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Revista Cientfica de la Universidad Autnoma de Coahuila

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIN DE MICROORGANISMOS HALFILOS DE SUELOS SALINOS DE CUATRO CINEGAS COAHUILA, MXICO
Liliana Castro Pia 1, Adriana Carolina Flores Gallegos1, Arturo Rodrguez Vidal1, Miguel ngel Aguilar Gonzlez2, Cristbal No Aguilar Gonzlez1, Ral Rodrguez Herrera1*
1

Departamento de Investigacin en Alimentos, Facultad de Ciencias Qumicas, Universidad Autnoma de Coahuila. Blvd. V. Carranza e Ing. Jos Crdenas V. s/n. Col. Repblica Ote. C.P. 25280. Saltillo, Coahuila, Mxico. Tel. +52(844)4161238, 4169213, Fax. 4390511. 2 Departamento de Microscopa Electrnica y Propiedades pticas de Materiales, en el Centro de Investigacin y de Estudios Avanzados del Instituto Politcnico Nacional, Unidad Saltillo, Ramos Arizpe, Coahuila, Mxico. * Autor para correspondencia: rrh961@hotmail.com

RESUMEN La regin de Cuatro Cinegas, Coahuila, se ha caracterizado poseer una amplia variabilidad gentica de microorganismos endmicos y por su alto nivel de salinidad. A partir del agua de sus pozas se han aislado diferentes microorganismos halfilos con potencial biotecnolgico. Sin embargo, los microorganismos presentes en los suelos salinos de dicha regin han sido poco estudiados. En el presente trabajo se estudiaron 8 distintas muestras de suelo del Valle de Cuatro Cinegas. Estas muestras de suelo se caracterizaron por su contenido de cloruro de sodio, humedad, materia orgnica y caractersticas texturales. Posteriormente, a partir de estas muestras de suelo se aislaron bacterias halfilas utilizando medios de cultivo con concentraciones altas de sales, adems se determinaron las caractersticas bioqumicas, morfolgicas y potencial biotecnolgico de las cepas aisladas. Los suelos de las localidades El Mezquite 1 y 2 presentaron el mayor contenido de cloruro de sodio. Los medios de cultivo caldo nutritivo modificado, agar nutritivo modificado y HALO permitieron el aislamiento de bacterias halfilas, sin mostrar crecimiento de levaduras u hongos. La morfologa bacteriana ms comn para los halfilos encontrados correspondi a bacilos y cocos. Las cepas aisladas en el presente estudio mostraron caractersticas metablicas similares a las reportadas para el gnero Halomonas, el cual ha demostrado una gran versatilidad para crecer en distintos rangos de temperatura y pH, por lo que se utiliza en la degradacin de materiales derivados de almidn. Con los resultados obtenidos en el presente trabajo, se puede establecer que las bacterias halfilas proveen oportunidades en el campo de la biotecnologa al constituir una fuente potencial de enzimas de inters industrial con destacables propiedades para bio-remediacin. Palabras clave: Cuatro Cinegas, suelos salinos, halfilos, enzimas. INTRODUCCIN La regin del valle de Cuatro Cinegas, ha sido declarada rea Nacional Protegida por el gobierno mexicano, un lugar internacional por RAMSAR y Patrimonio Mundial de Reservas de la Bisfera por la UNESCO (Stein et al., 2000; Hendrickson et al., 2008; Souza et al., 2008). Esta regin incluye pantanos, ros y ms de 300 lagos los cuales comparten una oligotrofia extrema y ms de 70 especies endmicas de microorganismos, plantas y animales (Minkley, 1984; Badino et al., 2004; Johnson, 2005; Carson y Dowling, 2006). Sorprendentemente, muchos de estos microorganismos se han encontrado por primera vez en este valle y la mayora de las especies presentan diferencias a nivel del ARNr 16S as como en sus funciones metablicas (Souza et al., 2006; Escalante et al., 2009; Cerritos et al., 2008; Desnues et al., 2008; Alcaraz et al., 2008). La elevada diversidad microbiana se debe a diversos factores ambientales, incluyendo la conservacin geolgica a travs de los aos (Taylor, 1966; Meyer, 1973; Minckley y Jackson, 2008; Szynkiewicza et al., 2009), la heterogeneidad del terreno y los cambios de temporal (Escalante et al., 2008) y, finalmente el conjunto de adaptaciones a las condiciones extremas de los lagos presentes (Souza et al., 2008). Dentro de este ltimo apartado esta la presencia de sal, especficamente cloruro de sodio (NaCl), el cual es uno de los factores que ha contribuido en esta diversidad microbiana. A pesar de que este compuesto es un inhibidor para el crecimiento de microorganismos, algunos de ellos han desarrollado diversos mecanismos de adaptacin. Los microorganismos halfilos evolucionaron bajo condiciones que imperaban en la tierra primitiva: alta temperatura, salinidad y atmsfera

