COMPUSI CHIMICI DE BIOSINTEZA

ACIDUL CITRIC

Acidul citric
a fost izolat pentru prima dat din sucul de lmie de ctre chimistul suedez Carl Scheele n 1784; este un produs intermediar de metabolism aproape universal, fiind prezent n urme n aproape toate plantele i animalele; prima producie comercial din fructe de lamaie a fost nregistrat n Anglia, n 1826; in 1917 Curie descoper c anumite tulpini de Aspergillus niger prezint o cretere abundent, iar n timpul creterii produc cantiti mari de acid citric; n 1923, n SUA., are loc dezvoltarea primei producii industriale de acid citric si se datoreaza companiei Pfizer;

Domenii de utilizare

Microorganisme productoare
pe substraturi zaharoase: Mucor piriformis, Penicillium luteum, P.citrinum, P. restrictum, Talaromyces sp., Apergillus niger, A. clavatus, A. wentii, A. fumaricus, A. awamori, A. nidulans, A. fonsecaeus, A. luchensis, A. phoenicus,Trichoderma viride etc. din fraciuni de n-parafine: Arthrobacter paraffineus, specii de Corynebacterium, Penicillium restrictum i diferite specii de drojdii din familia Candida (lipolytica, oleophila, citrica); au fost utilizate la scar industrial pe diferite substraturi speciile Candida incluznd C. tropicalis, C. catenula, C. guilliermondii i C. intermedia dezavantaj: produc alaturi de acid citric cantitati destul de importante de acid i-citric; importan practic prezint numai Aspergillus niger, datorit obinerii unor randamente ridicate de acid citric dintr-o gam destul de variat de substraturi zaharoase.

Biochimia acidului citric

C6H12O6+3NAD+C6H8O7+3NADH+3H+

Ciclul Krebs

Materii prime
Surs de carbon - gam bogat de materii prime cu coninut de monosau dizaharide (glucoza, fructoza, zaharoza, maltoz) ca melasa de sfecl, respectiv trestie de zahr, hidrolizate de amidon, melas de citrice, deeuri de fructe (ananas, fructe palmier dup extracia uleiului) subproduse din industria berii. se impune purificarea melasei, care poate fi realizat fie prin reinere pe schimbtori de ioni, crbune activ, bentonit, fie prin precipitare cu ferocianur de potasiu i acid sulfuric la 80-1000C/15 min. mutani de Yarrowia lipolytica au fost testai cu succes pe substraturi cu glicerina rezultat de la fabricarea de biodiesel, ape reziduale de la fabricarea uleiului de msline, sau deeuri de ananas. Materiile prime complexe, nu necesit suplimentare de surs de azot. In mediile simple sursa de azot este asigurat de amoniac sau sruri de amoniu (azotat sau sulfat), care pot fi suplimentate cu surse organice de azot (extract de porumb, hidrolizate proteice). Intensificarea productiei in prezenta unor adaosuri: amino-acizi, metanol, acid ascorbic sau antispumanti(pentru culturile submerse).

Tehnologii de fermentaie
Cultura de suprafa
Materia prim: melas, purificat, diluat pn la o concentraie de zahr de aprox. 15%, iar pH = 5-7; Inocularea se realizeaz direct cu spori; Celulele fermentatorului au o capacitate de 50 100 L i o suprafa de 5 m2, grosimea stratului de mediu 5 - 20 cm; Temperatura 28-300C; pH-ul dup 24 h scade la valoare 2; Aerare cu aer steril, umiditate 45-60%, debit variabil funcie de faza de cretere; Producia de acid citric incepe dup 2-4 zile; Durata: 8 15 zile; Randament 70-95% (57-77% din cel teoretic); Productivitatea trebuie s fie de peste 1 kg ac. citric/ (m2 strat micelarzi).

