XVIII Congreso Argentino de Bioingeniera SABI 2011 - VII Jornadas de Ingeniera Clnica Mar del Plata, 28 al 30 de septiembre de 2011

Terapia antitumoral fototrmica in vivo utilizando nanobarras de ouro.

L. F. de Freitas1, L. C. Zanelatto2, C. Grecco, L. T. Moriyama, V.C.A. Martins4, A. M. G. Plepis1,4 1 Programa de Ps-Graduao Interunidades em Bioegenharia, Universidade de So Paulo. 2 Departamento de Gentica, Centro de Cincias Biolgicas, Universidade Estadual de Londrina. 3 Instituto de Fsica de So Carlos, Universidade de So Paulo. 4 Instituto de Qumica de So Carlos, Universidade de So Paulo. E-mail: lucasfreitas@usp.br
Resumo. Tratamentos de cncer menos invasivos e mais efetivos atraem a ateno de pesquisadores atualmente, em especial o tratamento hipertrmico utilizando nanobarras de ouro. Neste estudo, investigamos as vias de morte celular ativadas pelo uso de nanopartculas de ouro recobertas por CTAB in vivo. As nanopartculas foram sintetizadas pelo mtodo de seeding, sendo parte delas submetidas a procedimentos repetidos de lavagem e centrifugao para eliminar o CTAB solvel. O teste de MTT foi realizado para avaliar a citotoxicidade das partculas e a viabilidade delas aps sua sntese foi investigada. Uma vez sabendo que as nanopartculas lavadas e centrifugadas so biocompatveis e que as mesmas podem ser utilizadas at 48 horas aps sua sntese, o tratamento hipertrmico in vivo foi realizado. Houve uma evidente reduo no volume tumoral nos animais tratados, com um aumento de 47 C observado no local do tumor. Nossos resultados indicam que as nanobarras recobertas por CTAB so seguras para utilizao in vivo e apresentam grande eficincia na gerao de calor e consequente eliminao tumoral. Palavras-chave: Cncer, Nanorods, Ouro, CTAB, Apoptose, Necrose

1. Introduo O cncer uma desordem fisiolgica de grande incidncia, caracterizado pelo crescimento anormal de clulas malignas e uma alta demanda metablica, o que contribui para os quadros de caquexia frequentemente observados nos pacientes em estadiamento avanado. Apesar de todos os avanos obtidos nas pesquisas, os tratamentos de uso comum so, muito frequentemente, degradantes, onerosos e no garantem total eficcia na eliminao tumoral. Isso instiga a procura por novas intervenes teraputicas que sejam menos invasivas e mais eficazes. Nas ltimas dcadas, um esforo significativo tem sido feito com vistas a desenvolver tratamentos baseados em luz e sua interao com as clulas [1, 2]. O efeito desejado obtido com essa interao , na maioria das vezes, a hipertermia, a qual pode ocorrer tanto diretamente quanto com dispositivos adjuvantes [3], como materiais plasmnicos nanoparticulados. Foi observado que a hipertermia promove alteraes na permeabilidade e na conformao das membranas celulares, porm pouco se sabe sobre a relao dessas alteraes e as taxas de morte celular observadas aps o tratamento. Ainda, alteraes no citoesqueleto so observadas aps o estmulo hipertrmico, o que leva a deformidades celulares e desregulao no ciclo celular. H tambm agregao de protenas da matriz nuclear desnaturadas, causando desregulao das funes celulares, tais como a sntese e o reparo de DNA e RNA [4].