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anaerobia. Se encuentran en los ambientes hipersalinos, son capaces de reproducirse y realizar sus funciones metablicas de una manera ms eficaz en presencia de altas concentraciones de sales; tienen la capacidad de balancear su presin osmtica en relacin con el medio y resistir los efectos nocivos de la sal (Meseguer, 2004). Los microoganismos que son capaces de crecer ptimamente en suelos que contienen del 15 al 25% de NaCl son considerados halfilos extremos, y como halfilos moderados aquellos que toleran desde un 3 hasta un 15% de NaCl (Grant et al., 1998). Dentro de los halfilos extremos se encuentra principalmente a los de la familia Halobacteriaceae, aunque otros microorganismos tambin han sido descritos (Antn et al., 2002). Los halfilos moderados son filogenticamente diversos, incluyendo una gran variedad de microorganismos: algunos metagenmicos y un gran nmero de bacterias Gram positivas y negativas (Ventosa et al., 1998). Los halfilos son de inters debido a sus potenciales aplicaciones industriales (Grant et al., 1998; Litchfield, 1998; Landis, 2001; Oren, 2002; Tehei et al., 2002). Se espera que las protenas producidas por estos microorganismos presenten caractersticas diferenciales de aquellas producidas por los organismos que habitan en ambientes no salinos, ya que las primeras deben mantener sus propiedades catalticas en altas concentraciones de sal. Las proteasas son un grupo de enzimas con aplicaciones importantes en muchos procesos industriales (Rao et al., 1998). Varias proteasas extracelulares se han identificado en halobacterias (Oren, 1994; Margesin y Schinner, 2001). Estas enzimas se caracterizan por ser dependientes de la alta concentracin de sal para su actividad y estabilidad (Ventosa y Nieto, 1995). Entre ellas, una serina proteasa de Natrialba magadii ha sido profundamente caracterizada (Gimnez et al., 2000). Adicionalmente, las halobacterias tienen la capacidad de producir bacteriorodopsina, bioplsticos y enzimas, as como de degradar productos txicos (Ventosa et al., 1998; Mellado y Ventosa, 2003). Por otro lado, la produccin de enzimas extracelulares por halfilos moderados no ha sido ampliamente investigada. Sin embargo, en los ltimos aos, se han hecho esfuerzos para explorar el potencial de este grupo verstil de bacterias halfilas. En este sentido, se han reportado una serie de enzimas extracelulares como proteasas, amilasas, DNasas, pululanasas y lipasas producidas por bacterias halfilas moderadas (Mellado et al., 2004). Las bacterias halfilas moderadas tambin poseen algunas aplicaciones industriales, como son la biodegradacin de residuos y la mejora de los procesos de extraccin de petrleo (Ventosa y Nieto, 1995; Ventosa et al., 1998; Margesin y Schinner, 2001). La mayora de las especies endmicas reportadas en Cuatro Cinegas estn asociadas a los hbitats acuticos en la cuenca y muy poco se ha estudiado la presencia de stas en los suelos de dicha regin. El objetivo del presente trabajo fue determinar las caractersticas edafolgicas de ocho suelos salinos del Valle de Cuatro Cinegas, as como aislar e identificar microorganismos halfilos y determinar su potencial biotecnolgico en la industria de los alimentos. MATERIALES Y MTODOS Sitios de muestreo y toma de muestra Para la seleccin de los sitios de muestreo se realiz una bsqueda cartogrfica del Estado de Coahuila apoyndose en las cartas edafolgicas del INEGI. De esta manera, se determinaron los sitios que estaban reportados con mayor presencia de sales en el Estado. Ocho regiones fueron seleccionadas, incluyendo: 1) Ranchera, San Buenaventura; 2) Acequia, Nadadores; 3) Huizachal, Nadadores; 4) Lamadrid, Lamadrid; 5) El Vergel, Lamadrid; 6) El Mezquite, Cuatro Cinegas; 7) El mezquite 2, Cuatro Cinegas; y 8) Las Playitas, Cuatro Cinagas. Cada uno de los ocho sitios muestreados se dividi en 10 cuadrantes con una superficie aproximada de 100m2 por cuadrante. La muestra se tom a una profundidad de 0-30 centmetros. Las muestras de cada sitio se mezclaron entre s, para obtener a partir de esta muestra homogenizada, una muestra representativa del sitio. Se realizaron dos colectas en distintas pocas del ao (marzo y octubre) en aquellos suelos en donde se encontr el mayor contenido de sales (Mezquite 1 y Mezquite 2), para determinar el efecto de las condiciones climatolgicas en el contenido microbiano. Textura de suelo Las muestras de suelo se dejaron secar en una manta a la luz solar por varios das hasta que no presentaran humedad. Despus, se tamiz el suelo pasndolo progresivamente por los tamices nmero 30, 60, 80, 100, 120, 170 y 200. Las fracciones obtenidas se pesaron para determinar la textura con base en el tringulo de textura.