Schema de principiu a instalatiei de fabricare a acidului citric din melasa prin cultura de suprafata
1.- vas preparare substrat; 2.- filtru de aer; 3.- saturator; 4.- preincalzitor aer; 5.- fermentator celular; 6.- vas colector mediu; 7, 11, 13.- filtre; 8.- vas spalarea micelii; 9.- vas colector filtrat; 10.- vas precipitare citrat de calciu; 12.- vas acidulare; 14.- rezervor acid brut; 15.- filtru presa; 16.- evaporator; 17.- cristalizor

Cultura submers
nltur principalele dezavantaje ale culturii de suprafa, necesit manoper mai mic, ocup un spaiu mai redus i conduce la productiviti mai mari; fermentatoarele, de diferite tipuri constructive (cu amestecare mecanic, tip coloan sau air-lift) sunt confecionate din oel inoxidabil de nalt puritate, datorit mediului puternic acid i a capacitii acidului citric de a dizolva ioni metalici, sunt echipate cu sisteme eficiente de aerare; surs de carbon: - se utilizeaz att melas ct i hidrolizate de amidon, a cror concentraie n substrat se fixeaz la 15-20%. inoculul se prepar ntr-un reactor de mic capacitate, n care condiiile sunt modificate n sensul favorizrii unei etape rapide de cretere, etap care dureaz 18-30 h. Fermentaiile se desfoar n fermentatoare de 100-200 m3, la temperaturi de cca. 300C.

Principalii factori de influen n fermentaia citric sunt: compoziia mediului de cultur (natura i concentraia sursei de carbon, concentraia de azot i fosfor, concentraia de microelemente Zn, Mn, Fe, Cu, metale grele i metale alcaline), morfologia microorganismului productor, pH-ul i aerarea. Anumii nutrieni trebuie s fie n exces (zaharide, protoni, oxigen), altele trebuie limitate in mediu (azot i fosfor), iar unele componente ale materiei prime trebuie s rmn sub anumite limite bine definite (de ex. urmele de metale, n special Mn). Monozaharidele (glucoza i fructoza), care rezult din hidroliza zaharozei din melas nu sunt echivalente din punct de vedere al asimilrii de ctre fungie. Fructoza este asimilat mai lent, iar viteza sa de asimilare scade semnificativ o dat cu acumularea n mediu a acidului citric.

Compoziia substratului n culturile submerse

Component, g/L Zaharoz Bactoagar NH4NO3 KH2PO4 MgSO47H2O Ioni de Cu Ioni de Zn Ioni de Fe Ioni de Mn Etapa de sporulare/ cretere 140 20 2.5 1.0 0.25 4.810-3 3.810-3 2.210-3 110-3 Etapa de producie 140 0 2.5 2.5 0.25 610-5 2.510-4 1.310-3 110-3

Influena naturii sursei de carbon asupra concentraiei i a vitezei de formare a acidului citric

morfologia fungilor filamentoi variaz ntre pelei i filamente libere, funcie de condiiile de cultur, respectiv de tulpina productoare. amestecarea intens este asociat cu formarea de filamente scurte, groase i puternic legate, care au o productivitate ridicat de acid citric. O amestecare intens poate conduce la ruperea filamentelor. n culturile de Aspergillus niger s-au observat cicluri de fragmentare micelial i recretere, fenomene favorabile produciei de acid citric.

formarea de pelei prezint ca avantaj o mai facil amestecare, consumul energetic fiind mai redus. Trecerea de la forma de pelei la un miceliu filamentos conduce la o scdere cu 50% a concentraiei de oxigen dizolvat la un debit constant de aer. pH-ul mediului de cultur este important n dou etape diferite ale fermentaiei. n etapa de germinaie a sporilor pH-ul mediului terbuie s fie mai mare de 5, n timp ce n etapa de producere a acidului citric necesit un mediu puternic acid, pH 2. pH-ul puternic acid previne contaminarea culturii cu alte microorganisme i inhib formarea unor produse secundare nedorite (acid gluconic, oxalic), facilitnd separarea acidului citric din mediul de fermentaie.

Aerarea este un factor semnificativ care afecteaza costul de producie. Productorii de acid citric au constatat faptul c variaii ale gradului de aerare n culturile discontinue poate avea efecte dramatice asupra producie de acid. n practica industrial se realizeaz un grad relativ redus de aerare n etapa iniial (0.1 m3/(m3 mediumin)), mrindu-se apoi n etapa de cretere la 0.5 1 m3/(m3 mediu min). La un asemenea grad de aerare apare fenomenul de spumare pentru limitarea cruia se utilizeaz diferite dispozitive i ageni antispumani. Utilizarea microorganismului productor (miceliu de Aspergillus niger) n form imobilizat pe diferite suporturi (spum poliuretanic, perle de alginat, agar, colagen, gel de poliacrilamid etc), att n culturi de suprafa ct i n culturi submerse, conduce la obtinerea unor viteze mai mari de producere a acidului citric, n special la concentraii mai mari de glucoz. De asemenea, este atractiv posibilitatea recirculrii biomasei.

