaire sur le greffon assimile un liq par effet hydrophobe partage des soluts entre la PM et la phase liquide adsorbe solvant le polaire de la m greffon C18 solut greffon C18

silice

c) Optimisation de la slectivit de la PM Triangle de Snyder 4 solvants peuvent tre ut : o eau o mthanol o ACN o THF Solvant slectifs par chromato dadsorption (+ au centre du triangle) Dmarche ds optimisation : o Au dbut ,par ex : MeOH + eau (ou tampon) dont on fait varier le % pour assurer une rtention des composs convenable o Calcul de P o Si slectivit insuffisante ,on remplace MeOH /ACN (prop te du MeOH ,en gardant le mme P4 rle important du pH de la PM (tampon) pour composs ionisables : o + compos ionis + lution rapide o si pH auquel recul dionisation rtention

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Section 2 item 5 2.3 Chromatographie par changes dion

chromatographi des substances ionises(minraux) ou ionisables en fct du pH (mocules organiques). PS = rsine changeuse dion PM = tampon ionique = acide ou base forte dtecteur = dtecteur conductimtrique Mca : equilibre dchange dions

PS : support + gpmt fctnel + contres ions SO2Silice ou polystyrne N OH- mobile changeur danions H+ mobile changeur de cations

Contre ions mobiles peuvent tre ech avec ions de mme signe de la solution Echangeur : fort ,faible (taux dionisation varie en fct du pH) Capacit dchange : (meq/g ou eq/g) o =nbre dions qui peuvent tre ch / unit de poids de rsine sche o Caractristiques dun changeur o Varie en fct : du nbre de gpmts fixs de la force des gpmts du pH (pour les changeurs faibles) o elle affecte la rtention des soluts (+ capacit grande + rtention ) a) nature et structure des echangeurs dions (PS) : Gpmts fonctionnels : o changeur de cation : fort = sulfonique faible = carboxylique o changeur danions : fort = ammonium IV : faible = amine I :

nRSO3- H+ nRCO2- H+ nR N+(CH3)3 nR NH3+ OHOH-

changeurs plurifonctionnel :pls types de gpmts

Support : o rsine de structure gel : grains trs fins de co-polymre styrne-divinylbenzne DVB + greffs gpmts fctnels rseau Mm* degr de rticulation avec % DVB (tx de pontage X) + maille du rseau petites m* volumineuse bloques rsistance mca mdiocre : avec X cintique dech lente (pics larges)ut granulomtrie assez fine (m) capacit dech lev chromato prparative sep fraction pure 2<pH<13=avantage o microparticules de silice : greffes de gpmts Vb + greffe gpmts fctnels

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trs bonne rsistance mcaut en HPLC capacit dech leve chroma prparativ trs gde surf de contact do eq rapides (pics troits) 2<pH<8.5

o changeur pelliculaire : billes de verre (30 50m ) + pellicules de rsine (1 2m) portant les gpmts changeurs bonne rsistance mca (HPLC) ,dc poss davoir des taux de pontage faibles ,dc mailles de rseau assez grosses analyse espces volumineuses faible capacit dech pas de chromato prparative ,slmt analytique cintique dech rapide do bonne effi 2<pH<13 b) Mca de sparation Mcanisme principal = echange dions : o 1/ solvatation des gpmts fonctionnels /H2O : gonflement en prsence deau de la m o 2/ ionisation des gpmts fonctionnels (dpd du pH de la m pour changeurs faibles types carboxylique)

si degr de rticulation lev , peu dech deau Les mcanimes : o principalech ions changeurs /ions de la sol m irrversible/lavage de la rsine o II partage (effet Donnan) ; rversible par lavage de la rsine que m* soient charges ou non changeur de cations : SO3SO3H+ H+ M^n+ M^n+
2-

ordre dcroissant daffinit : Citrate > SO4 > oxalate > NO3-> Cl > formiate > actate > OH > F changeur danions : N+ N+ OHOH A^nA^nsolution
4+

Ordre dcroissant daffinit : Ba+ > Pb+ > Ca+ > Cu2+ > Mg+ > K+ > NH n R N+ (CH3)3 OH- + A^n 1/K n R-N+(CH3)3 + n OH-

>Na+ > H+ > Li+

Equilibre rgit par une cste dech K change charge charge ,respectant llectroneutralit soit A lion fix sur R et B lion apport par lech ds m K As + Br

Ar + Bs

K(A/B) = As x Br / Ar x Bs Br/Bs=Pb=coeffts Pa coefficient de partage ionique r/s ??????