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Determinacin de humedad Se prepararon charolas metlicas de papel aluminio y se llevaron a una estufa de secado a 100 C por 24 horas; transcurrido este lapso se pasaron a un desecador hasta alcanzar peso constante. Se colocaron 15 g de la muestra en la charola, mantenindola a 100 C durante 24 horas y se enfri en un desecador. Se calcul el contenido de humedad segn la siguiente frmula: % Humedad= ((Peso de muestra seca Peso de charola)/ (Peso de muestra fresca Peso de charola))*100 Determinacin de cloruro de sodio Se tomaron tres gramos de suelo de cada cuadrante y se colocaron en un tubo de ensayo de 20 x 200 previamente numerado. Se agregaron 1000 L de agua destilada y 1000 L de cromato de potasio (KCrO4). Despus, se agreg nitrato de plata (AgNO3) lentamente hasta que se present una coloracin rojiza, lo cual indic la presencia de NaCl. Para calcular la cantidad de cloruro de sodio de cada muestra se utiliz la siguiente frmula: NaCl= ([(Z ml AgNO3) * (0.005844 g NaCl)] / 1 mL AgNO3)/(Yg Na = [(X g NaCl) * (23 g Na)] / 58.5 g NaCl) Donde: Z equivale a los mL gastados de AgNO3 en la titulacin; X a los gramos de NaCl en la muestra; Y a los gramos de Na+ contenidos en la sal. Determinacin de materia orgnica Se colocaron 2.5 g de suelo en un matraz de 50 mL a los cuales se le agregaron 10 mL de dicromato de potasio (KCr2O4) 1N y se agit suavemente. Despus, se adicionaron 20 mL de cido sulfrico concentrado (H2SO4) y agua destilada hasta aforar, agitando nuevamente para obtener una mezcla homognea. De la misma manera se prepar un blanco al cual no se le adicion suelo. Una vez preparados los matraces, se tom la lectura en el espectrofotmetro a 460 nm. Los valores obtenidos de las lecturas se compararon con los de una grfica estndar para calcular el contenido de materia orgnica. Aislamiento de microorganismos Para el aislamiento de los microorganismos se prepararon 90 mL de buffer de fosfato al 1% y se le adicion 10 g de suelo. Despus, se prepararon dos medios lquidos (HALO y Caldo Nutritivo Modificado) y dos medios slidos (HALO con agar y Agar Nutritivo Modificado). Cuadro 1. Composicin de los medios empleados
Componente Citrato de sodio Tio-sulfato sdico Colato sdico Sacarosa Cloruro de sodio citrato de hierro Dihidrgeno fosfato potsico Sulfato de magnesio *Agar Medio HALO g/L 10 10 3 20 25 1 2 5 15

