PRCTICA N2: DETERMINACION DE PROTEINAS METODO DE BIURET Modulo: Energa y Consumo de Sustancias Fundamentales Docente: Erik Osvaldo Snchez

Alumnos:Flores Cruz Diana Karen. Martnez Ramrez Carolina. Snchez

Paniagua Gabriel Ivn. Ziga Hernndez Anglica.

OBJETIVOS:

Manejar en el laboratorio el mtodo de Biuret para determinar protenas Observar y determinar experimentalmente el efecto del pH sobre las protenas de la leche.

Generalidades: Investigacion bibliogrfica de los estudiantes sobre colorimetria y punto isoelctrico de protenas.

MATERIAL POR EQUIPO: 1probeta de 50 ml. 2 gradillas. 2 pipetas de 10 ml. 3 pipetas de 5 ml. 1 pipeta de 1 ml. 12 tubos de 15x 100. 1 vaso de precipitado de 100ml. 12 tubos de 16 x 150. 1 balanza granataria Papel parafilm para 10 tubos. 1 embudo y papel filtro

Reactivos por equipo: Agua destilada Solucion de acido actico 0.1 N Solucion de acetato de sodio 0.1 N

Solucion de casena ( Concentracion 4 mg/ Ml) Reactivo de Biuret 50 Ml

NOTA: El xito de esta practica depende en gran parte de la limpieza del material. Asegurese que todo esteperfectamente limpio. Aparatos por equipo. 1 Centrifuga clnica 1 Balanza granataria 2 Espectofotometros 4 Celdas

LOS ALUMNOS DEBERAN TRAER POR EQUIPO: Franela Jabn Cloro 6gr. Aproximadamente de leche en polvo descremada Masking-Tape, plumn de tinta indeleble.

INTRODUCCIN: Caseina. La leche contiene vitaminas (principalmente tiamina, riboflavina, cido pantoteico y vitaminas A, D y k), minerales (calcio, potasio, sodio, fosforo y metales en pequeas cantidades), protenas (incluyendo todos los aminocidos esenciales), carbohidratos (lactosa) y lpidos. Los nicos elementos importantes de los que carece la leche son el hierro y la vitamina C. Las protenas se pueden clasificar de manera general en protenas globulares y fibrosas. Las protenas globulares son aquellas que tienden a agregarse en formas esferoidales y no establecen interacciones intermoleculares como son los puentes de hidrogeno (caracterstico de las protenas fibrosas) siendo solubilizadas en suspensiones coloidales En al leche hay tres clases de protenas: casena, lactato albuminas y lactato globulinas (todas globulares). La casena es una protena conjugada de la leche del tipo fosfoprotena que se separa de la leche por acidificacin y forma una masa blanca. Las fosfoprotenas son un grupo de protenas que estn qumicamente unidas a una sustancia que contiene acido fosfrico, en la casena la mayora de los grupos

fosfato estn unidos por los grupos hidroxilo de los aminocidos serina y treonina. La casena en la leche se encuentra en forma de sal clcica (caseinato clcico). La casena representa cerca cerca del 77% al 82% de las protenas presentes en la leche y el 2.7 % en composicin de la leche liquida. La casena esta formada por (s1), (s2), casena y kappa - casena formando una micela o unidad soluble. Ni la alfa ni la beta casena son solubles en la leche, solas o combinadas. Si se aade la kappa casena a las dos anteriores o a cada una de ellas por separado se forma un complejo de casena que es solubilizado en forma de micela. Esta micela esta solubilizada por la kappa casena mientras que las alfas y betas son fosfoprotenas que precipitan de iones calcio. O Protena O P - O- + Ca2+ O Insolubles La kappa casena, sin embargo, tiene pocos grupos fosfato y un alto contenido d carbohidratos unidos a ella. Tambin tiene todos sus residuos de serina y treonina con sus correspondientes grupos hidroxilo, as como los carbohidratos dispuestos en una sola cara de su superficie por lo que esta parte exterior es fcilmente soluble en agua gracias a los grupos polares que posee. La otra parte de su superficie se une fcilmente al alfa y la beta casena insoluble, lo que da lugar a la formacin de la micela. O protena O P- O O-Ca2+ O