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K(A/B)=PB / PA PB>PA B a + daffinit por la rsine que A Mcanisme II = Partage (Effet Donnan) : o Partage des m* quelles soient charges ou non o solut non charg pntre ds rsine jusqu eq o solut charg pntre ds rsine ,quil soit changeable ou non o degr de pntration = fct de nature de la rsine et de lionisation du solut

ex : sur rsine sulfonique R OS3H+ H+ ClSO3H+ H2SO4 et CH3COOH SO3H+ Signal SO4CH3COOTps c) Rgles de lchange Affinit de lion pour la rsine dpd de : o charge de lion affinit avec charge o taille de lion solvat affinit qd taille SO4CH3COOCl-

Ba+ > Pb+ > Ca+ Mg+ > K+ > NH4+ >Na+ > H+ > Li+ (sels de K+ + luant que Na+) Dplacement des equilibre en : o conc de A ds m o modifiant PB et PA en modifiant m (pH ,force ionique ,addition agent complexant) d) Choix des cdt opratoires et optimisation Choix de lchangeur : o nature o granulomtrie 75 150 m o CLHP <20m Choix de la m : o tampon aqueux maintient du pH (tampon citrate, phosphate/acide et ammoniaq/basiq) o nature de lion dveloppeur o pH (slectivit) gnralement proche des pK des soluts o force ionique Choix du procd de sparation : o sparation prparative : gdes qtit de prod sep / rsine

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analyse par dplacement des ions fixs sur R /ions de la m qui ont + daffinit pour R que les ions sep

ex : sparation Na+ (NaCl) et K+ (KCl) sur RSO3H : o m CaCl2 o Ca+>K+>Na+ : ech rapide car bcp daffinit o Espces conc la sortie ,sortent ssf de bandes

chromato analytique :espce sparer en petite qtit par rapport qtit de rsine de s -analyse par lution (fig 21) :ions de lech fixs sur R lus par des ions de la m qui ont une affinit moins importante pour R -sparation Na+ (NaCl) et K+ (KCl) sur RSO3H ,m HCL K+>Na+ >H+ -change lent car peu daffinit espces dilues la sortie ,sortent ssf de pics NB : si T augmente efficacit augmente (max 50-80C) d- application de la chromato par ech dions ,ionique Purification de leau :

eau purifie pharmacope =eau dionise eau mixte :cation fort (forme H+ ) et anion fort (forme OHSO3SO3N+ N+ H+ H+ OHOH Ca+ Ca+ ClCl-

Leau ctt par ex :CaCl2 ,MgCl2 ,NaCl Ca+ ech vs 2H+ 2Cl- ech vs 2OHH2O passage sur charbon actif leau distille aprs passge sur rsine est trs charge en composs organique Sparation daa (impossible par CPG)

aa= substance amphotre ,3 formes possibles en fct du pH R-CH-COOH NH3+ A R-CH-COO R-CH-COONH3+ NH2 Zwitterion=forme neutre B C

pH

Echangeur de cation + gradient de pH m dpart :fixation de ts les aa pH acide ,forme A puis lentement pH lution des aa ssf de zwitterion ordre dlution suit pKa les + acides (pKa les + fble) sortent en 1ers En ralit , modif de lordre dlution cause de leffet Doman prendre ech danion et commencer pH alcalin

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Conc des ions

intrt : eaux radioactives conc en ions des ions faible conc peuvent tre luer avec un faible volume de Fm Prparation dchantillon en vue de leur dosage

analyse Ca+ en prsence de PO4^ 3- difficile CaPO4=compos rfractaire On fixe PO43- sur changeur danion et recueil Ca+ ds lluant On peut fixer Ca+ sur changeur de cation et lim PO4^3Puis lution Ca+ / acide nitrique par ex Chromato ionique

colonne dech dions analyse avec dtection conductimtrique (srtt anions) ions minraux en hydrologie ions organiques (acide organiques ds vins) pour analyse des cations (Ca+ )spectro atomique Na+ ,K+ srtt PF

2.4 Chromatographie par appariements dions ou paires dion

Sparation des substances ionises ou ionisables en fct du pH Appareillage classique (cf. HPLC) PS = silice greffe alkyle (C8 ou C18) PM = ACN ou MeOH ,eau ou tampon + contre ions () longue chane Contre ions les + ut : o Dosage cations : 3 composs anioniques CH3-(CH2)n-SO H+ o Dosage anions : hydroxyde de terbutyl ou tetrapropyl ammonium + + (C4H9)4-N OH / (C3H7)4-N OH travail tjrs avec PM dont le pH assure lionisation du compos analyser

a) Mcanisme A la fois change dions et partage : CE CS+ S+

ech dions + Partage

lech dions , le contre ion se fixe sur partie apolaire sur alkyle de la m et fonctionne comme ech dion Partage :la paire dion hydrophobe prform ds m fixe greffon sur partie apolaire partage vs greffon et m (liq-liq)

