Histoqumica Definicin

La histoqumica es el conjunto de tcnicas que persiguen la: identificacin localizacin cuantificacin de: una sustancia un grupo reactivo una actividad enzimtica en clulas y en tejidos que conservan su estructura lo ms ntegramente posible. Para ello se aplican reacciones qumicas o fsicas sobre cortes histolgicos. Es decir, los cortes histolgicos se tratan para identificar determinadas propiedades. Dado que la estructura del tejido se ha preservado y es visible (mediante tincin), se puede localizar la propiedad buscada (si ocurre en el interior de determinado tipo celular, en la luz de un rgano, en los ncleos celulares, etc.). La propiedad buscada puede ser la presencia de una sustancia, de un reactivo o de una actividad enzimtica. Dependiendo de la tcnica histoqumica, puede ser posible no slo identificar la localizacin en el tejido, sino adems cuantificar (cantidad de sustancia, de actividad enzimtica, etc.).

Condiciones qumicas
Las reacciones histoqumicas deben ser: Especficas: deben detectar la sustancia buscada, evitando reaccionar con otras sustancias (falsos positivos). Sensibles: ya que las sustancias a detectar suelen estar en concentraciones bajas. Reproducibles: siempre que se realice la tcnica, el resultado debe ser similar. Cmo aseguramos la especificidad de una reaccin histoqumica?

Utilizando controles. Los controles son preparaciones histolgicas sobre las que se realiza la tcnica con modificaciones. Estas modificaciones aseguran que la tincin no se produzca (control negativo) o que se produzca siempre (control positivo). Sirven para comprobar que se est realizando correctamente la tcnica, que no hay problemas con los reactivos, o que no tenemos falsos positivos.
Cmo podemos aumentar la sensibilidad de una tcnica histoqumica?

Se puede aumentar el grosor de los cortes, lo cual incrementa la cantidad de sustancia a detectar; especialmente, si la sustancia est dispersa en el citoplasma o si forma grnulos, que deben tener cierto tamao.
Cmo aseguraramos la reproducibilidad de una tcnica histoqumica?

Estandarizando la tcnica. Deben fijarse con precisin las condiciones de

trabajo, los reactivos a utilizar, la temperatura, pH, etc.

Condiciones morfolgicas
Las reacciones histoqumicas deben realizarse sobre preparaciones en las que: Se haya respetado la integridad de los tejidos. Se mantenga la sustancia a detectar en su localizacin original. Esto implica que el procesamiento de las muestras (fijacin, cortes, etc.) debe realizarse con ciertas restricciones que en el caso de una preparacin histolgica rutinaria.

Procesamiento de las muestras para histoqumica

Las muestras deben ser procesadas de manera similar a las muestras destinadas a tinciones histolgicas, pero a menudo se producen ciertas particularidades.

Tcnica histolgica rutinaria Tcnica histoqumica Toma de muestras Fijacin Deshidratacin Inclusin Corte Desparafinado Tincin Deshidratacin Montaje Toma de muestras Fijacin (especfica para la tcnica) Deshidratacin (no siempre es posible) Inclusin (no siempre es posible) Corte Desparafinado (si se ha incluido) Tincin o incubacin Deshidratacin (no siempre es posible) Montaje

Particularidades de la fijacin en histoqumica

En los estudios histolgicos la fijacin se utiliza para evitar los cambios post-mortem de rganos, tejidos y clulas, estabilizar las estructuras celulares, proteger a las clulas de las distorsiones que pueden originarse durante el proceso de deshidratacin e inclusin y mejorar el potencial de tincin de las distintas estructuras. Cmo debe comportarse un buen fijador para histoqumica?

Debe mantener las sustancias a detectar en su localizacin original, sin destruirlas ni dispersarlas (e.g., no se puede utilizar etanol, que disuelve lpidos, cuando se quiere demostrar la presencia de lpidos). Debe mantener, o modificar lo menos posible, las propiedades fsicoqumicas de la sustancia a detectar. No debe interferir con la tcnica, bien por inhibicin, por eliminacin de grupos reactivos o porque el propio fijador aporte la sustancia a detectar (e.g., no se puede utilizar lquido de Zenker, que contiene mercurio, si se quiere detectar mercurio). No obstante, en algunos casos los fijadores permiten la realizacin de la tcnica. Los fijadores que desnaturalizan protenas pueden incrementar as los grupos reactivos que estaran normalmente enmascarados en el interior de las protenas globulares.

Qu fijadores son utilizados en histoqumica?

Aldehdos, especialmente el formaldehdo (e.g. formol-calcio a 4 C y pH 7,0-7,2). Mezlas fijadoras, como el lquido de Bouin (formaldehdo, cido pcrico en saturacin y cido actico) y el lquido de Carnoy (etanol absoluto, cloroformo y cido actico). Etanol y acetona, de forma limitada y para precipitar protenas in situ (uso en fro y tiempos muy cortos).