Componente Extracto de carne Extracto de levadura Peptona NaCl *Agar Medio nutritivo

g/L 1 2 5 5 15

Tanto el caldo nutritivo como el agar nutritivo se modificaron agregando a cada uno NaCl 2N, segn indica Meseguer (2004), con la finalidad de que los medios utilizados tuvieran la misma cantidad de sales utilizada para los microorganismos halfilos. Una vez preparados los medios de cultivo lquido, se colocaron 100 mL de cada uno en matraces de 250 mL, esterilizndolos a 121 C/15lb / 15 min. Se dejaron enfriar y se les adicion 1 mL de la solucin buffer de suelo; se incubaron a 37 C por 24,48, 72 y 96 h. En el caso de los medios slidos, se vaciaron a cajas Petri y una vez solidificado el medio, se le adicionaron 5 mL de solucin conteniendo el suelo y se incub en las condiciones ya descritas. Para determinar si los medios utilizados (HALO, Caldo nutritivo modificado, HALO con agar y Agar nutritivo modificado) eran los adecuados para el crecimiento de los microorganismos halfilos, se llev a cabo un anlisis no

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paramtrico, utilizando la prueba de Kruskal-Wallis. Arbitrariamente se seleccion el valor 1 para desarrollo de bacterias o levaduras y 2 para ausencia de crecimiento, dado que los datos generados eran cualitativos y no cuantitativos. Obtencin de cultivos puros, conservacin e identificacin de cepas Una vez desarrolladas las colonias en las cajas Petri, se registraron las caractersticas morfolgicas de las colonias y se prepararon frotis a fin de realizar observaciones microscpicas. Con el propsito de conservar los cultivos obtenidos puros, estos se colocaron en tubos de ensaye y se les agreg 3 mL de suero salino comercial al 0.9 %, se taparon los tubos de ensaye con tapa de rosca y se refrigeraron. Produccin de metabolitos y enzimas La capacidad enzimtica y/o produccin de algn metabolito por parte de los microorganismos, se evalu empleando diferentes medio de cultivo: 1) agar de hierro y lisina (LIA), 2) Movilidad-Indol-Ornitina (MIO), 3) Prueba del indol (SIM), 4) Agar de hierro y triple azcar (TSI), 5) Citrato de Simmons, 6) Urea, y 7) Agar de hierro de Kligler. Todos los medios se prepararon segn las indicaciones de los fabricantes y se esterilizaron a 121 C/ 15lb/ 15 min. Se inocularon por puncin con las colonias de los cultivos puros. Los medios se incubaron a 37 C por 24 a 72 h, observando cada 12 h. Adicionalmente, se determin la presencia de oxidasa con el reactivo de B. D. Oxidase Reagent Droppers y la prueba de produccin de catalasa. Microscopa electrnica de morfologa celular La morfologa celular de los microorganismos aislados fue observada por medio de fotografas tomadas con un microscopio electrnico de barrido. Para ello, los microorganismos se conservaron en suero de hidrxido de sodio y se almacenaron en refrigeracin. Las muestras refrigeradas se turnaron al Departamento de Microscopa Electrnica y Propiedades pticas de Materiales, del Centro de Investigacin y de Estudios Avanzados (CINVESTAV) del Instituto Politcnico Nacional, Unidad Saltillo, Ramos Arizpe, Coahuila, Mxico, en donde se realizaron tcnicas habituales de fijacin, deshidratacin, secado por punto crtico y recubrimiento en oro. Las fotografas de los microorganismos fueron tomadas con el microscopio electrnico de barrido Philips Ambiental Modelo XL30ESEM con sistema de espectrometra de energas dispersivas de rayos X (EDAX) modelo PEGASSUS de bajo vaco. Las muestras se recubrieron con oro electroltico en una evaporadora de vaco marca Jeol, Modelo JEE-400 bajo las siguientes condiciones: distancia de trabajo: 10 mm, energa en KeV: 20 KeV y detector GSE (electrones secundarios). Produccin potencial de enzimas de uso industrial Para determinar la capacidad de produccin de enzimas de uso industrial por parte de los microorganismos aislados del suelo, se prepar medio Czapek Dox modificado con las siguiente composicin (g/L): NaNO3 (7.65), KH2PO4 (3.04), MgSO4 (1.52), KCl (1.52), y fuente de carbono (almidn, cido tnico, carboximetilcelulosa, inulina, pectina, peptona y sacarosa) (30.0). Una vez preparado el medio de cultivo con su respectiva fuente de carbono, se distribuy en tubos de ensaye para su esterilizacin a 121 C/15lb / 15 min y se inocul con cada uno de los cultivos microbianos puros, posteriormente los tubos fueron incubados a 37 C durante 72 h. RESULTADOS Y DISCUSIN Con base en los porcentajes obtenidos de arena, limo y arcilla para cada uno de los suelos muestreados (Cuadro 2), se estableci que presentan una textura arenosa, a excepcin de la muestra de San Buenaventura, la cual presenta textura franco-arenosa. En lo que respecta a humedad, se observaron valores cercanos al 15% para El Mezquite y 10% para Las Playitas y Acequia. Estos datos pueden atribuirse a que anteriormente, El Mezquite era una poza de agua la cual con el tiempo fue secndose, reteniendo humedad en su interior, mientras Acequia y Las Playitas son zonas cercanas a estanques. El mayor contenido de cloruro de sodio se encontr en los suelos Mezquite 1 y 2 (18.2 y 17.1 % respectivamente) seguidos por Las Playitas (16.4 %). Esto se puede deber a que, antiguamente, las tres localidades fueron pozas de agua, que con el tiempo se secaron permitiendo la acumulacin de sales, principalmente de cloruro de sodio, lo que puede explicar el alto contenido de este compuesto en estos suelos en comparacin con los dems sitios muestreados. Estos suelos, por lo tanto, constituyen una fuente potencial de microorganismos halfilos. Los suelos restantes presentaron un contenido de cloruro de sodio inferior al 10 %.

