Alumnos: Spaccarotella, Jonathan Minghetti, Carla Turno: Viernes de 9:00 a 16:00 hs

Trabajo prctico N 5: Cromatografa de adsorcin Obtencin de pigmentos naturales

Objetivos: - Aprender el manejo de la tcnica de cromatografa de adsorcin de columna. - Separar pigmentos vegetales a partir de espinaca. Introduccin: La cromatografa en columna es la tcnica de separacin e identificacin de sustancias qumicas, por la diferente retencin que experimentan los componentes de una mezcla, al ser ms o menos adsorbidos por los componentes de una fase fija situada en una columna, cuando son arrastrados por un fluido (fase mvil). Si la fase mvil es lquida hablamos de cromatografa lquida y si es gas ser cromatografa de gases. El adsorbente, suele ser gel de slice o almina, pero pueden ser otros. Intervienen los fenmenos de adsorcin y disolucin, por consiguiente es fundamental tener en cuenta la polaridad, tanto de las sustancias a arrastrar como del disolvente, si queremos tener una buena separacin. El disolvente al descender arrastra las sustancias a distinta velocidad segn la mayor o menor retencin que experimenten, y salen de la columna a distinto tiempo. Los colores que presentan los vegetales son debidos a unos compuestos qumicos llamados pigmentos. El color que presenta un determinado rgano vegetal depende generalmente del predominio de uno u otro pigmento o la combinacin de ellos. Estos pigmentos se encuentran en el interior de las clulas vegetales especficamente en una organela llamada cloroplasto. Dentro de los pigmentos naturales de las plantas, pueden destacarse ciertos compuestos responsables de los cambios de coloracin de las mismas con el paso del tiempo. Los ms remarcables son: CLASE Porfirinas Carotenoides TIPO COMPUESTO Clorofilas Carotenos Licopenos DE COLOR Verde Amarillo, naranja Rojo

Alumnos: Spaccarotella, Jonathan Minghetti, Carla Turno: Viernes de 9:00 a 16:00 hs

Flavonoides

Xantofilas Flavonas Flavonoles Antocianinas

Amarillo Amarillo Amarillo Rojo,azul, prpura

magenta,

Los pigmentos cloroflicos son insolubles en agua, pero s son solubles en solventes orgnicos. Existen otros solventes que presentan afinidad por algunos pigmentos y se los llama separadores, como por ejemplo el tetracloruro de carbono y el ter de petrleo. En el mtodo de extraccin simple, se utilizar como extractante el alcohol etlico y como separador el acetato de etilo. Estos dos solventes orgnicos responden en forma diferente a los pigmentos cloroflicos, como as tambin a sus diferencias fsicas que hacen que sean dos lquidos no miscibles y con diferente peso especfico Desarrollo de la prctica: Extraccin de pigmentos: Se cortaron hojas de espinaca en trozos y se licuaron con etanol, luego se procedi a filtrar el extracto. Se concentr el filtrado en el Rotavap hasta obtener un aceite que se extrajo mediante acetato de etilo. La fase orgnica se llev a sequedad en Rotavap y se analiz por CCD. Realizacin de CCD: Se realiz una CCD con el extracto obtenido para as determinar el orden que deberan seguir los solventes de elucin, el solvente de siembra y el de armado de la columna. Se sigui la siguiente secuencia de solventes de desarrollo: Hexano Hexano:AcOEt Hexano:AcOEt Hexano:AcOEt Hexano:AcOEt Hexano:AcOEt

9:1 8:2 7:3 6:4 1:1

Se determin que el solvente adecuado, tanto para la siembra como para el armado de la columna, sera el hexano; asimismo, el solvente que ms compuestos separ fue Hexano:AcOEt 6:4 Separacin cromatogrfica: a) Preparacin de la columna cromatogrfica:

Alumnos: Spaccarotella, Jonathan Minghetti, Carla Turno: Viernes de 9:00 a 16:00 hs

