Universidad Arturo Prat Facultad Ciencias de la Salud Profesor: Javier Palacios Dez Laboratorio: extraccin ADN La extraccin de ADN

de una muestra celular se basa en el hecho de que los iones salinos son atrados hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolucin y posterior extraccin de la clula. Se empieza por lisar (romper) las clulas mediante un detergente, vacindose su contenido molecular en una disolucin tampn en la que se disuelve el ADN. En ese momento, el tampn contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares: ARN, carbohidratos, protenas y otras sustancias en menor proporcin. Las protenas asociadas al ADN, de gran longitud, se habrn fraccionado en cadenas ms pequeas, y separado de l por accin del detergente. Slo queda, por tanto, extraer el ADN de esa mezcla de tampn y detergente, para lo cual se utiliza alcohol isoamlico, probablemente el nico reactivo de esta prctica que no suele haber en una cocina. Reactivos y Materiales Muestra vegetal Agua (destilada) NaCl

Bicarbonato sdico Detergente lquido o champ Etanol a 0C

Parte experimental 1. Preparar el tampn con los siguientes ingredientes y mantener en frio con hielo: 120 mL de agua, si es posible destilada. 1,5 g de sal de NaCl. 5 g de bicarbonato sdico. 5 mL de detergente lquido. 2. Traer la muestra vegetal: un pltano. 3. Muela el pltano en un mortero. As se rompern muchas clulas y otras quedarn expuestas a la accin del detergente. 4. Mezclar en un vaso de matraz de elernmeyer 5 ml de la muestra vegetal con 10 ml del tampn y agitar intensamente durante al menos 2 minutos. Centrifugue (2.500 rpm durante 5 minutos); a continuacin extraiga el sobrenadante con ayuda de una pipeta Pasteur en un tubo de ensayo limpio. 5. Recoja al menos 5 mL de solucin en el tubo de ensayo limpio. A continuacin, aada 10 ml de etanol fro. Se debe dejar escurrir lentamente el alcohol por las paredes del tubo de ensayo inclinado. Si deja reposar el tubo de ensayo 2 minutos debera aparecer una mayor cantidad de ADN. 6. Mientras, encienda el mechero y fabrique un ganchito con la punta de la pipeta Pasteur (como si fuera un anzuelo). Con delicadeza, se introduce la punta de un capilar fino para extraer el fragmento de ADN. 7. Coloque el fragmento de ADN en un vidrio de reloj y agrguele una gota de solucin de azul de metileno.

PROCESO

FUNCIN

Preparacin del tampn (comn El tampn contiene una concentracin muy alta de iones que permite romper las para todos los grupos). membranas de las clulas y del ncleo (Se prepar con anterioridad) Preparcin biolgico. del material Al triturar las verduras lo que hacemos es romper las membranas de muchas clulas con lo que liberamos su contenido (orgnulos, ncleos, protenas, ADN, ARN ...)

Trituracin del material biolgico, mejor en fro. Mezcla del pur con el tampn Al mezclar el pur con el tampn conseguimos que se rompan las membranas de fro. las clulas y de los ncleos sin que se estropee el ADN que queremos obtener. Adems el champ que lleva el tampn ayuda a terminar de romper las membranas de los ncleos celulares en los que se encuentra el ADN y adems elimina protenas que se encuentran protegiendo el ADN. Centrifugacin 5. Con la centrifugacin se separan los materiales ms grandes, como clulas enteras, membranas, grandes orgnulos (se quedan en el fondo del tubo) de los materiales ms pequeos como protenas, pequeos orgnulos, ADN y ARN (que quedan en el lquido sobrenadante). Recoger el sobrenadante. Recoger la porcin en la que se encuentra el ADN (adems de otras sustancias como ARN, protenas y pequeos orgnulos). Aadir isopropanol fro. Hace que el ADN precipite en la interfase propanol-agua, mientras que el resto de materiales se quedan en el pur. Recoger el ADN con una varilla Recoger el ADN (tambin nos llevamos el ARN). de vidrio. En los laboratorios de biologa molecular se aadira una enzima que destruye el ARN de modo que slo obtuvisemos ADN. Aadir una gota de azul de El mtodo que hemos utilizado para extraer al ADN no es todo lo eficiente que metileno al tubo de ensayo. quisiramos, con lo que en la muestra todava queda ADN sin extraer. Al aadir el azul de metileno, en la interfase, se teirn las fibras de ADN que no hemos conseguido extraer.