Espectrometra de masas Instrumentacin y aplicaciones

MALDI-MS

ESI-MS

Espectrometria de Masa
What is Mass Spectrometry? John B. Fenn, the originator of electrospray ionization for biomolecules and the 2002 Nobel Laureate in Chemistry, probably gave the most apt answer to this question: Mass spectrometry is the art of measuring atoms and molecules to determine their molecular weight. Such mass or weight information is sometimes sufficient, frequently necessary, and always useful in determining the identity of a species. To practice this art one puts charge on the molecules of interest, i.e., the analyte, then measures how the trajectories of the resulting ions respond in vacuum to various combinations of electric and magnetic fields. Clearly, the sine qua non of such a method is the conversion of neutral analyte molecules into ions. For small and simple species the ionization is readily carried by gas-phase encounters between the neutral molecules and electrons, photons, or other ions. In recent years, the efforts of many investigators have led to new techniques for producing ions of species too large and complex to be vaporized without substantial, even catastrophic, decomposition.

Espectrometria de Masa Espectrometria de Masa (MS: Mass spectrometry) Espectroscopia o Espectrometria??

Tcnica analtica determina la masa molecular de una muestra la relacin masa(m):carga (z); m/z

Analoga entre un espectrmetro de masa y un prisma

Espectrometria de Masa Espectrometria de Masa (MS: Mass spectrometry) Espectroscopia o Espectrometria??

Tcnica analtica determina la masa molecular de una muestra la relacin masa(m):carga (z); m/z

Energa
f 1+ f3+ f4+ f3
+

f2

M+ f1+

M
muestra

M+
ionizacin
f4+ f2+

fragmentacin separacin m/z

Espectro de Masa

Espectrometria de Masa - Espectro

Espectro de MASA de una molcula, % de abundancia relativa vs. relacin MASA/CARGA

Espectro de Masa de metanol

Espectrometria de Masa Espectrometria de Masa Informacin ?

Identificacin de compuestos desconocidos (masa del compuesto o de sus fragementos) biomolculas grandes, presicin de 0.01% (40.000 Da error de 4Da) molculas pequeas, presicin de 5 ppm o menores (suficiente para confirmar la masa molecular de un compuesto) determinar la composicin isotopica de un elemento en una muestra determinar la estructura de un compuesto (patrn de fragmentacin) cuantificacin de un compuesto en una mezcla (diseo de mtodo, MS no e stcnica cuantitativa)

Espectrometria de Masa Espectrometria de Masa Aplicacin ?

Industrial o Acadmica (para procesos de rutina o de investigacin) Campos de aplicacin: Bioqumica-Biotecnologa: anlisis de protenas, peptidos, oligonuclotidos Qumica farmacutica: descubrimiento de drogas, qumica combinatoria, farmacocintica, metabolismo de drogas Bioqumica clnica: test de drogas Analisis Ambientales: calidad de agua, contaminacin de alimentos Geologa: composicin de hidrocarburos

Espectrometria de Masa Revisin histrica

1897 J.J. Thomson, primer medida m/q de partculas elementales corpsculos 1918-1919 A. Dempster & F. Aston, primer espectrgrafo de masa 1951 W. Pauli & H. Steinwedel, espectrmetro de masa de cuadrupolo 1959 K. Biemann, MS electroionizacin aplicada a pptidos 1968-1970 M. Dole, polimeros naturales y sintticos en fase gaseosa a presin atmosfrica 1974 D. Torgerson, plasma desorption MS (fisin de 252Cf) 1974 B. Mamyrin, contribucin al desarrollo de TOF MS 1978 N. Commisarow & A. Marshall, adaptacin de mtodos de transformadas de Fourier a ICRS, ion cyclotron resonance spectrometry 1981 M. Barber, FAB; fast atom bombardment, masa de Met-Lys-bradykinin M=1318 1984 R. Willoughby & M. Aleksandrov (trabajos independientes) proponen acoplar LC a MS 1988 J. Fenn & M. Yamashita (trabajos independientes) macromolculas biolgicas en fase gaseosa a presin atmosfrica, ESI, electrospray ionization. M. Karas & F. Hillencamp y K. Tanaka (trabajos independientes) desrrollan MALDI, matrix assisted laser desorptionionization. 2002, K. Tanaka recibe premio Nobel. 1992-1999 Especificidad y Sensibilidad MALDI-MS 2000-presente Desarrollo de MS como tcnica analtica en ciencias biolgicas

Espectrometria de Masa Aplicaciones Biolgicas

Desde 1930, MS tcnica analtica importante para Biologa Estructural Produccin de iones de alto peso molecular en fase gaseosa (macromolculas biolgicas) Desarrollo de tcnicas de ionizacin como FAB, MALDI, ESI Desarrollo de mtodos ultrasensibles para caracterizacin de protenas basados en Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (FTIR-MS), lmite de deteccin de 30 zmol (30x10-21mol) para protenas de masa molecular 8 20 kDa.