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Estudos in vitro so os mais frequentemente realizados e tem mostrado que alguns segundos de irradiao com laser na regio do infravermelho prximo j so suficientes para comprometer a integridade das membranas [5], com mnimo dano s clulas sadias [6]. Por fim, a hipertermia capaz de ativar a morte celular, tanto por apoptose (morte celular programada) quanto por necrose, porm o mecanismo exato dessa ativao ainda incerto. Estudos indicam um aumento na atividade da protena p53 nas clulas tratadas hipertermicamente. Esta protena consiste em um dos mais importantes iniciadores da cascata apopttica, e sintetizada em grandes quantidades mediante o estmulo apopttico [4]. Bolhas na membrana plasmtica, comuns aps intervenes hipertrmicas, podem desencadear a apoptose, mas a via de sinalizao ainda desconhecida [6]. Ainda, quando clulas em fase S do ciclo celular so tratadas pela hipertermia, alguns fragmentos de DNA tendem a se fundir incorretamente, desencadeando a apoptose [7]. Dentre todos os dispositivos adjuvantes que podem auxiliar na terapia hipertrmica as nanopartculas metlicas, principalmente de prata e ouro, so muito promissoras, devido sua baixa toxicidade, flexibilidade conformacional e ressonncia plasmnica de superfcie com a luz nas regies do visvel e do infravermelho prximo. Esta ltima propriedade permite a gerao de calor pela radiao eletromagntica [8]. Uma nova conformao de nanopartculas metlicas tem chamado a ateno de pesquisadores, as chamadas nanobarras metlicas [9]. Elas so facilmente sintetizadas a partir de nanoesferas de ouro pr-formadas e apresentam uma maior rea de interao com a luz infravermelha por unidade de volume se comparadas s outras conformaes de nanopartculas. Aps a sntese, elas so, geralmente, recobertas por brometo de cetiltrimetilamnio (CTAB), um composto altamente citotxico [5]. Para prevenir uma toxicidade generalizada, comum optar-se pela modificao do recobrimento das partculas por molculas mais biocompatveis, como polietileno-glicol e quitosana [5, 10, 11, 12]. No entanto, h poucos dados na literatura indicando que o CTAB aderido superfcie das nanopartculas seja to txico quanto o CTAB livre na soluo [13]. Baseando-se em todos esses dados, este trabalho prope a investigao de nanobarras de ouro recobertas por CTAB utilizadas em tratamento hipertrmico, tendo em vista sua possibilidade de uso e eficcia. 2. Material e Mtodos 2.1. Sntese das nanobarras 2.1.1. Sntese das seeds 5 mL de uma soluo 0,2 mol L-1 de CTAB foram adicionados a 5 mL de uma soluo 5x10-4 mol L-1 de cloreto urico. Aps leve agitao 66 L de uma soluo 0,01 mol L-1 de boroidreto de sdio foi adicionada mistura, a qual foi agitada vigorosamente por dois minutos e depois deixada em repouso por 6 horas a 25 C e ao abrigo da luz [14]. 2.1.2. Sntese das nanorods 200 L de uma soluo 0,004 mol L-1 de nitrato de prata foi adicionada a 5 mL de uma soluo 0,2 mol L-1 de CTAB e a 5 mL de soluo 0,001 mol L-1 de cloreto urico. A soluo foi gentilmente agitada e adicionada de 70 L de cido ascrbico 0,0788 mol L-1, o que deixou a soluo incolor pela reduo do ouro. Finalmente, 12 L da soluo de seeds foi adicionada e a mistura foi deixada em repouso por 15 minutos a 27 C ao abrigo da luz. A mistura muda de cor, de incolor a vermelho, durante esse tempo [14].