La propiedad caracterstica de la caseina es su baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la leche es 6,6 aproximadamente, estando a ese pH la caseina cargada negativamente y solubilizada como sal clcica. Se aade acido a la leche, la carga

negativa de la superficie de la micela se neutraliza (los grupos fosfato se protonan) y la protena neutra precipita Ca2+ Caseinato + 2HCl Casena + CaCl2

La conformacin de la caseina es similar a las protenas desnaturalizadas globulares. El alto numero de residuos de prolina en la caseina causa un especial plegamiento en la cadena de protena e inhibe la formacin de una fuerte y ordenada estructura secundaria. La caseina no contiene puentes di sulfuro. De igual manera la falta de estructura secundaria es importante para la estabilidad de la caseina frente a la desnaturalizacin por calor. La carencia de estructura terciaria facilita la situacin al exterior de los residuos hifrofbicos lo que facilita la unin entre unidades proteicas y la convierte en prcticamente insolubles en agua. En cambio es fcilmente dispersable en lcalis diluidas y en soluciones salinas tales como oxalato sdico y acetato sdico. Punto isolectrico. Todas las macromolculas de la naturaleza adquieren una carga cuando se dispersan en agua. Una caracterstica de las protenas y otros biopolmeros es que la carga toral que adquieren depende del pH del medio. Asi, todas las protenas tienen una carga neta dependiendo del pH del medio en el que se encuentren y de los aminocidos que la componen, as como de las cargas de cualquier ligando que se encuentre unido a la protena de forma covalente (irreversible). Debido a la composicin en aminocidos de la protena, los radicales libres pueden existir en tres formas dependiendo del pH del medio: catinicos, neutros y aninicos. Cualquier protena tendra una carga neta positiva si se encuentra en un medio lo suficientemente acido debido a que los grupos COOH de los aminocidos asprtico y glutmico estaran en su forma neutra pero los grupos amino de Arginina y lisina estaran protonados (-NH3+) De igual forma si la protena se encuentra en un medio con un pH muy alto estara cargada negativamente ya que en este caso los grupos carboxilo estaran des protonados (COO-) y los grupos amino estaran en su forma neutra (NH2). Ley de Beer- Lambert Esta ley expresa la relacin entre absorbancia de la luz monocromtica 8de longitud de onda fija) y concentracin de un cormoforo en solucin: A= log l/lo= cl

La absorbencia de una solucin es directamente proporcional a su concentracin- a mayor numero de molculas mayor interaccin de la luz con ellas-; tambin depende de la distancia que recorre la luz por la solucin- a igual concentracin, cuanto mayor distancia recorre la luz por la muestra mas molculas se encontrara-; y por ultimo, depende de , una constante de proporcionalidaddenominada coeficiente de extincin- que es especifica de cada cromforo. Como A es a dimensional, las dimensiones de dependen de la c y l. la segunda magnitud (l) se expresa siempre en cm mientras que la primera se hace, siempre que sea posible, en M, con lo que las dimensiones de resultan ser M - cm -. Este coeficiente asi expresado, en trminos de unidades de concentracin molar (o un submltiplo apropiado), se denomina coeficiente de extincin molar ( M). Cuando, por desconocerse el peso molecular del soluto, la concentracin de la dilusion se expresa en otras unidades distintas de M, por ejemplo g. L-, las dimensiones de resultan ser distintas, por ejemplo g -. L cm -, y al coeficiente asi expresado se denomina coeficiente de extincin especifico (s). La ley de Lambert- Beer se cumple para soluciones diluidas; para valores de c altos, varia con la concentracin, debido a fenmenos de dispersin de la luz, agregacin de molculas, cambios del medio, etc. Transmitancia. La transmitancia de una sustancia en solucion es la relacin entre la cantidad de luz transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, It,Y la cantidad de luz que incidio sobre ella, Io, y se representa normalmente en tanto por ciento: % T= It/Io x 100 La trasmitancia nos da una medida fsica de la relacin de intensidad incidente y trasmitida al pasar por la muestra. La relacin entre % T y la concentracin no es lineal, pero asume una relacin logartmica inversa. Absorbancia. Absorbancia es un concepto ms relacionado con la muestra puesto que nos indica la cantidad de luz absorbida por la misma, y se define como el logaritmo de 1/T en consecuencia : A = log 1/T = -log T = -log It/ Io. Cuando la intensidad incidente y trasmitida son iguales (lo= lt), la trasmitancia es del 100% e indica que la muestra no absorbe a una determinada longitud de onda, y entonces A vale log 1= 0 La cantidad de luz absorbida depender de la distancia que atraviesa la luz a travs de la solucin del cromforo y de la concentracin de este