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Por otra parte, los sitios con mayor contenido de materia orgnica fueron Lamadrid (3.73 %), San Buenaventura (3.63 %), la Acequia (3.57) y El Mezquite 2 (3.23 %). A pesar del bajo contenido de humedad presente en Lamadrid, su alto porcentaje de materia orgnica podra estar dado por la adaptacin de la vegetacin de la zona a las condiciones presentes en el suelo y la descomposicin de esta materia orgnica. Se sabe que la materia orgnica contribuye al crecimiento vegetal mediante sus efectos en las propiedades fsicas, qumicas y biolgicas del suelo. Adems, la materia orgnica reduce el impacto de la lluvia, y permite que el agua se filtre con suavidad en el suelo. Por lo tanto, reduce el escurrimiento superficial y aumentando el agua disponible para el desarrollo de la vegetacin, an en forma limitada en suelos arenosos), lo que impacta directamente en el tipo y concentracin de especies microbianas que habitan este tipo de suelos (Tamhane y Motiramani, 1970). Anlisis comparativo El Mezquite 1 fue uno de los tres sitios con mayor contenido de cloruro de sodio y de mayor porcentaje de humedad. Sin embargo, present baja cantidad de materia orgnica, posiblemente debido a que la alta salinidad no permite el crecimiento de plantas o de algunos organismos superiores. En contraste, El Mezquite 2 mostr una mayor concentracin de cloruro de sodio y se encuentra entre los tres sitios con ms alto porcentaje de materia orgnica, aunque en por ciento de humedad ocupa el ltimo lugar. Posiblemente las plantas presentes en esta rea se han adaptado a los medios salinos para la supervivencia, influyendo positivamente en el contenido de materia orgnica. Por otra parte, en esta regin los niveles de evaporacin de agua podran ser mayores, disminuyendo as el contenido de humedad y favoreciendo un alto contenido de cloruro de sodio. En contraste, no se observaron diferencias significativas en el muestreo 1 y 2 de los suelos Mezquite, por lo que la temporada del ao resulta indistinta para el aislamiento de microorganismos halofilos. Cuadro 2. Caractersticas de los ocho suelos muestreados en la zona Valle de Cuatro Cinegas. Localidad San Buenaventura

Caracterstica

El Mezquite 1

El Mezquite 2

Textura Humedad (%) Materia orgnica (%) NaCl (g)