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2.1.3. Influncia das seeds na sntese de nanobarras Para avaliar a influncia das seeds nas nanobarras, elas foram utilizadas aps 24, 48, 72 e 96 horas aps sua sntese. O espectro de absoro de ambas as nanopartculas foi analisado em espectrofotmetro, de 200 a 1000 nm. 2.2. Ensaio de citotoxicidade por MTT O ensaio de citotoxicidade por MTT [15] foi realizado para avaliar a toxicidade das nanobarras recobertas por CTAB. Foram usadas quatro linhagens celulares: HTC (provenientes de hepatoma murino), HT-29 (de cncer de clon humano), HepG2 (de hepatoma humano) e 786-O (de cncer renal humano). Todas as linhagens celulares foram cultivadas em frascos contendo meio DMEM suplementado com soro bovino fetal a 10% (Gibco) e mantidos em atmosfera de 5% CO2. Nestas condies, o ciclo de proliferao celular se completa em aproximadamente 24 horas. Neste experimento, foram testadas a soluo de nanobarras centrifugada (livre de CTAB solvel) e a soluo no centrifugada (que conservava o CTAB no meio). Concentraes partindo de 2 x 10 -7 a 2 x 10-3 microlitros de nanobarras por microlitro de meio foram utilizadas para a soluo no centrifugada, e de 0,01 a 0,2 microlitros de nanobarras por microlitro de meio de cultura foram utilizadas para a soluo centrifugada. Doxorrubicina a 0,125 mg/mL foi utilizada como controle de morte celular. 2.3. Animais experimentais Foram usados 18 camundongos Swiss machos, pesando entre 30 e 40 gramas, inoculados com clulas de tumor de Ehrlich e divididos em trs grupos experimentais. O grupo GN consistiu em 6 animais que receberam 100 L de soluo de nanobarras, porm no sofreram irradiao com laser infravermelho. J o grupo GL foi composto por 6 animais que receberem 100 L de soluo fisiolgica e sofreram irradiao por laser infravermelho. Por fim, o grupo GH foi formado por 6 animais que receberam 100 L de soluo de nanobarras e foram irradiados por laser infravermelho, caracterizando o tratamento hipertrmico. Outros 2 camundongos foram utilizados para a manuteno das clulas tumorais. Os animais foram mantidos no Biotrio do Programa de Ps Graduao Interunidades em Bioengenharia, na Escola de Engenharia de So Carlos, com ciclo de claro-escuro de 12 horas, alimento e gua ad libitum. 2.4. Manuteno das clulas tumorais As clulas do carcinoma de Ehrlich foram gentilmente cedidas pelo Dr. Rubens Cecchini, do laboratrio de Fisiopatologia de Radicais Livres, no Departamento de Patologia da Universidade Estadual de Londrina. O fluido asctico contendo clulas tumorais provenientes de um camundongo portador foi coletado e 100 L desse fluido fora inoculado intraperitonealmente em outro camundongo. O tumor se multiplicou por 10 dias antes que fosse novamente transplantado para outro animal [16, 17]. 2.5. Inculo do tumor de Ehrlich Uma soluo contendo 2,0 x 106 clulas tumorais, proveniente do lquido asctico dos animais de manuteno do tumor, foi inoculada na regio inguinal esquerda dos camundongos [18]. Quando o dimetro dos tumores atingiu em torno de 10 mm, o tratamento hipertrmico foi realizado.

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2.6. Tratamento hipertrmico Quando os tumores atingiram 10 mm de dimetro, 100 L de soluo de nanobarras em uma densidade ptica de 0,5 a 800 nm foi administrada via veia caudal. Os animais do grupo GL receberam 100 L de soluo salina fisiolgica estril e 72 horas depois os animais foram anestesiados com 10 mg/Kg de xilazina e 100 mg/Kg de quetamina. A regio tumoral dos animais do grupo GL e GH foi irradiada com laser no infravermelho prximo (808 nm, 2 W/cm2) por 5 minutos minutos [19]. A temperatura do tumor e das regies peritumorais foi mensurada.

3. Resultados

3.1. Influncia das seeds nas nanobarras O espectro das seeds tende a formao de um pico em torno de 512 nm aps 48 horas de sua sntese (figura 1), indicando que tanto elas quando as nanobarras tm sua razo de proporo e seu tamanho dependentes da idade das seeds. A formao do pico aps 96 horas sugere o aumento do dimetro das seeds, ou seja, sua sntese continua acontecendo aps as 6 horas em repouso descritas na literatura.
CTAB 24 hours 48 hours 72 hours 96 hours

0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 -0,1 300 400 500 600 700 800

Absorbncia

900

1000

comprimento de onda (nm)

Figura 1. Espectro de absoro das seeds aps 24 (1), 48 (2), 72 (3) e 96 (4) horas de sua sntese.