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b) rgles dlution Rtention suit rgles de chromato polarit de invers : o avec du % en solvant organique de m o avec le % en eau de la m Rtention dpd pH de la m : o si pH o solut est fortement ionis ,paire dions favorise et rtention te Rtention avec : o conc en contre ion ds m o caractre hydrophobe de la chane du contre ion

2.5 Chromatographie dexclusion sur gel

m* separe par taille et non par phno daffinit car indpdt de la nature du solvants (seulement vhicule ) =filtration de gel qd support hydrophile (sep P*) =permation de gel qd support caractre hydrophobe (organique) PS = gel ,struct~tamis criblage /taille PM = solvants induit le gonflement de la PS et dissout lech. o Eau pour les gels hydrophiles o Solvant organiques (chloroforme, DMF) si gel hydrophobe PS = gel = milieu daspect homogne form : o dune solide disperse : constitue de petite particule calibre = grains poreux chaque grain rsulte de liaison de Macrom* assemble pour former un rseau caractris /sa porosit + rseau dense + pores petits o dune aqueuse dispersante : eau ou sel minraux (gel hydrophile )sep peptide ,P* ou de nature organique (chloroforme ou THF) si gel caractre lipophile ut pour sep polymre ou fraction lipidique

a) Principe Classement des m* en fct de leur taille : er o Grosses M* exclu des pores sorte en 1 o petits m* lue en dernier (les plus ralenti car passe dans les pores) o moyenne classs selon taille

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b) Thorie Vr = Ve + K*Vp Vr = Volume de rtention (ou dlution) Ve = vol extra particulaire (ou interstitiel) Ve = volume de PM Vp = vol de porosit intraparticulaire Vp = volume des pores Kd = coefficient de diffusion ds pores = conc m* ds pores /conc m* lext = Cp/Ce o Kd=0exclusion totale o 0<Kd<1exclusion diffusion o Kd=1diffusion totale Si m* trop grosse pour pntrer ds pores ,elles sont exclues et passent ds vol extraparticulaire Ve Les m* intermdiaires diffusent ds pores selon leur taille fct de K

c) caractristiques des gels Porosit : o fct du d de rticulation o + gel rticul + pores faibles (qlq 10aines qlq milliers dA) o le vol de porosit Vp (cm3/g) avec porosit o il a une influence sur la capacit de gonflement du gel Grains : o de 40 300 m P atm o 10 80m en HPLC (hte P) Gel inertes vis--vis : o des solvants o des composs sparer Caractriss par leur consistance : o gel mou P <2 bar (2 x Patm) dextran aggarose polyacrylamide o gel semi rigide P70 bar polystyrne

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o gel rigide P>70 bar arogels

d) types de gel Gel de dextrane = sephadex (P*) o hydrates de carbone polymris caractre polaire Hle o ut pour sep P* Gel daggarose = sephadex ou gelarose : o prep partir dAgar-Agar o polysaccharides solubles chaud et donnant gel par refroidissement o struct due la cration de LH ds polysaccharides Gel de polyacrylamide : o amide acrylique polymris (polaire) o insoluble ds H2Ogonflet gel o ut pour sep Mm* bio telles que P* ou polysaccharides Gel de polystyrne divinylbenzne o sep m* lipophile (lipides ou polymres de $) Arogels : o perles de silice ou de verre ou poudre de verre surf poreuse o ut en suspension en HPLC e) Choix du gel (PS) En fct m* sep : o nature du gel hydrophile ou hydrophobe o porosit trac courbe dtalonnage log MM =f(Vlution) avec des talons de MM connues de nature similaire lech

MM de forme varies pelote ,filiforme Ex pour P* nature globulaire Pour gamme talon ,il faut 1 composant exclu totalement 1 composant pntrant ds les pores partiellement logMM A B C

Vlution Zone linaire :pente faible (le compo B le plus gd volume dlution) 10^3<MM<10^4

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f) Application

Dsalage des P* (ut gel trs rticul) P* Sel minraux Vol lution

Sep de m* de taille trs te, de cellule (lymphocytes) ou de particules (virus) Fractionnement dun mlange de macromolcules. Dtermination des constantes dquilibre Dtermination de MM sep des masses de 200 10^7 o Polymres naturels ou de $ :peptides ,hormones ,enzymes o Pour m* de taille peu te ut colonne + longue : recyclage (recueille luant la sortie et remet dedans g) Caractristiques de la chromato/gel ttes les m* sont lues tps de sparation prvisible car correspond au vol dlution tot vol dlution ou tps est fct de la taille des m* do dtermination MM 2 m* peuvent tre sep si au moins 10% de ce vs MM les pics ne slargissent pas en fct du tps de rtention leffi, cd nbre de plateau thorique, est en gnral < la chromato liq habituelle