Espectofotometro. Sirve para medir; en funcin de la longitud de onda, la relacin entre valores de una misma magnitud fotomtrica relativa a 2 haces de radiacin y la concentracin o reacciones qumicas que se miden en una muestra Pueden ser de absorcin atmica o de masa y visuales Tiene la capacidad de proyectar un haz de la luz monometrica a travs de un muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra, eso permite realizar 2 funciones 1. Dar informacin sobre la naturaleza de la sustancia 2. Indicador directamente que la cantidad de la sustancia que interesa esta presente en la muestra

Reaccion de biuret La presencia de protenas en una mezcla se puede determinar mediante la reaccin del Biuret. El reactivo de Biuret contiene CuSO 4en solucin acuosa alcalina (gracias a la presencia de NaOH o KOH). La reaccin se basa en la formacin de un compuesto de color violeta, debido a la formacin de un complejo de coordinacin entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrgeno que forma parte de los enlaces peptdicos. La reaccin debe su nombre al biuret, una molcula formada a partir de dos de urea (H2N-CO-NH-CO-NH2), que es la ms sencilla que da positiva esta reaccin, comn a todos los compuestos que tengan dos o ms enlaces peptdicos consecutivosen sus molculas Ecuacion Henderson Hasselbach. Considera la ionizacin de un cido dbil HA que tiene algn valor de pK a. Es conveniente poder relacionar el pH de una disolucin de un cido dbil con su pKa y con el grado de ionizacin. La reaccin sera: HA H+ + A-

La constante de disociacin del cido (Ka) para esta reaccin, vendra dada por la ecuacin

Esta ecuacin se puede reorganizar para despejar la concentracin de iones hidrgeno porque, recuerda, queremos una ecuacin que relacione el pH de la disolucin con el pKa y con el grado de ionizacin del cido dbil. La forma en la que queda la ecuacin es

Por definicin, log (1/ [H+]) = pH y log (1/Ka) = pKa, as que, aplicando logaritmos a la ecuacin anterior, obtenemos

Esta es la conocida ecuacin de Henderson-Hasselbalch que se utiliza a menudo para realizar los clculos que requiere la preparacin de disoluciones tampn en el laboratorio, o para otras aplicaciones. Fjate en varios aspectos interesantes relacionados con esta ecuacin. Primero, si pH = pKa, el logaritmo de la relacin de concentraciones de las formas disociada y sin disociar ser cero, de manera que estas concentraciones sern iguales. En otras palabras, cuando el pH es igual al pK a, el cido estar disociado al 50%. Segundo, cuando el pH aumenta o disminuye una unidad en relacin con el pKa, la relacin entre las formas del cido disociado y sin disociar cambia en un factor de 10. Es decir, si el pH de una disolucin es 6 y el pK a es 7, la relacin [A]/[ HA] ser 0,1; si el pH fuera 5, la relacin sera 0,01 y si el pH fuera7, la relacin sera 1. Tambin, si el pH est por debajo del pK a, la relacin es < 1, mientras que si el pH est por encima del pKa, la relacin ser >1. Resumiendo, la ecuacin de Henderson-Hasselbalch aporta mucha informacin. Debes estudiarla para comprender todo lo que deriva de ella.

DESARROLLO: 1. 1. DETERMINACIN DEL PUNTO ISOELECTRICO

1.1 preparacin de una serie de tubos con solucin amortiguadora de acetatos. Coloca en una gradilla 6 tubos de 15 x 100 rotulados con nmeros consecutivos.