Schema instalaiei submerse de fabricare a acidului citric

1. substrat; 2, 9. coloane demineralizare; 2a. pasteurizator; 2b. rcitor; 3. inocul; 4. fermentator; 5, 6, 8, filtre; 7. vas acidulare; 10. coloana decolorare carbune activ; 11, 14. evaporator; 11a, 14a, cristalizor; 12, 15. centrifuga; 13. vas dizolvare, 16. usctor; 17. ambalare

Separarea acidului citric din mediile de fermentaie

Metoda precipitrii

Procedee alternative
extracia cu solveni, insolubili sau cu o solubilitate extrem de redus n ap. Drept solveni a fost testat o gam variat de compui organici (alcooli, cetone, esteri, eteri, compui organo-fosforici, amine), datorit ns toxicitii acestora, doar procedeele utiliznd amine au aviz favorabil de utilizare pentru industria alimentar, respectiv farmaceutic. Separarea pe schimbtori de ioni este fezabil doar n cazul utilizrii unor materii prime cu puritate ridicat. Se pot utiliza anionii slab bazici, impregnai cu amine teriare sau piridin, sau anionii puternic bazici, cu grupe funcionale cuaternare de amoniu. Necesarul mare de efluent, obinerea de soluii diluate de acid citric i necesitatea regenerrii schimbtorului de ioni rmn ca principalele tare ale procedeului.

extracia reactiv cu membrane lichide, respectiv membrane lichide emulsionate n care diveri extractani organici complexeaz reversibil cu acizii. Drept extractani pentru acidul citric se pot utiliza aminele teriare care au dat cele mai bune rezultate n extracia cu solveni. n etapa de extracie, aminele bazice reacioneaz cu ionii de hidrogen din soluia de alimentare formnd un cation teriar de alchil-amoniu, care formeaz cu anionul de citrat o sare complex ce se transport prin membrana lichid n faza de stripare, n care elibereaz acidul i se regenereaz amina care va redifuza prin membran spre faza de alimentare. Cele mai multe studii au fost realizate cu trioctilamin (TAO), respectiv Alamine 336, n diveri solveni organici (izodecanol, n-parafine; acetat de butil, N,N' alchilamid disubstituit etc.).

Avantajele procedeului constau in: stabilirea rapid a echilibrului de faz, realizarea unor grade avansate de recuperare (de peste 97%) chiar i la o singur contactare, consumul energetic mai redus, posibilitatea realizrii unei concentrri concomitent cu etapa de extracie, generarea unor cantiti mai reduse de deeuri, precum i un volum mai mic al instalaiei de separare. Utilizarea membranelor lichide suportate nu a fost adoptat la scar industrial, n principal datorit stabilitii reduse a membranei n timp, cauzat de pierderile prin solubilizare, a curgerii osmotice a apei prin membran i umezirea porilor suportului. Pentru eliminarea acestor deficiene au fost utilizate drept suport fibre capilare (hallow fibre) microporoase. Datorit obinerii unor grade avansate de recuperare i a realizrii concomitent a concentrrii acidului citric, procedeul are mari perspective n recuperarea acidului citric din soluii diluate.

separarea prin electrodializ, utiliznd membrane bipolare, realizeaz un grad avansat de recuperare. nainte de unitatea de electrodializ este necesar filtrarea mediului, ndeprtarea speciilor ionice (n special Ca2+ i Mg2+) i neutralizarea cu hidroxid de sodiu. n etapa de electrodializ citratul trisodic este convertit n acid citric, concomitent realizndu-se concentrarea i n mare msur i purificarea acestuia. Procedeul nu cunoate nc o aplicare la scar industrial n special datorit consumului relativ ridicat de energie, a costului i duratei de via a membranelor.

Schema separrii acidului citric prin electrodializ

O separare i concentrare continu a acidului citric din mediile de fermentaie se poate realiza prin ultra-, respectiv nanofiltrare. Aceste procese membranare pot fi extrem de benefice la scar industrial pentru recuperarea acidului citric datorit avantajelor pe care le prezint: consum energetic sczut, lipsa de deeuri n comparaie cu metodele chimice convenionale i posibilitatea realizrii lor n flux continuu. Cu toate acestea necesit nc studii de verificare i optimizare la scar pilot i industrial.