Se toma una columna cromatogrfica y se introduce un trozo de algodn, humedecido hexano, y se lo aprieta con una varilla de vidrio. Se cierra el robinete y se agrega hexano hasta una altura de 100 mm; luego se agrega una suspensin del absorbente en el solvente de armado, gracias a un embudo, lentamente. Para compactar el absorbente se abre el robinete y se drena el solvente. Luego se agrega una cantidad mnima para evitar la desecacin del punto de siembra. b) Desarrollo de la cromatografa: Se disuelve el extracto vegetal con el solvente de armado. En nuestro caso, la muestra no fue soluble en el solvente de siembra, por lo que debimos realizar la tcnica de pastilla, agregando un solvente en donde la muestra es soluble y pequeas cantidades de slicagel. Se deja evaporar la suspensin en Rotavap, de esta forma, la muestra queda adsorbida homogneamente en la superficie de la slicagel. Este polvo obtenido se agrega al tope de la columna de adsorbente logrando un anillo de siembra. De esta forma se continu el flujo con el solvente con que se haba armado la columna. Luego se inicia el desarrollo cromatogrfico utilizando la secuencia de solventes de elucin determinada previamente. Primero se utiliz hexano/Acoet (9:1) para separar el primer compuesto (carotenos). Luego de extraer totalmente este compuesto, se fue subiendo la polaridad progresivamente usando Hexano:AcOEt (8:2) para separar el segundo compuesto (feofitinas). El siguiente solvente utilizado fue Hexano:AcOEt (7:3), pero debimos llegar hasta Hexano:AcOEt (6:4) para lograr separar el siguiente compuesto (clorofilas). Por ultimo se aumento aun ms la polaridad, usando nuestro solvente ms polar Hexano:AcOEt (1:1) logrando separar el ltimo compuesto (otros carotenoides).

Resultados y discusin de resultados El corrimiento de la muestra para la separacin de los pigmentos de las clorofilas se desarroll con la siguiente secuencian de solventes de elucin: Hexano Hexano:AcOEt Hexano:AcOEt Hexano:AcOEt Hexano:AcOEt Hexano:AcOEt

9:1 8:2 7:3 6:4 1:1 3

Alumnos: Spaccarotella, Jonathan Minghetti, Carla Turno: Viernes de 9:00 a 16:00 hs

Poco a poco se fueron separando los pigmentos y esto se observ en la slica, mediante la formacin de bandas en distintas tonalidades. Estas bandas tenan diferente grosor, dependiendo de la abundancia del pigmento en la muestra. Las que tenan ms afinidad por el disolvente bajaban ms rpido que los otros pigmentos. La primera capa formada fue de color amarillo, la siguiente capa fue de color grisceo, seguida de un verde amarronado y por ltimo, nuevamente amarillo. Una vez separados los compuestos, se utilizaron los tubos ms concentrados representantes de cada compuesto y se les realiz un espectro U.V
1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 250 350 450 550 650 750 Feofitina Clorofila Carotenos

Grfico I: Espectro de absorcin UV para los compuestos extrados mediante cromatografa de columna.

Utilizando el espectro de la gua de trabajos prcticos, pudimos determinar que el primer compuesto separado con hexano/Acoet (9:1) seran las Feofitinas, el segundo separado con hexano/Acoet (6:4) corresponden a Clorofilas y el tercero con hexano/Acoet (1:1) a Carotenos. En ocasiones, la presencia de clorofila no es tan patente al descomponerse y pueden ocupar su lugar otros pigmentos tambin presentes en los cloroplastos como son los carotenos (alfa, beta y gamma) y las feofitinas. Creemos que esto, sumado a que el extracto de espinaca fue mantenido en seco durante el transcurso de una semana, explica por qu obtuvimos tan poca cantidad de clorofilas a travs de la cromatografa de columna. Conclusiones:

Alumnos: Spaccarotella, Jonathan Minghetti, Carla Turno: Viernes de 9:00 a 16:00 hs

Pudimos ver que la cromatografa de adsorcin en columna es una tcnica til para separar los distintos compuestos contenidos en una muestra vegetal cumpliendo satisfactoriamente el objetivo de la prctica. Sin embargo los resultados obtenidos en el espectro U.V, comparado con el espectro de la gua de trabajos prcticos, no fueron del todo concluyentes. Creemos que esto pudo haber sido causado a una mala siembra de la pastilla, dado que al comenzar la separacin los compuestos no corran idealmente en lnea horizontal, sino que lo hacan de forma irregular. Asimismo, debemos tener en cuenta la posible descomposicin de los compuestos cloroflicos, ya que la muestra debi ser sometida a procesos que pueden haber afectado su estructura.