Arena franca 2.94 3.63 8.40-4

Arena 9.55 3.57 6.89-4

Arena 1.47 2.90 6.89-4

Arena 2.57 3.73 6.65-4

Arena 2.21 2.73 5.95-4

Arena 15.08 2.00 17.1-4

Arena 0.64 3.23 18.2-4

Arena 9.99 2.47 16.4-4

Cuadro 3. Caractersticas fisco-qumicas del suelo colectado en dos fechas diferentes en dos localidades El Mezquite 1 y El Mezquite 2. Caracterstica Cloruro de sodio (g) Humedad (%) Materia orgnica (%) Textura El Mezquite 1 M1 17.1-4 15.08 2.00 Arena M2 18.7-4 11.39 2.4 Arena El Mezquite 2 M1 18.2-4 0.64 3.23 Arena M2 18.3-4 14.05 3.00 Arena

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Las Playitas

Huizachal

Lamadrid

El vergel

Acequia

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Aislamiento de microorganismos Empleando caldo nutritivo modificado, agar nutritivo modificado y HALO se logr observar crecimiento bacteriano a los distintos tiempos de incubacin. El anlisis no paramtrico (Kruskal-Wallis) mostr diferencias significativas en el crecimiento en agar nutritivo modificado y los medios HALO, HALO-agar y caldo nutritivo modificado, lo que indica que los nutrimentos presentes en el primero de estos medios, satisface de una mejor manera los requerimientos nutrimentales de los microorganismos aislados.

Figura 1. Morfologa de las colonias en agar nutritivo modificado. En el Cuadro 4, se puede observar la caracterizacin bioqumica de cada una de las 12 colonias aisladas, todos los microorganismos aislados fueron Gram positivas y la mayora present morfologa de coco (Figura 2). Antn et al. (2002) han descrito microorganismos extremfilos que toleran la sal a concentraciones elevadas, representados fundamentalmente por arqueas aerobias halfilas extremas y la bacteria Salinibacter, que predomina en ambientes con salinidades superiores a 3 N, con caractersticas morfolgicas semejantes a las encontradas en este estudio. Adems, los microorganismos halfilos han intervenido tradicionalmente en los procesos de produccin de sal. As, los cristales de sal comn que se forman en las salinas en la fase de saturacin suele contener gran cantidad de microorganismos halfilos viables (Oren, 2002). Ninguna de las cepas aisladas en el presente estudio present la capacidad de hidrolizar la urea ni tuvo una respuesta positiva a la prueba de la catalasa, comportamiento similar al reportado por Romano et al. (2007). Cinco de las bacterias aisladas mostraron un resultado positivo para la produccin de la enzima lisina descarboxilasa (2, 9, 10, 26 y 27). Algunas de las cepas evaluadas mostraron una respuesta positiva para movilidad, produccin de indol y ornitina. (16, 26 y 27). Al igual que algunas cepas del gnero Halomonas (H. elongata, H. halmophila y H. salina), la cepa 16 fue capaz de producir cido a partir de lactosa, glucosa y sacarosa (Cuadro 5). Finalmente, la mayora de las cepas evaluadas mostraron respuesta negativa a la prueba de oxidasa, comportamiento reportado para Halomonas sinaiensis (Romano et al., 2007).

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Cuadro 4. Caractersticas bioqumicas y morfolgicas de las bacterias halfilas de suelos salinos.

Colonia 2 7 9 10 11 12 13 14 15 16 26 27 Gram + + + + + + + + + + + + Morfologa Bacilos esporulados Diplococos Cocos Bacilos en media luna Bacilos en cadena Cocos Triplococos Triplococos Bacilos cortos Bacilos Cocos Cocos MIO + + + LIA + + + + + TSI + Kliger + SIM + + Citrato + Urea Catalasa Oxidasa + + -

Cuadro 5. Caractersticas diferenciales de especies del gnero Halomonas

Caracterstica Morfologa celular Rango NaCl (% p/v) Oxidasa Hidrlisis de urea Produccin de cido a partir de: Glucosa Lactosa Sacarosa H. elongata H. eurihalina H almeriensis H. halmophila H. salina H. halophila

Bacilos largos 0-25 +

Bacilos cortos 3.5-25 +

Bacilos cortos 5-25 -

Bacilo 3-35 + -

Bacilos cortos 2-20 + +

Bacilo 2-30 + +

+ + +

+ + +

+ -

Arahal et al. (2002), Mata et al. (2002), Garrity et al. (2005), Lim et al. (2005), Martnez-Checa et al. (2005) y Vreeland (2005)

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Figura 2. Morfologa de las colonias mediante microscopio electrnico de barrido. a) colonia 7 (2 m), b) colonia 10 (5 m), c) colonia 2 (2 m), d) colonia 11 (5 m), e) colonia (5 m) y f) colonia 9 (2 m).