Adiciona a cada tubo las soluciones acido actico y acetato de sodio que indica la siguiente tabla: TUBO 1 2 3 4 5 6 SOLUCION ACETICO 0.1 N 5ml 4ml 3ml 2ml 1ml ACIDO SOLUCION ACETATO DE SODIO 0.1 N 1ml 2ml 3ml 4ml 5ml

El volumen final de cada tubo deber ser de 5 ml.

PREPARACION DE LA LECHE

2.1 En un vaso de precipitado de 100ml disuelve 6gr. De leche en polvo descremada, con 560ml de agua destilada NOTA: aade el agua poco a poco para evitar que se formen grumos que podran dificultar la obtencin de una solucin homognea. No debes calentar la leche para disolverla.

2.2 En un tubo de ensaye de 16 x 150 mm mide 2 ml de la leche rehidratada preparada como se indic anteriormente y aade 8 ml de agua destilada, agita cuidadosamente por inversin. Esta muestra de leche diluida (1:5) se ocupara para llevar a cabo la determinacin del punto isoelctrico de las protenas descrito en el siguiente prrafo:

3.

PUNTO ISOELECTRICO

3.1 Aade 1ml de la leche diluida (1:5) a cada tubo de solucin amortiguadora que preparaste en el punto 1

3.2 Mezcla cuidadosamente por inversin todos los tubos y deja reposar por espacio de 10 min. Observa el aspecto de las mezclas preparadas. En el tubo donde observes grumos de leche suspendidos en la solucin te indicara que las protenas de la leche se han insolubilizado debido al pH de la solucin este pH es denominado PUNTO ISOELECTRICO

3.3 Centrifuga los tubos a 2500 r.p.m durante 10 min NO SIN ANTES BALANCEARLOS. Debern pesar lo mismo que aquel tubo que ocupara e lugar opuesto dentro de la centrifuga

3.4 Separa el sobrenadante (cuidando de no suspender el precipitado acumulado en el fondo del tubo) y transfiere a tubos limpios de 15 x 100 rotulados con el nmero de tubos que les corresponde

4.

DETERMINACIN DE PROTENAS CON EL METODO DE BIURET

4.1 COLOCA EN UNA GRADILLA 11 tubos de 16 x 150 mm, rotula uno de ellos como nmero cero, el cual llevara los reactivos para calibrar el espectrofotmetro (blanco de reactivos o testigo) los siguientes 4 tubos llevaran nmeros consecutivos del 1 al IV y los restantes (del 1 al 6) los rotularas con el nmero que corresponda a los sobrenadantes obtenidos por centrifugacin segn se indic en el punto 3.4

4.2 Aade a cada tubo los reactivos para determinar protenas en la curva de calibracin (tubos I a IV) y en los sobrenadantes (tubos 1 a 6) de acuerdo a lo indicado en la siguiente tabla: CURVA DE CALIBRACIN Tubo Solucin Patrn 0 0 ml I 0.2 ml II 0.4 ml III 0.6 ml IV 0.8 ml V 1 TUBOS DE PROBLEMA 2 0 0 0.5 0 0 0 0 0.5 ml 3 0 0 0 0.5 0 0 0 0.5 ml 4 0 0 0 0 0.5 0 0 0.5 ml 5 0 0 0 0 0 0.5 0 0.5 ml 6 0 0 0 0 0 0 0.5 0.5 ml

1 ml 0 0 0 0 0 0 0 0.5 0 0 0 0 0 0.5 0 ml ml

4 mg/ml Sobrenadante 0 Sobrenadante 0 Sobrenadante 0 Sobrenadante 0 Sobrenadante 0 Sobrenadante 0 Agua Reactivo Biuret (ml)

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.8 0.6 0.4 0.2 1 ml ml ml ml ml de 4.0 ml a todos los tubos

NOTA: mezcla cuidadosamente cada reactivo y deja en reposo 30 min para favorecer el desarrollo de color. Antes de iniciar tus lecturas en el espectrofotmetro, previo calentamiento de 15, es necesario calibrarlo con el blanco de reactivos a una absorbancia de cero, con una longitud de onda de 570 mm Si observas alguna turbidez en alguno de los tubos, es conveniente que filtres antes de hacer la lectura.