2.6 Chromatographie daffinit

Utilise une PS constitue d'un support (silice, polymre) sur lequel on a greff une molcule organique particulire qui prsente une affinit slective pour certains constituants d'un mlange dont on cherche les isoler. eux-ci vont tre slectivement adsorbs ou tout au moins retenus sur la colonne, tandis que les autres composants sont trs rapidement lus. Un changement de la phase mobile (pH, force ionique ou ajout d'un comptiteur) permet ensuite d'luer les substances intressantes, avec un facteur de purification pouvant atteindre 1000. C'est le type de chromatographie le plus slectif, une protine pouvant tre purifie d'un facteur 103 104 en une seule fois.

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9 - LA CHROMATOGRAPHIE D'AFFINIT : Principe : Dans ce type de chromatographie, la phase stationnaire est un support macromolculaire chimiquement inerte sur lequel est greff un effecteur qui prsente une affinit biologique pour un solut de l'chantillon analyser. Trois types d'affinits sont utilises : affinit enzyme-substrat affinit ligand-rcepteur affinit antigne-anticorps Trs souvent, la molcule fixe sera le substrat, le ligand, ou bien l'anticorps. Ceci permettra de purifier l'enzyme, le rcepteur ou l'antigne, respectivement. Figure 1 : Les trois tapes d'une chromatographie d'affinit. 1 - Etape de FIXATION : Le mlange de molcules contenant le compos purifi est charg sur la colonne d'affinit. Seule la molcule prsentant une affinit pour la colonne sera retenue par l'effecteur greff sur la phase stationnaire. 2 - Etape de PURIFICATION : En continuant faire passer du tampon dans la colonne, toutes les molcules contaminantes sont limines et lues. 3 - Etape d'ELUTION : La molcule purifie est dccroche de la colonne et est recueillie dans l'luat. Souvent, l'un des deux partenaires de l'interaction au moins est une protine (P), l'autre sera qualifi de ligand (L)de cette protine :P + L <=> PL L'association de P et de L forme le complexe PL. La constante dfinissant cet quilibre est : Ka = (P).(L) / (PL) NB : C'est une constante d'association l'quilibre, qui s'crit donc avec un "K" majuscule. La phase stationnaire (le gel d'affinit) : elle est constitue d'un effecteur fix par covalence un support (carboxymthylcellulose, Sphadex, gel de polyacrylamide) par l'intermdiaire d'un bras de fixation ("spacer" en anglais). Exemples de drivs de la carboxymthylcellulose ou CM-cellulose : La CM-aminohexylique : permet la fixation d'un effecteur fonction carboxyle. - O - CH2 - CO - NH - (CH2)6 - NH2 (spacer long) La CM-hydrazide : permet la fixation d'un effecteur fonction carboxyle. - O - CH2 - CO - NH - NH2 (spacer court) La CM- aminohexylique (ou aminododcylique) succinyle : permet la fixation d'un effecteur fonction -NH2 ractive. - O - CH2 - CO - NH - (CH2)n -NH - CO - CH2 - CH2 - COOH (n = 6 ou 12, spacer long) La longueur du bras est choisie de manire limiter les contraintes striques. Effecteurs : Affinit enzyme-substrat : substrats, analogues, inhibiteurs rversibles, effecteurs allostriques, coenzymes. Affinit ligand-rcepteur : haptnes, antignes, anticorps. Affinit antigne-anticorps : hormones, peptides, analogues peptidiques. Elution : elle peut tre ralise de diffrentes faons : Tampon de pH diffrent de celui ayant permis la charge : changement de l'tat d'ionisation d la protine : dsorption Tampon de force ionique diffrente de celle ayant permis la charge : changement de conformation de la protine. Comptition avec un ligand libre

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3 Choix dune mthode de chromatographie

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Le choix de tel ou tel mode obit des rgles logiques directement lies la nature des composs sparer :

1 - chromatographie d'adsorption 2 - chromatographie de partage (en phase directe (2A) ou inverse (2B)) 3 - chromatographie d'change d'ions (+ chromatographie ionique) 4 - chromatographie de paires d'ions 5 - chromatographie d'exclusion (sparation selon la taille) 6 - chromatographie d'affinit 7 - chromatographie adapte la sparation d'nantiomres

schma p294 moniteur

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