La morfologa irregular, parecida a crculos ondulados, y la respuesta Gram de la colonia 7 (Figura 2a) es semejante a la de Halococcus morrhua, la cual puede presentarse en forma de coco, con dimetro de 0.8 y 2 m, o en forma de bacilo con 0.3 y 1.2 m de ancho y de 1 a 15 m de largo. Puede ser mvil (flagelos polares) o inmvil. Los bacilos son generalmente Gram negativo, mientras que los cocos pueden ser tanto Gram positivo como negativo. Se presentan en forma simple, pares, ttradas o racimos retrctiles irregulares. Halococcus morrhuae requiere de al menos 1.5 M de NaCl para crecer aunque su requerimiento ptimo es entre 2 y 4 N de NaCl. Esto ocurre de manera natural cuando las concentraciones de sal en el medio son altas, como en lagos salados, salinas, mares o suelos salinos (Holt et al., 2004). Codina (2004) encontr bacterias cuadradas, parecidas a la colonia 10 (Figura 2b) aislada del suelo del Valle de Cuatro Cinegas. La bacteria Haloquadratum walsbyi, descrita por este investigador, es de forma cuadrada y delgada, y vive en ambientes con elevadas concentraciones de sales. En lo que respecta a la colonia 11 (Figura 2c), se observaron bastones unicelulares o bacilos Gram positivos. En estos microorganismos la divisin celular ocurre siempre por el plano ecuatorial, que forma un ngulo recto con el eje mayor de la clula. Las Halobacterias son clulas bastoniformes de aspecto similar a Escherichia coli. Su crecimiento ocurre en aguas muy saladas. Son aerobias y, por tanto, cuando disponen de sustratos apropiados y suficiente oxgeno, oxidan molculas orgnicas produciendo ATP por fosforilacin oxidativa (Grant et al., 1998). Las bacterias de la colonia 9 (Figura 2d) son unicelulares esfricas (o cocos) y aparentemente se dividen por un solo plano. Este modo de divisin celular da origen con frecuencia a la formacin de cadenas cortas de clulas cocoides. Algunas bacterias con clulas esfricas se dividen regularmente por dos o tres planos sucesivos que forman ngulos rectos entre s, dando lugar as a ttradas o a paquetes cbicos de clulas. De algunas especies halfilas se conoce su genoma completo como, por ejemplo, Halobacterium salinarum la cual fue la primera aislada de medios salinos. Sin embargo, se conocen otros microorganismos halfilos con estructuras en formas de bacilos, cocos, unos rectangulares muy alargados pero no se conocen el nombre de ellos todava. (Meseguer, 2004) Produccin potencial de enzimas de uso industrial Las bacterias aisladas y cultivada en medio Czapek con diferentes fuentes de carbono no presentaron crecimiento, lo cual indica que las bacterias encontradas no degradan ninguna de las fuentes de carbono utilizadas (amilasa, tanasa, carboxilmetilcelulosa, etc.) posiblemente debido a que las concentraciones de sal presentes en el medio Czapeck modificado no corresponden a las empleadas para su aislamiento, o bien porque no poseen la maquinaria enzimtica para degradar estas fuentes de carbono.

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CONCLUSIONES Con base en los resultados obtenidos en el presente estudio, podemos concluir que los suelos El Mezquite 1 y 2 presentan el mayor contenido de cloruro de sodio, y por lo tanto, un hbitat adecuado para lograr el aislamiento de microorganismos halfilos moderados. Los medios de cultivo caldo nutritivo modificado, agar nutritivo modificado y HALO permitieron el aislamiento de bacterias halfilas, sin mostrar crecimiento de levaduras u hongos. La morfologa bacteriana ms comn para los halfilos encontrados correspondi a bacilos y cocos, las cuales han sido reportadas anteriormente por diversos autores para halfilos. Finalmente, las caractersticas metablicas de las cepas evaluadas fueron similares a las reportadas para halfilas moderadas del gnero Halomonas, el cual es empleado en la degradacin de materiales derivados de almidn, por lo que las cepas aisladas en el presente estudio podran ser usadas con fines de biorremediacin.

BIBLIOGRAFA
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