5.

RESULTADOS

5.1. Al usar el espectofotometro los valores que obtuviste son la absorbancia o densidad ptica (D.O) Anota tus resultados en la siguiente tabla Tubo D.O I
0.029

II
0.055

III IV V 1 2 3 4 5 6 .091 .118 .155 .182 .161 .055 .048 .032 .155 2.3 3 4 4.6 4.1 1.4 1.2 0.8 4

Mg. De 0.7 protena

1.4

5.2. Calcula el contenido proteico de los tubos I A IV de acuerdo alvolumen empleado de la solucin en estndar de casena y colocalos en el eje X. Coloca los valores de O.D. obtenidos para cada uno de los tubos en el eje Y y traza la curva correspondiente. Interpola los valores de O.D. de los tubos 1-6, calcula la cantidad de protena presente en cada sobrenadante. Para calcular los mg/mL de protena debes multiplicar el valor de mg interpolado de la curva de calibracin por el factor de dilucin de la leche. ANOTA LOS RESULTADOS OBTENIDOS EN LA SIGUIENTE TABLA: Protena Sobrenadante 1 Sobrenadante 2 Sobrenadante 3 Sobrenadante 4 Sobrenadante 5 Sobrenadante 6 mg/ml 4.6 4.1 1.4 1.2 0.8 4.0 Mg/100ml 460 410 140 120 80 400

5.3. Haciendo uso de la ecuacion de Heenderson- Haselbach calcula el Ph del tubo donde observaste la mayor precipitacion de caseina .

PH=Pk+Log A/ HA PH= 4.76+log (0.06/0.04)

PH= 4.9360

5.4. Describa brevemente la Ley de Rambert y Beer y cuales son sus limitaciones. Resultados: Punto isoelectrico: La determinacion del punto isoelectrico de la solucion de leche, se detrmino a los 30 min. Despues de agregar la leche a los tubos con solucion de acido acidoactico 0.1 N y Solucin de acetato de sodio 0.1 N, esto nos demuestra que debido al pH presente en la solucin, las protenas presentes en la leche rehidratada se desnaturalizaron, esto es provocado ya que existe un despegamiento y desorganizacin de la estructura terciaria y secundaria de estas protenas, como la mayora de las protenas desnaturalizadas sin difcilmente de reorganizarse y permanecen asi permanente, lo que les causa ser insolubles por la desorganizacin de los aminocidos, una protena hidrosoluble existen a. a. polares que se encuentran en la parte externa de la protena y los no polares se encuentran dentro, cuando se presenta esta desorganizacin se invierten la posicin de los a.a y esto genera la insolubilidad en el medio acuoso por lo cual genera que precipitan en la solucin.

Determinacionde absorbancia y mg de proteina presentes en las soluciones (leche y caseina) Tubo D.O D.O leche I III IV 0.029 0.055 .091 .118 .161 .055 .048 II V .155 .032 .155

2 .182

0.2 0.18 0.16 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 1 2 3 4 5 6 0.029 0.055 0.091 0.055 0.118 D.O D.O2 0.048 0.032 0.182 0.161 0.155 0.155

DETERMINACION DE mg DE PROTEINAS DE SOLUCIONES

Mg. De protena (caseina) Mg. De protena (leche)

0.7 4.6

1.4 4.1

2.3 1.4

3 1.2

4 0.8 4

5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 1 2 3 4 5 6 0.7 1.4 2.3 1.4 3 Mg. De protena (caseina) Mg. De protena (leche) 1.2 0.8 4.6 4.1 4 4

Conclusiones. El metodo utilizado para la determinacion de proteinas de Biure, consiste en la realizacin

de solucin colorimtrica, la cual se mide a travs de la espectrofotometra, donde a mayor concentracin de soluto existir mayor color en la solucin por lo cual absorber mayor cantidad de luz emitida por el espectrofotmetro, dentro de este mtodo se determin el punto isoelctrico, que demuestra que las protenas a un pH determinado pierden su propiedades y se desnaturalizan provocando que estas sean insolubles en la solucin y precipiten.