Qu podemos hacer si la tcnica histoqumica no permite utilizar un fijador qumico?

En algunos casos, es posible realizar una fijacin muy breve, realizar la reaccin histoqumica y posteriormente una post-fijacin. Cuando no es posible fijar qumicamente, se utiliza la congelacin. La congelacin se utiliza sobre todo en histoenzimologa. Debido a la contraccin del tejido, a la desecacin y a la formacin de cristales de hielo, la morfologa de la muestra es menos satisfactoria que con la fijacin qumica. Para minimizar los artefactos, se realiza una congelacin muy rpida (nitrgeno lquido) y se suelen utilizar crioprotectores (alcohol, isopentano). No obstante, la congelacin detiene la actividad metablica, estabiliza los componentes de la muestra (permitiendo su localizacin) y permite prescindir de la inclusin. La muestra congelada puede cortarse directamente en un criostato, tras lo cual los cortes se dejan secar a temperatura ambiente. Las secciones pueden almacenarse a -20 C, pero la actividad enzimtica disminuye con el tiempo.

Despus de la tincin histoqumica, se suele teir la muestra con una tcnica de rutina, para distinguir las estructuras y dar contraste a la tincin histoqumica. Lo ms importante es tener un buen contraste de los ncleos y del citoplasma, y que la tincin destaque el producto de la tincin histoqumica. Si es posible, la preparacin se deshidrata y se monta con resina sinttica. Si no es posible deshidratar, debe utilizarse un medio de montaje acuoso (glicerina-gelatina y otros).

Reaccin histoqumica
Tras procesar la muestra, sta se trata con una solucin, llamada reactivo histoqumico. Si se desea determinar reacciones enzimticas, se habla de medios de incubacin. La solucin, adems de la sustancia o sustancias que van a reaccionar, suele contener otras sustancias que ayudan en la penetracin de los reactivos, y facilitan o permiten la reaccin. A veces, no es necesario aplicar ningn reactivo para detectar la sustancia que se busca (pigmentos, cidos nucleicos absorben luz UV a 260 nm, vitaminas fluorescentes, etc.). En algunos casos, basta con aplicar un reactivo histoqumico para poner en evidencia la sustancia buscada (e.g., tcnica de Perls para deteccin de hierro): Sustancia + Reactivo Producto final identificable En otras ocasiones, el resultado de la reaccin es un producto no visible, por lo que se necesita un segundo paso (e.g., tcnica de PAS para deteccin de glcidos): Sustancia + Reactivo Producto inicial no identificable

Producto inicial + Reactivo adicional Producto final identificable Estos productos deben ser insolubles y no difundir, para localizar adecuadamente la sustancia de inters.

Reacciones histoenzimticas
Con las reacciones histoenzimticas se detecta un tipo de actividad enzimtica concreta. No se detecta la enzima en s (que se hara con inmunodeteccin). La histoenzimtica no slo permite detectar actividad enzimtica, sino determinados tipos celulares y orgnulos en los que esa actividad es tpica (e.g., una actividad ltica indicara presencia de lisosomas). En este caso, se utiliza un sustrato de la enzima, el cual es convertido en un producto por la actividad enzimtica. Como este producto no es visible, en general, se utiliza un reactivo de captura (cromgeno), que reacciona con el producto para dar un producto final visible: Enzima + Sustrato Producto inicial no identificable Producto inicial + Reactivo de captura Producto final identificable

Caractersticas de los sustratos y productos en histoenzimtica

Es importante que la reaccin sea especfica. Si el sustrato puede ser procesado por distintas enzimas, habr que inhibir aquellas que no interese localizar. Tambin debe asegurase de que el reactivo de captura llegue al lugar de reaccin a la vez que el sustrato y que tenga mayor velocidad de penetracin. Los productos de la reaccin, tanto el identificable como el no identificable, deben ser insolubles; el producto inicial debe reaccionar rpidamente con el reactivo de captura y el producto final debe ser oscuro y formar precipitados pequeos, para dar buen contraste y asegurar la localizacin. Por qu el reactivo de captura debe acompaar al sustrato, e incluso penetrar ms rpidamente que ste?

Si el reactivo de captura no est presente en el lugar de reaccin, el sustrato podra difundir, perdindose la localizacin de la actividad enzimtica. A menudo se utilizan condiciones sub-ptimas e incluso inhibidores enzimticos, para que el producto inicial se produzca lentamente y reaccione con el reactivo de captura en la misma localizacin.
Por qu los productos finales de las reacciones histoqumicas, en general, deben ser insolubles en agua y lpidos?