Utilizacin de MS: Determinacin precisa de masa molecular de protenas y ac. nuclecos, amplio rango de masas Secuenciacin de pptidos y oligonucletidos Identificacin de modificaciones post-traduccionales Cambios estructurales en protenas, plegamiento y dinmica Identificacin de protenas (cantidades subpicomolares) de 2D-electroforesis Identificacin de marcado isotpico

Espectrometria de Masa Iones en campos elctricos y magnticos

in acelerado por una fuente externa, adquiere E. cintica (Ekin)
Z: carga del ion Vacc: diferencia de potencial en regin de aceleracin m: masa del ion v: velocidad del ion

Ekin= z * Vacc =

mv2 2

partcula cargada, en campo magntico homogneo (B), perpendicular a trayectoria, fuerza de Lorentz F, trayectoria, crculo de radio r.

mv2 F = zvB = r
Partcula cargada en campo Elctrico y Magntico

Relacin m/z

m Z

B2r2 = 2V acc

Espectrometria de Masa Resolucin de masa y presicin de masa

m m+m m

Resolucin, R: medida de la habilidad de un instrumento para separar iones de masas similares, m y m+m, de igual intensidad, con superposicin de seal de 10%

R=m/m
10%

Ejemplo: R=1000 (sector magntico), permite separar masas de 1000 y 1001 Da. R=100000, permite distinguir masas de 100000 y 100001 Da, 10 ppm.

Definir la extensin de la superposicin de picos adyacentes 10% valley definition (2 picos adyacentes contribuyen con 5%) Full width, half maximun (FWHM),masa del pico (Da) dividido el ancho del pico a la mitad de la altura R (FWHM) aprox. 2 veces R (10%)

Espectrometria de Masa Resolucin de masa y presicin de masa

Figure 2.2. The resolution is determined by the measurement of peaks m/z and FWHM , in this case m/z = 500 and the FWHM = 1.

Espectrometria de Masa Resolucin de masa y presicin de masa

Presicin de la medida de masa molecular es la diferencia entre la masa medida y la calculada para cierto in Expresada como: % de la masa medida: masa molecular = 100000.01% o ppm de la masa medida: masa molecular = 10000100ppm

- Presicin en las determinaciones de masa molecular, no requieren alta resolucin - Factor limitante en la presicin de la determinacin de masa molecular para macromolculas de alta masa es la superposicin de picos

Espectrometria de Masa

Error y Precisin segun la masa molecular

Para molculas pequeas Error menores de 5 ppm permiten identificar la formula molecular inequivocamente Ej: C23H37NO3 Masa esperada 375.27734 uma C23H37NO3 Masa encontrada 375.27652 uma Error = [(375.27734- 375.27652)/ 375.27734] * 1E6 = 2.2 ppm = Diferencia = 0.00082 uma Para biomoleculas de alto MW se pueden determinar con alrededor de 0.5 Da Ej.: PM 50 kDa con 2.2 ppm de error masa encontrada 50000.11 Da Diferencia = 0.11 uma 1 Da = 1 uma

Espectrometria de Masa Resolucin de masa y presicin de masa, masa promedio

Espectrometria de Masa Resolucin de masa y presicin de masa, masa promedio

Espectrometria de Masa
Espectrmetro de Masa
Primer espectrmetro de masa: 1913, J.J. Thomson Campos elctricos y magnticos fijos para separar istopos de Ne, por diferencia de comportamiento de partculas cargadas (diferentes momentos y energas) en un campo electromagntico.

SAMPLE

ION SOURCE

MASS ANALYZER

DETECTOR

DATA ANALYSIS

Espectrometria de Masa
Espectrmetro de Masa Tratamiento de la muestra INYECCIN de la muestra, directa o con tratamiento previo (sample injector) IONIZACIN de la muestra (ion source) SEPARACIN de los iones con diferentes m/z (mass analyzer) DETECCIN del nmero de iones producidos (detector) COLECCIN de datos, generacin del espectro de masa

Espectrometria de Masa - Espectrmetro

Espectrmetro de Masa
SAMPLE

ION SOURCE

MASS ANALYZER

DETECTOR

3 partes bsicas, alto vacio (no siempre)

DATA ANALYSIS

Muestra ionizacin- analizador de masa, separacin de acuerdo a su relacin m/z deteccin seal enviada a sistema de anlisis de datos (abundacia en funcin de m/z)

Generacin del Espectro de masa, % abundancia relativa vs. m/z

Espectrometria de Masa - Espectrmetro

Figure 1.2. Components of a mass spectrometer. Note that the ion source does not have to be within the vacuum of the mass spectrometer. For instance, ESI and APCI are at atmospheric pressure and are known as atmospheric pressure ionization (API) sources. http://masspec.scripps.edu/mshistory/whatisms_details.php#Basics

Espectrmetro de masas
Muestra

+ _

Fuente de ionizacion

Analizador de masas

Detector

Espectrmetros de masas
Generacin iones Separacion de iones Deteccin de iones

Mtodos de ionizacion Impacto electrnico Ionizacion Qumica MALDI Electrospray APCI

Anlizadores Espectro de masas de masas Anlisis en bases Cuadrupolo de datos Tiempo de vuelo Trampa de iones Orbitrap Ciclotrn En tandem QqQ / QTof / Tof-Tof / IT-Tof

Mtodos de Ionizacin
Impacto electrnico (EI - Hard method)
Moleculas pequeas, 1-1000 Daltons

Fast Atom Bombardment (FAB Semi-hard)

peptidos, azucares, hasta 6000 Daltons

Electrospray Ionization (ESI - Soft)

peptidos, proteinas, hasta 200,000 Daltons

Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI-Soft)

peptidos, proteinas, DNA, hasta 500 kD

Impacto Electrnico
Renombrado como ionizacin electrnica Calentamiento electrodo, produce e Energa electrn: = h/m Dualidad onda-prticula

Ionizacin electrnica

Ionizacin electrnica

Ionizacin electrnica
Aproximadamente UN in por cada 1000 molculas ( 70eV) 10 eV energa necesaria para ionizar una molcula. Exceso de energa ?? I = NpiV I = nmero de ines producidos N= constante, p= presin, i=corriente

Ionizacin electrnica

Ionizacin electrnica

Ionizacin electrnica