Foi observado que aps 48 horas da sntese das seeds o pico de absoro das nanobarras necessrio para o tratamento hipertrmico tende a se deslocar para o azul, at se fundir com o pico menor de absoro, em torno de 512 nm. Antes de 48 horas no h modificao do espectro de absoro (Figura 2). Observa-se, ento, que para seeds com maior dimetro, naturalmente a razo de proporo das nanobarras tende a diminuir, uma vez que, mesmo que o comprimento das nanobarras permanea inalterado, seu dimetro estar aumentado.

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2,0

1,5

CTAB Particulas.1 Particulas.2 Particulas.3 Particulas.4

Absorbncia

1,0

0,5

0,0

-0,5 400 600 800 1000

Comprimento de onda (nm)

Figura 2. Espectro de absoro das nanobarras formadas aps 24 (1), 48 (2), 72 (3) e 96 (4) horas da sntese das seeds. 3.2. Ensaio de citotoxicidade MTT O ensaio de citotoxicidade revelou que quando as clulas so incubadas em um meio contendo 2x10 -4 L de soluo de nanobarras no centrifugadas por microlitro de meio, esta grande diluio suficiente para eliminar de 40 a 80% das clulas, sendo observados 100% de morte celular para uma concentrao de 0,002 L/L de meio DMEM (figura 3). Por outro lado, solues livres de CTAB no meio apresentaram citotoxicidade em mdia mil vezes menor e este efeito txico s foi considerado relevante na concentrao de 0,1 L/L de meio (50 vezes mais concentrado do que a diluio mais citotxica da outra soluo). Esta concentrao maior do que a utilizada em tratamentos in vivo.

Figura 3. Porcentagem de morte celular aps inoculao com soluo no centrifugada de nanobarras.

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Figura 4. Porcentagem de morte cellular aps inoculao com soluo centrifugada de nanobarras. 3.3. Tratamento hipertrmico Durante o tratamento hipertrmico, a temperatura da base do tumor aumentou para 52 C (um aumento de aproximadamente 20 graus) nos animais do grupo GL, enquanto que no houve aumento de temperatura na regio perifrica. Houve um aumento de 47 C na temperatura da base do tumor dos animais do grupo GH, 36 graus mais intensa que na regio perifrica ao tumor (figura 5). Aps o tratamento, houve uma evidente reduo do volume tumoral, como mostra a figura 6.

55

Grupo GL
50
Temperatura (C)

tumor boca
Temperatura (C)

80

Grupo GH

borda tumor

70

45

60

40

50

35

40

30 01:14:50 01:16:30 01:18:10 01:19:50 01:21:30 01:23:10

30 02:21:10 02:22:50 02:24:30 02:26:10 02:27:50 02:29:30 02:31:10

tempo

tempo

Figura 5: Aumento de temperatura na base do tumor dos animais dos grupos GL e GH durante a irradiao.

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Figura 6: Resultados macroscpicos da hipertermia. direita, um camundongo antes da irradiao. esquerda, o mesmo camundongo aps a irradiao