De esta manera, forman precipitados que mantienen la localizacin inicial, y no se disuelven en procesos adicionales.

Las tinciones histoenzimticas son afectadas por la temperatura, pH, inhibidores de la actividad enzimtica y cofactores (sustancias como iones metlicos o coenzimas, que son necesarias para la actividad enzimtica). Variando estos factores se puede optimizar la reaccin y producir la localizacin deseada. Hay que tener en cuenta que disitintas enzimas pueden funcionar en condiciones muy diferentes.

Ejemplos de tcnicas histoqumicas

Deteccin de polisacridos

Reaccin del P.A.S. (periodic acid-Schiff): Esta tincin da una coloracin fucsia caracterstica en presencia de carbohidratos (polisacridos simples, polisacridos complejos neutros y polisacridos cidos sulfatados). La mezcla de cido perydico y reactivo de Schiff (derivado incoloro de la fucsina cida) produce una reaccin doble: 1) R-CHOH-CHOH-R + IO4- R-CHO + R-CHO + IO3 + H2O (grupos vic-glicol) (perydico) (aldehdos)
2) R-CHO + Reactivo de Schiff Azometina (producto coloreado)

Azul alcin: Da una coloracin azul en presencia de mucopolisacridos cidos. Es un compuesto bsico que reacciona con los mucopolisacridos a pH bajo.

Deteccin de polisacridos
Qu haramos para detectar la presencia de polisacridos complejos neutros y cidos simultneamente?

Las tinciones P.A.S. y azul alcin se pueden combinar, permitiendo la deteccin de distintos tipos de mucopolisacridos. Mira las microfotografas siguientes.

Microfotografas de glndulas endocervicales teidas con azul alcin y P.A.S. El azul alcin tie las mucinas cidas, mientras que el P.A.S. domina en las glndulas que producen mucinas bsicas. (a) muestra una glndula normal, mientras que (b), y (d) muestran glndulas hiperplsicas, y (c) muestra clulas de adenocarcinoma (con coloracin mixta, al contener mucinas cidas y bsicas). El P.A.S. y el

azul alcin estn tiendo grnulos de mucina producidos por las clulas y almacenados en el citoplasma. Fuente: Modern Pathology (2005) 18, 11991210, doi:10.1038/modpathol.3800403.

Deteccin de lpidos
Los lpidos se pueden detectar con colorantes del grupo de los Sudanes o con Rojo 0 al aceite. Estas sustancias son lisocromos: se disuelven en lpidos y los colorean. Se suelen preparar en saturacin en etanol al 50% o 70%.

Montaje de muestras teidas con lisocromos

Tras teir con lisocromos, las muestras no se deshidratan, y se montan directamente con glicerina-gelatina. Por qu se realiza un montaje sin deshidratar y con glicerina-gelatina?

Tal como vimos anteriormente, hay preparaciones histoqumicas que no se pueden deshidratar. Recuerda que la deshidratacin se realiza con una secuencia de alcoholes, que arrastraran los lisocromos. Debido a la ausencia de deshidratacin, hay que montarlos con medio acuoso, la glicerina-gelatina.

Tincin con Rojo 0 al aceite, mostrando glbulos de grasa en el interior de arteriolas pulmonares. Estos glbulos acaban en el torrente sanguneo tras una contusin traumtica con fractura sea. Fuente: http://library.med.utah.edu/WebPath/FORHTML/FOR002.html

Deteccin de hierro
Reaccin de Perls
Se utiliza para detectar grnulos de hemosiderina (compuestos por ferritina, la protena almacenadora de hierro). Se aplica HCl diluido para liberar iones frricos, y estos iones reaccionan con ferrocianuro de potasio para formar ferrocianuro frrico (azul de Prusia), que precipita y tiene color azul verdoso.

Corte de hgado. La tincin de Perls muestra los grnulos de hemosiderina en el tejido (acmulos con funcin de almacenamiento de hierro), debido a una situacin de exceso de este mineral (hemosiderosis o hemocromatosis). Fuente: The University of Utah Eccles Health Sciences Library.

Bibliografa
StainsFile Galera de imgenes en IHCWorld Special Stains in Histology Special stains (surgical pathology) MARTINEZ, R. y GRAGERA, R.R. 2008. Fundamentos tericos y prcticos de la Histoqumica. Consejo Superior de Investigaciones Cientficas. PEARSE A.G.E.1980. Histochemistry: Theoretical and Applied. Vol. 1. Preparative and Optical Technology. Edinburgh: Churchill Livingstone. Anterior Este artculo est licenciado bajo Creative Commons Attribution Share Alike 3.0 License Tcnicas de Biologa Celular