4. Discusso Tendo em vista a falta de tratamentos eficientes e confiveis, o cncer um dos alvos de pesquisa mais comuns atualmente. Avanos tem sido obtidos nas intervenes teraputicas baseadas em campos eletromagnticos, luz e at mesmo em antimatria [20, 21]. A terapia fototrmica, a qual danifica as estruturas tumorais diretamente ou com o auxlio de dispositivos adjuvantes tais quais as nanopartculas metlicas, uma das mais promissoras intervenes teraputicas. As nanobarras de ouro, facilmente sintetizadas pelo mtodo de seeding, apresentam uma rea relativamente grande para interao com a luz e, em consequncia, intensa ressonncia plasmnica de superfcie, podendo ter seus picos de ressonncia ajustados de acordo com sua razo de proporo. Foi possvel observar que o tempo decorrido desde a sntese das seeds influencia diretamente a razo de proporo das nanobarras, especialmente aps 48 horas. As seeds tendem a aumentar seu raio, o que pode se inferir pelo aparecimento de um pico de absoro em torno de 512 nm, enquanto que as nanobarras tendem a se tornar cada vez mais esfricas, o que pode ser evidenciado pela fuso dos dois picos de ressonncia. O espectro resultante tpico de uma nanoshell [22]. O CTAB utilizado na sntese das nanobarras altamente citotxico, sendo comumente retirado da superfcie das nanobarras em troca de outro biopolmero [5, 10, 11, 12]. No entanto, alguns estudos indicam que o CTAB aderido superfcie das nanobarras no apresenta citotoxicidade [13], fato que foi confirmado pelos nossos resultados. Mostramos que no h a necessidade de modificao do recobrimento das nanobarras, desde que o CTAB livre na soluo seja eliminado aps ciclos de lavagem e centrifugao. Deste modo, o tratamento hipertrmico se torna mais acessvel e mais simples. Tambm foi possvel observar que somente a irradiao com laser em potncia de 2 W/cm2 j suficiente para iniciar ao menos a cascata apopttica, uma vez que houve um aumento de 20 C na base do tumor [1, 2]. Se tratados com nanobarras, o aumento pode chegar a 47 C, tornando praticamente impossvel a sobrevivncia das clulas tumorais. Houve, para confirmar a eficcia do tratamento, uma reduo marcante no volume tumoral aps a hipertermia, provavelmente concomitante morte celular por necrose [23, 24]. 5. Concluso Nossos resultados contribuem para o entendimento dos fatores que influenciam na sntese das nanobarras, a exemplo do tempo desde a sntese das seeds. Ainda, nossos dados indicam que a necrose

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a via de morte celular iniciada aps o tratamento hipertrmico com nanobarras e que este tratamento tem grande eficcia. Mais estudos devem ser feitos para investigar os mecanismos moleculares do tratamento hipertrmico, bem como para verificar a eficcia da eliminao de tumores e preveno de metstases, por meio do acompanhamento da sobrevida dos animais. 6. Referncias [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] Nadejda R, Jinzhong Z 2009 Science in China Series B-Chemistry, 52 1559-1575 von Maltzahn G, Park J-H, Agrawal A, Bandaru N K, Das S K, Sailor M J, Bhatia S N 2009 Cancer Research 69 OF1-OF9 Hu M, Chen J, Li Z-Y, Au L, Hartland G V, Li X, Marquez M, Xia Y 2006 Chemical Society Reviews, 35 1084-1094 Hildebrandt B, Wust P, Ahlers O, Dieing A, Sreenivasa G, Kerner T, Feliz R, Riess H 2002 Critical Reviews in Oncology/Hematology 43 33-56 Huff T B, Tong L, Zhao Y, Hansen M N, Cheng J-X, Wei A 2007 Nanomedicine 2 125-132 Lapotko D, Lukianova E, Potapnev M, Aleinikova O, Oraevsky A 2006 Cancer Letters 239 3645 Bullivant J P 2008 Stable Superparamagnetic fluids for the treatment of secondary liver cancer by hyperthermia (Dissertao) University of Florida, Flrida, Estados Unidos. Hirsh L R, Gobin A M, Lowery A R, Tam F, Drezek R A, Halas N J, West J L 2006 Annals of Biomedical Engineering 34 15-22 Wei Z, Mieszawska A J, Zamborini F P 2004 Langmuir 20 4322-4326 Kelly K L, Coronado E, Zhao L L, Schatz G C 2003 The Journal of Physical Chemistry B 107 668-677 Sugunan A, Thanachayanont, C.; Dutta J, Hilborn J G 2005 Science and Technology of Advanced Materials 6 335-340 Hansen M N, Chang L-S, Wei A 2008 Supramolecular Chemistry 20 35-40 Pissuwan D, Valenzuela S M, Cortie M B 2008 Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 25 93-112 Murphy C J, Jana N R 2002 Advanced Materials 14 80-82

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